劉曉金　李允江　張曉明　徐田芹　李婭寧

摘 要：目前，心血管疾病嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，具有發(fā)病急、病死率高、復(fù)發(fā)率高等特點。斑馬魚因具有體積小、易飼養(yǎng)、繁殖快、胚胎透明、性成熟周期短、遺傳基因與人類遺傳基因高度相似等特點已被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究的各項前沿領(lǐng)域。近年來基于斑馬魚進(jìn)行的降血脂、抗動脈粥樣硬化、保護(hù)心臟、抗血栓、抗炎等研究，闡述了斑馬魚在治療心血管疾病方面的藥物篩選和應(yīng)用價值，可為治療心血管疾病藥物的開發(fā)提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：斑馬魚；心血管疾?。凰幬锖Y選

中圖分類號：R285

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Research progress of cardiovascular diseases based on zebrafish

LIU Xiaojin LI Yunjiang ZHANG Xiaoming XU Tianqin LI Yaning

（1. School of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China;

2. Department of Pharmacy， Shandong Medical College， Linyi 276000， China;

3. Pharmacy Department， Pingyi County Hospital of Traditional Chinese Medicine， Linyi 273300， China）

Abstract： At present， cardiovascular disease is a serious threat to human life and health， with the characteristics of rapid onset， high mortality and high recurrence rate. Zebrafish has been widely used in various frontiers of scientific and technological researches because of its small size， easy breeding， fast reproduction， transparent embryos， short sexual maturity cycle， and high similarity of genetic genes to human genetic genes. During recent years， the studies of zebrafish model on hypolipidemic， anti-atherosclerosis， heart protection， anti-thrombosis， anti-inflammation， etc， explained the drug screening and application value of zebrafish in the treatment of cardiovascular diseases， which provided a certain reference for the development of drugs to treat cardiovascular diseases.

Key words： zebrafish； cardiovascular disease； drug screening

心血管系統(tǒng)疾病是與循環(huán)系統(tǒng)有關(guān)的一系列疾病，種類繁多、發(fā)病誘因復(fù)雜，是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，是對人類健康危害最大的疾病之一，給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。積極探索關(guān)于治療心血管疾病的有效藥物是降低發(fā)病率和病死率的最有效方式。

斑馬魚俗稱“花條魚”“藍(lán)條魚”等，是熱帶淡水硬骨魚，其基因與人類基因的同源性較高，轉(zhuǎn)基因資源豐富，科學(xué)研究品種眾多。斑馬魚為卵生魚類，易飼養(yǎng)，對水質(zhì)要求不高，適宜水溫為25 ℃左右，4個月大進(jìn)入性成熟期，繁殖周期約為7 d，一對親魚每周可以產(chǎn)生約300枚受精卵，24 h內(nèi)即可形成胚胎。斑馬魚胚胎透明，在96孔板中用顯微鏡可觀察到其整個發(fā)育周期。

與傳統(tǒng)實驗哺乳動物相比，斑馬魚具有體型小、易飼養(yǎng)、性成熟周期短、繁殖能力強、體外受精發(fā)育、胚胎透明且培育周期短、遺傳背景清楚、測試成本低等特點，實驗操作便捷、高效[1]。斑馬魚作為一種脊椎動物的生物模型，與人類基因有87%的同源性[2]，某些疾病相關(guān)基因與人類基因的保守性高達(dá)99%，可以模擬人體的代謝過程，有助于體外實驗結(jié)果與體內(nèi)實驗結(jié)果的結(jié)合，提高科學(xué)研究的效率和可信度。早在2003年，美國國立衛(wèi)生研究院就將斑馬魚列為僅次于大鼠和小鼠的重要的實驗生物，為無脊椎動物和小型哺乳動物提供了橋梁，被廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)、藥理學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥物研發(fā)及環(huán)境研究等多項研究領(lǐng)域（圖1），成為目前科學(xué)研究的熱門脊椎生物模型。

1 斑馬魚心血管系統(tǒng)的生長發(fā)育

斑馬魚胚胎透明適合在細(xì)胞水平上研究心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制。斑馬魚受精5 h后，心前細(xì)胞開始發(fā)育形成原腸，然后再形成外胚層、內(nèi)胚層和中胚層；受精17 h出現(xiàn)心肌融合；受精22 h 2個心臟在胚胎中線處融合，形成了一個心錐向前延伸成一條直線心管；受精28 h線性心臟管在動脈極繼續(xù)進(jìn)行心源性分化形成心房和心室；受精36 h出現(xiàn)心臟循環(huán)；受精48 h后房室瓣和動脈瓣膜形成，心臟發(fā)育完成[3]（圖2）。斑馬魚和哺乳動物在心臟形成的遺傳因素上有很高的相似性，其動作電位、心電圖和血管結(jié)構(gòu)與人類相似，因此斑馬魚可以進(jìn)行活體實時監(jiān)測心律和血壓[4]。

2 基于斑馬魚模型的心血管藥物研究

2.1 降血脂

血脂異常給心血管疾病帶來了極大的風(fēng)險，導(dǎo)致多種疾病的產(chǎn)生?；诎唏R魚模型研究，以降低膽固醇和甘油三酯為指標(biāo)對于研究開發(fā)有效的降血脂藥物具有重要意義。

韓冰[5]和陳彪[6]采用斑馬魚高血脂模型，分別研究發(fā)現(xiàn)黃連中小檗胺和黃連堿通過調(diào)節(jié)膽固醇代謝具有良好的降血脂作用，對黃連的進(jìn)一步研究開發(fā)提供了參考價值。LI等[7]采用UPLC-MS和HPLC分析，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1在發(fā)酵過程中的潛在途徑為Rb1→Rd→F2→CK和Rb1→Rd→Rg3，可顯著降低血漿總膽固醇和甘油三酯水平，證明野生冬蟲夏草具有制備降血脂人參皂苷的潛力?？Х榷喾涌赏ㄟ^降低斑馬魚肝臟膽固醇和脂蛋白的合成，上調(diào)膽汁酸的合成，抑制斑馬魚血漿、肝臟和血管系統(tǒng)中膽固醇的積累，有助于防治人類高膽固醇血癥[8]。刺芹側(cè)耳菌絲體固體發(fā)酵多糖能顯著抑制高脂飼料誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚和成年斑馬魚肝臟與腸道組織中的脂質(zhì)積累，達(dá)到降血脂的目的[9]。以上研究表明，基于高血脂斑馬魚模型探究藥物降血脂的機制，篩選出降血脂的主要成分，為進(jìn)一步研究降血脂藥物提供了參考價值。

2.2 抗動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化是引起冠心病、腦梗死、外周血管病等多種嚴(yán)重心血管疾病的主要原因，可導(dǎo)致動脈供血的組織或器官缺血或壞死。動脈粥樣硬化發(fā)病機制復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果。斑馬魚抗動脈粥樣硬化模型由高膽固醇飲食和脂多糖誘導(dǎo)，表現(xiàn)出一些與人類動脈粥樣硬化相似的早期癥狀（膽固醇積累、血管炎癥、脂質(zhì)代謝紊亂和氧化應(yīng)激等），而且還在血管內(nèi)形成斑塊[10]。因此，可以利用斑馬魚建立一種可靠、低成本、高通量篩選抗動脈粥樣硬化藥物的動物模型。

LIU等[11]采用斑馬魚模型，研究發(fā)現(xiàn)天麻中天麻素、豆甾醇、對羥基芐醇、檸檬酸等10種化合物能夠刺激血管生成，有利于缺血性心血管疾病和動脈粥樣硬化的治療。YANG等[12]以化學(xué)誘導(dǎo)的斑馬魚幼蟲的血管功能不全和心肌梗死為模型，對三七花中提取的皂苷進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞遷移實驗，結(jié)果表明，三七花可以促進(jìn)血管生成，改善急性心肌梗死。由紅曲精制成的血脂康，在斑馬魚高脂血管內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞模型中，可通過降低血脂和抑制中性粒細(xì)胞在血管中的募集來預(yù)防動脈粥樣硬化[13]。迷迭香酸可能通過降血脂、抗氧化、抗炎和改善低剪切力誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，具有很好的抗動脈粥樣硬化的作用[14]。吲哚-3-甲醇可能通過增強抗氧化作用和PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)自噬，使高膽固醇飲食斑馬魚的血管壁脂質(zhì)沉積水平顯著降低，為以吲哚-3-甲醇開發(fā)一種防治動脈粥樣硬化的藥物研究提供了參考價值[15]。

2.3 保護(hù)心臟

斑馬魚作為低等的脊椎動物，在心臟發(fā)育、心臟結(jié)構(gòu)和生理方面與其他脊椎動物相似[16]。斑馬魚發(fā)育早期階段，其胚胎透明，心臟和血液循環(huán)清晰可見，斑馬魚的心臟功能和形態(tài)均可以通過顯微鏡進(jìn)行定量分析[17]。因此，斑馬魚模型可以更好地用于生物體的心臟研究，有利于藥物篩選。

黃芪中黃芪甲苷IV對烏頭堿所致的斑馬魚心律失常有拮抗作用，能改善斑馬魚心臟結(jié)構(gòu)損傷，具有心臟保護(hù)作用[18]。西洋參70%乙醇提取物能改善特非那定所致斑馬魚心臟損傷的心率和SV-BA間距，對修復(fù)心臟損傷具有一定的作用[19]。在特非那定誘導(dǎo)的斑馬魚心肌病模型中[20]，通過使用腦心通治療后可以顯著恢復(fù)由心功能不全引起的心血管畸形，表明腦心通可以通過HEG1-CCM信號恢復(fù)斑馬魚的心肌損傷和心功能不全，其中芍藥苷和丹酚酸B被認(rèn)為是具有心肌保護(hù)作用的主要生物活性成分。白藜蘆醇對酒精引起的斑馬魚胚胎形態(tài)和功能異常（包括體長縮短、心包水腫和心動過速等）具有保護(hù)作用，還會改變一些心臟相關(guān)基因的表達(dá)，例如bmpr2b、hand2和tbx5a等[21]。此外，白藜蘆醇還可以通過抑制氧化應(yīng)激來防止PM2.5誘導(dǎo)的心臟畸形，抵消PM2.5中的可提取有機物誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎心臟中ROS產(chǎn)生、DNA損傷和細(xì)胞凋亡[22]。斑馬魚模型有利于心臟損傷機制的研究，為進(jìn)一步開發(fā)心臟保護(hù)藥物提供了方向。

2.4 抗血栓

血栓是一種較常見的心血管系統(tǒng)疾病嚴(yán)重威脅人類的生命健康，往往是外界因素和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。斑馬魚的血小板與人類的血小板高度類似[23]，由于斑馬魚胚胎透明可在顯微鏡下動態(tài)觀察斑馬魚體內(nèi)動脈或靜脈血栓的形成，實驗干擾小，斑馬魚的血栓模型穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，常被應(yīng)用于抗血栓藥物的研究。

研究表明，三棱80%乙醇提取物中乙酸乙酯提取部分的主要化學(xué)成分包括對羥基苯甲酸、5-羥甲基糠醛、對甲氧基苯甲醛、對羥基苯甲醛、對香豆酸、阿魏酸、香草酸、原兒茶酸、香蘭素、Methyl-3，6-dihydroxy-2-[2-（2-hydroxyphenyl）-ethynyl]benzoate及1，3-O-二阿魏酰基甘油，對斑馬魚血栓模型具有顯著的抗血栓作用[24]。利用斑馬魚血栓模型研究發(fā)現(xiàn)，通脈增加了血栓斑馬魚心臟血流量，減少外周紅細(xì)胞聚集并恢復(fù)外周血小板循環(huán)，降低血栓魚體內(nèi)的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化水平，降低凝血因子II（凝血酶）和下游纖維蛋白原的表達(dá)，從而達(dá)到內(nèi)源性抗血栓作用，其中隱丹參酮為抗血栓的主要活性成分[25]。以鹽酸腎上腺素誘導(dǎo)建立斑馬魚血栓模型，篩選出9味具有顯著預(yù)防和治療血栓的中藥，包括川芎、郁金、延胡索、丹參、紅花、虎杖、三棱、莪術(shù)、水蛭，為活血化瘀中藥的篩選提供了參考依據(jù)[26]。通過比較白芍不同部位、主要成分及主要代謝產(chǎn)物，研究表明，芍藥苷代謝素-I具有顯著的促血管生成和抗血栓的作用[27]。另外，經(jīng)研究證實，丹參-紅花[28]和葛根[29]等均具有較好的抗血栓作用，為進(jìn)一步抗血栓藥物的研究提供了研究方向和參考價值。

2.5 抗炎

炎癥的研究在分子和細(xì)胞水平上難以完成，主要依賴于體外試驗研究。斑馬魚胚胎在發(fā)育早期是透明的，受精48 h后可以觀察到中性粒細(xì)胞，斑馬魚的先天免疫系統(tǒng)在受精后4周才能形成，因此斑馬魚抗炎模型可以作為抗炎藥物的篩選。此外，斑馬魚還可以評估水腫形成、滲出液中炎癥細(xì)胞的積累、介質(zhì)、信號通路、基因表達(dá)和特定蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，在研究炎癥反應(yīng)及其病理、生理學(xué)方面具有多功能性[30]。

基于斑馬魚構(gòu)建炎癥模型用以評價西洋參樣本的抗炎活性，結(jié)果表明人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg4、3-O-甲基沒食子酸、齊墩果酸、鐮葉芹二醇是西洋參發(fā)揮抗炎作用的主要藥效物質(zhì)[31]。連翹苷A和連翹苷B可以導(dǎo)致ROS和NO的減少，以及由CuSO4誘導(dǎo)的各種代謝物、蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的改變，從而減少炎癥，具有神經(jīng)保護(hù)的特性，對CuSO4誘導(dǎo)的斑馬魚炎癥具有顯著的抑制作用[32]。采用LPS誘導(dǎo)的斑馬魚炎癥模型，發(fā)現(xiàn)蟲草素可以顯著抑制TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)和尾鰭損傷模型中的中性粒細(xì)胞遷移，結(jié)果表明蟲草素在抑制LPS和損傷性炎癥中具有重要作用[33]。LI等[34]采用DSS誘導(dǎo)的斑馬魚炎癥性腸病模型來研究菊花莖葉提取物的抗炎和抗氧化作用，結(jié)果表明菊花莖葉提取物中的類黃酮、酚酸和多糖可通過調(diào)節(jié)IL-1β、IL-8和MMP9的表達(dá)來改善斑馬魚炎癥性腸病。

2.6 其他

基于斑馬魚的優(yōu)勢和特點，可以利用斑馬魚建立糖尿病或高血糖模型有利于研究糖尿病微血管并發(fā)癥[35]。肉蓯蓉提取物對斑馬魚的中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用[36]。丹參酮-IIA的咪唑生物堿類似物可能通過誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生和激活DNA損傷有效阻斷體內(nèi)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[37]。

3 小結(jié)與展望

斑馬魚作為研究開發(fā)心血管疾病治療藥物的生物模型，其基因與人類基因的相似程度較高，體外受精繁殖能力強、飼養(yǎng)成本低、胚胎透明易于觀察、實驗結(jié)果重現(xiàn)性好、實驗預(yù)測性好。這些特點能夠更好地補充完善一些哺乳動物試驗?zāi)Ｐ偷牟蛔悖瑥浹a體外試驗與哺乳動物試驗之間所產(chǎn)生的巨大生物學(xué)差異，從而使實驗操作便捷、高效、可信度高。但是，某些藥物的作用機制不明確、斑馬魚相對較小的血管直徑與人體血管之間的關(guān)系尚不清楚、研究中藥物劑量與人類臨床使用劑量的換算存在差異、疾病發(fā)展的復(fù)雜性以及斑馬魚在生長發(fā)育過程中存在被忽略的潛在病理性過程等一系列問題仍需進(jìn)一步地研究和探討。總的來說，隨著科學(xué)研究的深入，斑馬魚被用作研究心血管疾病發(fā)病機制、分析心血管疾病的病理過程和篩選疾病治療藥物等方面的生物模型具有廣闊的前景，再結(jié)合斑馬魚的體內(nèi)試驗與體外實驗結(jié)果，將為治療心血管疾病藥物的研發(fā)取得進(jìn)一步的突破提供基礎(chǔ)。

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