鄧小杰?王甜?徐芬?梁華

【摘要】目的 探討間歇性禁食對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠白色脂肪組織線粒體功能和炎癥狀態(tài)的影響以及沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（SIRT1）在其中的作用。方法 將5～6周齡雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為普通自由飲食組（CD組）、高脂自由飲食組（HFD組）和高脂間歇性禁食組（HFD-IF組，隔日禁食24 h），每組各5只，喂養(yǎng)12周。用HE染色觀察各組小鼠白色脂肪組織情況，并檢測(cè)白色脂肪SIRT1、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）、叉頭轉(zhuǎn)錄因子1（FOXO1）、線粒體功能和炎癥相關(guān)基因的表達(dá)情況。在小鼠尾靜脈注射腺相關(guān)病毒（AAV）-shSirt1敲減SIRT1表達(dá)，分別給予小鼠高脂自由飲食和高脂間歇性禁食，檢測(cè)上述指標(biāo)。結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示HFD-IF組脂肪細(xì)胞體積減小。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示高脂自由飲食時(shí)脂肪組織SIRT1、p-AMPK、 FOXO1蛋白表達(dá)均下調(diào)，間歇性禁食后均上調(diào)（P均< 0.05）。定量PCR結(jié)果顯示HFD組線粒體功能基因Tfam、Nrf1、Pgc-1a表達(dá)下調(diào)（P均< 0.001），炎癥基因TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白1、生長(zhǎng)因子樣模體黏液樣激素樣受體表達(dá)均上調(diào)（P均< 0.01），間歇性禁食后線粒體功能相關(guān)基因均上調(diào)（P均< 0.05），炎癥相關(guān)基因均下調(diào)（P均< 0.05）。敲減SIRT1后，HFD-IF組的上述指標(biāo)上調(diào)或下降的趨勢(shì)均有所減弱甚至消失（P均< 0.05）。結(jié)論 SIRT1通過(guò)改善小鼠內(nèi)臟白色脂肪組織線粒體功能和炎癥狀態(tài)從而介導(dǎo)間歇性禁食改善高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)的肥胖。

【關(guān)鍵詞】間歇性禁食； 沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1；高脂飲食；白色脂肪

SIRT1-mediated intermittent fasting improves adipose tissue mitochondrial function and inflammation in high-fat diet-induced obese mice Deng Xiaojie△， Wang Tian， Xu Fen， Liang Hua.△Department of Endocrinology and Metabolism， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China

Corresponding author， Liang Hua， E-mail： lianghua@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】Objective To investigate the role of SIRT1 in the effect of intermittent fasting on mitochondrial function and inflammation in white adipose tissue（WAT） of obese mice induced by high-fat diet. Methods Male C57BL/6 mice aged 5-6 weeks were randomly divided into the control diet （CD） group （n = 5）， high‐fat diet （HFD） group （n = 5） and high-fat diet intermittent fasting （HFD-IF， alternate-day fasting 24 h） group （n = 5） and fed for 12 weeks. The pathological changes of WAT were observed by HE staining. The expression levels of SIRT1， p-AMPK， FOXO1 and mitochondrial function， inflammation-related genes in WAT of each group were detected. AAV-shSirt1 virus was delivered by tail-vein injection into mice to knockdown SIRT1. HFD and HFD-IF were given. The parameters above were determined. Results HE staining indicated that the adipose cell volume was decreased in the HFD-IF group. Western blot showed that the expression levels of SIRT1， p-AMPK and FOXO1 in adipose tissues were significantly down-regulated in the HFD mice （all P < 0.05）， which were significantly up-regulated after intermittent fasting （all P < 0.05）.? qPCR revealed that the expression levels of mitochondrial functional genes， including Tfam， Nrf1 and Pgc-1a were dramatically down-regulated in the HFD group （all P < 0.001）， whereas those of inflammatory markers， such as TNF-α，MCP-1 and F4/80， was significantly up-regulated （all P < 0.01）. After intermittent fasting， the expression levels of genes related to mitochondrial function were up-regulated （all P < 0.05）， whereas those of inflammatory markers were down-regulated （all P < 0.05）. After knockdown of SIRT1， the trend of up-regulating or down-regulating the expression levels of these parameters was weakened or even absent in the HFD-IF group （all P < 0.05）. Conclusion SIRT1 mediates intermittent fasting in improving high-fat diet-induced obesity via ameliorating adipose tissue mitochondrial function and inflammation.

【Key words】 Intermittent fasting； SIRT1； High-fat diet； White adipose tissue

肥胖是全球重大的公共健康問(wèn)題［1］。肥胖改變?nèi)泶x并導(dǎo)致胰島素抵抗，其機(jī)制涉及脂肪組織的線粒體功能損傷和炎癥［2］。間歇性禁食（IF）是指在特定時(shí)間段內(nèi)限定熱量攝入的一種飲食管理手段［3］。研究表明，IF可以作為一種有效的行為干預(yù)方式來(lái)減少包括肥胖在內(nèi)的代謝性疾病的負(fù)擔(dān)及延長(zhǎng)壽命，但具體機(jī)制尚未完全明確［4］。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（SIRT1）是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的去乙酰化酶，表達(dá)受能量狀態(tài)調(diào)節(jié)，NAD+高表達(dá)可改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和胰島素抵抗形成，并改善脂肪組織和肝臟的線粒體功能，減輕氧化應(yīng)激和炎癥程度［5-10］。因此推測(cè)，SIRT1在IF改善肥胖中可能發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)構(gòu)建隔日禁食的間歇性高脂飲食小鼠模型、利用尾靜脈注射腺相關(guān)病毒（AAV）敲減SIRT1等手段，探討IF對(duì)高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織線粒體功能、炎癥通路的影響以及SIRT1在其中的介導(dǎo)作用，為揭示SIRT1在IF調(diào)控機(jī)體代謝平衡中的作用提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、動(dòng)物模型的建立及IF方案

5～6周齡雄性C57/BL6小鼠35只，體重18～22 g，購(gòu)至江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。動(dòng)物飼養(yǎng)于中山大學(xué)SPF級(jí)環(huán)境中，控制溫度、濕度，進(jìn)行12 h光-暗循環(huán)。小鼠經(jīng)過(guò)1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，將15只小鼠根據(jù)空腹血糖和體重隨機(jī)分為普通自由飲食組（CD組，n = 5）、高脂自由飲食組（HFD組，n = 5）和高脂IF組（HFD-IF組，n = 5），HFD-IF組采取隔日禁食24 h、自由飲水，喂養(yǎng)12周。第2批小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將16只小鼠隨機(jī)分為HFD組和HFD-IF組，干預(yù)4周后，通過(guò)尾靜脈分別注射腺相關(guān)敲減SIRT1病毒和腺相關(guān)對(duì)照病毒，分別設(shè)為高脂自由飲食對(duì)照組（shCtrl-HFD組，n = 4）、高脂自由飲食敲減組（shSirt1-HFD組，n = 4）、高脂IF對(duì)照組（shCtrl-HFD-IF組，n = 4）、高脂IF敲減組（shSirt1-HFD-IF組，n = 4），繼續(xù)喂養(yǎng)8周。所有小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用異氟烷麻醉后摘除眼球取血，采用頸椎脫臼法將其處死，留取小鼠附睪旁脂肪組織，切取部分組織置于4%多聚甲醛固定，將其余組織儲(chǔ)存于-80℃冰箱。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（批件號(hào)：SYSU-IACUC-2021-000374）。

二、實(shí)驗(yàn)試劑和材料

1.主要試劑

高脂飼料（貨號(hào)D12492）購(gòu)自Research Diets公司（美國(guó)）；AAV-shRNA-Sirt1和AAV-shRNA-Control購(gòu)自廣州東澤生物科技有限公司（中國(guó)），SIRT1干擾序列5′-TCGAACAATTCTTAAAGAT-3′，RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑和BCA試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher公司（美國(guó)）；磷酸酶抑制劑（貨號(hào)CW2383S）購(gòu)自康為世紀(jì)（中國(guó)）；TRIzol試劑（貨號(hào)T9424）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司（美國(guó)）；Prime ScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)RR036A）購(gòu)自TaKaRa公司（日本）；LightCycler 480 SYBR Green I Master購(gòu)自Roche公司（美國(guó)）；SIRT1、腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）、p-AMPK、叉頭轉(zhuǎn)錄因子O1（FOXO1）、β-actin抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司（美國(guó)）；IRDye 800CW二抗（貨號(hào)926-32211）購(gòu)自LI-COR公司（美國(guó)）；甘油三酯（貨號(hào)A110-1-1）、總膽固醇試劑盒（貨號(hào)A111-1-1）購(gòu)自南京建成生物工程研究所（中國(guó)江蘇）。

2. 主要儀器

熒光倒置顯微鏡及體視顯微鏡（Leica）；Nanadrop2000分光光度計(jì)（Thermo）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche LightCycler 480）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Thermo）；雙色紅外成像系統(tǒng)Odyssey（LI-COR）。

三、方 法

1. HE染色

將小鼠脂肪組織固定，經(jīng)過(guò)浸蠟、包埋、切片后，按照步驟進(jìn)行二甲苯脫蠟，蘇木素和0.5%伊紅分別染色、脫水和封片，顯微鏡下觀察并拍照。采用Image J軟件統(tǒng)計(jì)脂滴大小。

2.組織蛋白提取和蛋白免疫印跡

取小鼠脂肪組織100 mg～200 μL預(yù)冷RIPA裂解液中，勻漿后采用14 000轉(zhuǎn)/分于4℃離心

20 min，吸取中間清液層得到蛋白原液。用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度配平后，取30 μg總蛋白進(jìn)行凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入相應(yīng)的Ⅰ抗稀釋液（1∶1 000）于4℃過(guò)夜孵育。孵育結(jié)束后用TBST洗膜3次，加入Ⅱ抗稀釋液（1∶10 000）室溫避光孵育1 h后，再次洗膜，使用Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)掃描，并用Image J軟件測(cè)量蛋白條帶灰度值進(jìn)行定量。

3. 組織RNA提取和RT-qPCR檢測(cè)

使用TRIzol試劑提取小鼠脂肪組織總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度和純度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用試劑盒并采用PCR檢測(cè)儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系的配制及反應(yīng)程序均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)。內(nèi)參照為β-actin，結(jié)果使用2-??Ct方法分析計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

4.血清檢測(cè)

小鼠血清中甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）水平的測(cè)定按照相應(yīng)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖表繪制分析。數(shù)據(jù)采用? 表示。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、IF能減小高脂飲食喂養(yǎng)小鼠脂肪細(xì)胞體積并降低血脂水平

小鼠脂肪組織HE染色和稱重結(jié)果顯示，與CD組相比，HFD組小鼠脂肪細(xì)胞體積增大且質(zhì)量更重（F = 30.732，P < 0.001；F = 63.267，P < 0.001），而HFD-IF組小鼠脂肪細(xì)胞體積較HFD組減小且質(zhì)量減輕（F = 30.732，P < 0.001；F =

63.267，P < 0.001），脂質(zhì)含量明顯降低，見(jiàn)圖1。HFD組小鼠血清中TG、TC水平高于CD組［TG HFD vs. CD：（148.66±11.44）mg/dL vs.

（79.33±5.43） mg/dL，F(xiàn) = 22.913， P < 0.001；TC HFD vs. CD：（160.40±7.62） mg/dL vs. （100.12±2.05） mg/dL，F(xiàn) = 38.717， P < 0.001］，而HFD-IF組較HFD組小鼠水平下降［TG HFD-IF vs. HFD：（80.96±6.69）mg/dL vs. （148.66±11.44）

mg/dL，P < 0.001；TC HFD-IF vs. HFD：（116.23±3.63）mg/dL vs. （160.40±7.62）mg/dL，P < 0.001］。

二、IF上調(diào)高脂飲食小鼠白色脂肪組織中SIRT1及激活A(yù)MPK、FOXO1通路

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，HFD組小鼠中SIRT1、p-AMPK、FOXO1表達(dá)均較CD組降低

（F = 35.641，P < 0.001；F = 7.503，P = 0.037；F =

9.935，P = 0.012），而IF使SIRT1、p-AMPK、FOXO1水平升高（F = 35.641，P = 0.043；F = 7.503，P = 0.034；F = 9.935、P = 0.044）。見(jiàn)圖2。

三、IF增加高脂飲食小鼠白色脂肪組織線粒體生物合成并減輕炎癥程度

與CD組相比，HFD組小鼠脂肪組織中線粒體生物合成相關(guān)基因Pgc-1a、Tfam和Nrf1的mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低（F = 23.561，P < 0.001；F = 15.872，P < 0.001；F = 24.456，P < 0.001），而炎癥相關(guān)基因TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）和生長(zhǎng)因子樣模體黏液樣激素樣受體（F4/80）的mRNA表達(dá)水平均升高（F = 16.742，P = 0.006；

F = 17.743，P = 0.003；F = 8.492，P = 0.007）；與HFD組相比，HFD-IF組小鼠線粒體生物合成相關(guān)基因表達(dá)水平上升（Pgc-1a、Tfam和Nrf1分別為P = 0.003、P = 0.022、P = 0.021），炎癥相關(guān)基因表達(dá)下降（TNF-α、MCP-1和F4/80分別為P < 0.001、P < 0.001、P = 0.043）。

四、敲減SIRT1削弱IF減小高脂飲食喂養(yǎng)小鼠脂肪細(xì)胞體積和降低血脂的作用

通過(guò)尾靜脈注射AAV-shSirt1敲減SIRT1表達(dá)后，shSirt1-HFD組與shCtrl-HFD組脂肪細(xì)胞體積大小比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），而shSirt1-HFD-IF組與對(duì)照組相比，脂肪質(zhì)量無(wú)明顯變化但細(xì)胞體積減小的程度有所下降（體積F = 17.993，P = 0.047；質(zhì)量F = 46.439，P =

0.881），見(jiàn)圖3A～B。敲減SIRT1后，IF降低HFD誘導(dǎo)的高血脂作用被減弱（IF后TG shCtrl vs. shSirt1：（82.30±2.12） mg/dL vs. （124.74±2.94）? mg/dL，F(xiàn) = 97.605， P < 0.001；TC shCtrl vs. shSirt1：（105.56±2.95） mg/dL vs. （144.83±5.10） mg/dL，F(xiàn) = 28.871， P = 0.002）。以上結(jié)果提示敲減SIRT1后，IF改善高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞體積增大和降低血脂的作用有所削弱。

五、敲減SIRT1減低間歇性禁食激活白色脂肪組織AMPK及FOXO1的作用

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，敲減SIRT1后，SIRT1的蛋白水平均降低（F = 9.653，P = 0.038；F = 11.307，P = 0.027），見(jiàn)圖4A。與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，shCtrl-HFD-IF組 FOXO1、p-AMPK的蛋白水平較shCtrl-HFD組增加（F = 7.468，P = 0.028；F = 15.313，P = 0.003），敲減SIRT1后shSirt1-HFD-IF組與shCtrl-HFD-IF組相比，可以看到IF上調(diào)的FOXO1、p-AMPK表達(dá)的作用減弱（FOXO1 P = 0.026、p-AMPK P = 0.012），見(jiàn)圖4B。

六、敲減SIRT1消除IF增加高脂飲食小鼠白色脂肪組織線粒體合成和炎癥的作用

RT-qPCR結(jié)果顯示，shCtrl-HFD-IF組與shCtrl-HFD組相比，線粒體功能相關(guān)基因如Tfam、Nrf1和Pgc-1a的mRNA表達(dá)均增加（F = 19.495，P < 0.001；F = 16.386，P = 0.008；F = 12.254，P =

0.002），炎癥相關(guān)基因MCP-1、F4/80和TNF-α的mRNA水平下調(diào)（F = 9.857，P = 0.014；F = 5.039，P = 0.050；F = 10.264，P = 0.047）。而敲減SIRT1后，與shCtrl-HFD-IF組相比，shCtrl-HFD-IF組IF的這種改善作用基本消失（Tfam P = 0.008、Nrf1 P < 0.001、Pgc-1a P = 0.018；MCP-1 P = 0.002、F4/80 P = 0.524、TNF-α P = 0.030）。見(jiàn)圖5。

討論

脂肪組織是具有能量?jī)?chǔ)存和分泌功能的器官，在肥胖的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。脂肪組織線粒體功能與炎癥和許多跟肥胖相關(guān)的疾病發(fā)生有關(guān)，如脂肪肝、脂代謝紊亂、胰島素抵抗和糖尿病等［11-12］。IF作為一種越來(lái)越受到關(guān)注的飲食方式，已成為肥胖與代謝性疾病發(fā)病機(jī)制及干預(yù)措施研究的重要模型。既往研究顯示IF具有改善葡萄糖耐量、脂代謝紊亂、脂肪組織炎癥和延長(zhǎng)壽命的作用，但具體機(jī)制尚不明確［13-14］。本研究顯示SIRT1在IF改善HFD誘導(dǎo)的脂肪組織線粒體功能和炎癥狀態(tài)中發(fā)揮重要作用，可能通過(guò)激活A(yù)MPK和FOXO1通路增加線粒體生物合成發(fā)揮抗炎作用。

本課題組的前期研究證實(shí)SIRT1作為受能量代謝調(diào)控的去乙酰化蛋白，在高脂條件下其在肝臟中的表達(dá)降低，禁食時(shí)表達(dá)上調(diào)［15-16］。在本研究中，白色脂肪組織中SIRT1的蛋白表達(dá)結(jié)果與既往研究結(jié)果相似，相關(guān)研究證實(shí)，SIRT1可通過(guò)調(diào)控脂肪組織和肝臟的Pgc-1a促進(jìn)線粒體生物合成，并能控制促炎基因轉(zhuǎn)錄從而調(diào)節(jié)脂肪組織炎癥程度［9， 17-18］。本研究顯示高脂誘導(dǎo)小鼠白色脂肪組織Pgc-1a、Tfam和Nrf1的表達(dá)降低，MCP-1、F4/80以及TNF-α的表達(dá)增加，提示存在線粒體功能障礙和脂肪炎癥，IF能改善上述基因的表達(dá)；然而尾靜脈注射AAV-shSirt1敲低小鼠SIRT1表達(dá)后，IF對(duì)上述線粒體功能及炎癥相關(guān)基因的作用被顯著減弱，提示SIRT1可能通過(guò)改善線粒體功能障礙、減輕機(jī)體組織炎癥程度而緩解機(jī)體代謝性疾病。

AMPK是機(jī)體的能量感受器，具有特異性調(diào)控線粒體生物過(guò)程的作用［19］。SIRT1是激活A(yù)MPK改善線粒體功能所必需的［8］。此外，SIRT1還通過(guò)上調(diào)FOXO1發(fā)揮抗自噬、抗氧化應(yīng)激和抗炎等作用［10-20］。本研究顯示，IF能上調(diào)HFD小鼠脂肪組織p-AMPK和FOXO1蛋白水平，但敲低SIRT1的表達(dá)后，IF上調(diào)p-AMPK、FOXO1表達(dá)的作用減弱，提示SIRT1通過(guò)激活A(yù)MPK和FOXO1參與IF改善肥胖脂肪組織線粒體功能和炎癥的機(jī)制。

綜上所述，IF可能通過(guò)調(diào)控脂肪組織線粒體功能和炎癥狀態(tài)從而改善肥胖，而SIRT1在其中起重要作用。本研究?jī)H探討了IF對(duì)白色脂肪組織的作用，需進(jìn)一步檢測(cè)其在組織代謝中的作用并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)更深入探討SIRT1在其中的作用。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2022-11-01）

（本文編輯：洪悅民）