姜 瑋，王 娟

（北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，北京 100124）

膜聯(lián)蛋白(annexin) 是一類進(jìn)化保守的鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白家族，廣泛存在于動植物細(xì)胞中[1]。細(xì)胞分泌是原核生物和真核生物都存在的一種基本的生理過程，它將可溶的蛋白質(zhì)和貨物輸送到細(xì)胞外。在真核生物中，大多數(shù)分泌蛋白通過常規(guī)分泌途徑分泌，即從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸?shù)礁郀柣w，再由分泌囊泡等運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)膜(plasma membrane，PM)[2]。除常規(guī)蛋白分泌途徑外，研究發(fā)現(xiàn)越來越多的蛋白可以通過非常規(guī)途徑分泌，如不攜帶信號肽的胞漿蛋白的胞外分泌、含信號肽的跨膜蛋白繞過高爾基體在細(xì)胞表面運(yùn)輸?shù)萚3]。膜聯(lián)蛋白由于缺少信號肽，只能通過非常規(guī)分泌途徑分泌?，F(xiàn)對膜聯(lián)蛋白A家族的非常規(guī)分泌途徑進(jìn)行綜述。

1 膜聯(lián)蛋白A家族

1.1 膜聯(lián)蛋白A家族概述

膜聯(lián)蛋白是一種鈣依賴的磷脂結(jié)合蛋白，最早由Creutz等人在腎上腺細(xì)胞中分離純化獲得[4]。研究發(fā)現(xiàn)的1000多種膜聯(lián)蛋白主要存在于脊椎動物、無脊椎動物、植物、真菌中，尚未在酵母和原核生物中發(fā)現(xiàn)。脊椎動物常見的12個(gè)膜聯(lián)蛋白被命名為膜聯(lián)蛋白A家族[5]。膜聯(lián)蛋白核心區(qū)由4~8個(gè)重復(fù)序列組成，每個(gè)重復(fù)序列長約70個(gè)氨基酸，由5個(gè)ɑ螺旋組合形成圓盤結(jié)構(gòu)，包含一個(gè)與鈣離子結(jié)合的特征‘type2’基序[1]。由于這種保守的一級結(jié)構(gòu)，膜聯(lián)蛋白彼此之間具有高度的同一性。在哺乳動物中，任何一種膜聯(lián)蛋白與該家族的其他成員都有40%~60%的同源性。膜聯(lián)蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域包含磷酸化、蛋白質(zhì)分解，甚至與其他蛋白質(zhì)相互作用的主要部位，被認(rèn)為是蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)區(qū)[6]。

1.2 膜聯(lián)蛋白A家族的功能

首先，膜聯(lián)蛋白A家族可以促進(jìn)細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架的形成。膜聯(lián)蛋白與磷脂結(jié)合后能夠通過其橫向聚集調(diào)節(jié)雙層膜結(jié)構(gòu)的形成，在此過程中，膜聯(lián)蛋白作為膜骨架起到穩(wěn)定脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的作用[7]。研究表明，哺乳動物中的膜聯(lián)蛋白A家族以鈣依賴性方式與肌動蛋白微絲結(jié)合，介導(dǎo)肌動蛋白微絲的聚集，從而影響細(xì)胞骨架的功能[1]。其次，膜聯(lián)蛋白A家族參與調(diào)節(jié)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。膜聯(lián)蛋白A1、A2、A6、A8參與調(diào)節(jié)表皮生長因子受體(EGFR)信號傳導(dǎo)途徑[8]，且膜聯(lián)蛋白A6可以通過招募GTPase激活蛋白（p120GAP）負(fù)調(diào)控EGFR信號傳導(dǎo)通路[9]。膜聯(lián)蛋白A家族也參與細(xì)胞增殖和凋亡。在急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中，全反式維甲酸誘導(dǎo)的分化與膜聯(lián)蛋白A8下調(diào)有關(guān)，表明其在增殖和分化中發(fā)揮作用[10]。膜聯(lián)蛋白A5是幾乎所有細(xì)胞和組織中含量最豐富的膜聯(lián)蛋白，大量的膜聯(lián)蛋白A5在細(xì)胞外被發(fā)現(xiàn)，由于其對質(zhì)膜外小葉中磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）的強(qiáng)結(jié)合親和力，膜聯(lián)蛋白A5現(xiàn)在被廣泛用于檢測各種疾病環(huán)境中的凋亡細(xì)胞[11]。

抗凝和炎癥調(diào)節(jié)是膜聯(lián)蛋白A家族重要的生理病理功能。膜聯(lián)蛋白A4和膜聯(lián)蛋白A5通過鈣離子調(diào)節(jié)與磷脂結(jié)合，在細(xì)胞外發(fā)揮抗凝血因子的作用。膜聯(lián)蛋白A5的血漿濃度在懷孕期間和產(chǎn)后都很低，且保持不變，有助于防止妊娠期間胎盤內(nèi)凝血；而膜聯(lián)蛋白A4的水平在分娩后不久就會增加，在預(yù)防彌漫性血管內(nèi)凝血病中發(fā)揮作用[12]。膜聯(lián)蛋白A1是一種糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白，膜聯(lián)蛋白A1基因敲除小鼠白細(xì)胞遷移和IL-1β生成增加，表現(xiàn)出抵抗糖皮質(zhì)激素的抗炎作用[13]。在急性炎癥中，膜聯(lián)蛋白A2與肌動蛋白和鈣黏蛋白的相互作用是其調(diào)節(jié)血管完整性的基礎(chǔ)，其可以協(xié)助啟動血管生成，促進(jìn)組織修復(fù)[14]。敲低膜聯(lián)蛋白A3可以通過激活PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)心肌組織的修復(fù)和愈合[15]。膜聯(lián)蛋白A5治療可減輕高膽固醇血癥小鼠缺血后的炎癥反應(yīng)，改善左室重構(gòu)，改善高膽固醇血癥小鼠的心功能[16]。

研究發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白可以在細(xì)胞外發(fā)揮作用，但膜聯(lián)蛋白是如何從胞內(nèi)分泌到胞外的仍不清楚。已知膜聯(lián)蛋白是可溶性細(xì)胞溶質(zhì)蛋白，缺乏信號肽，因此，膜聯(lián)蛋白家族只能通過非常規(guī)分泌途徑分泌。

2 膜聯(lián)蛋白A家族的非常規(guī)分泌途徑

非常規(guī)蛋白分泌（unconventional protein secretion，UPS）途徑可以分為四種：Ⅰ型為直接跨質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)，Ⅱ型為通過ABC（ATP-binding-cassette）轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)，Ⅲ型為基于細(xì)胞器的易位和細(xì)胞外小泡的分泌，IV型為有信號肽或有跨膜區(qū)域的分泌蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)但不經(jīng)過高爾基體到達(dá)細(xì)胞質(zhì)膜的分泌[17]。目前，已知的膜聯(lián)蛋白的分泌途徑主要為前三種，即直接跨質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)、通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)、基于細(xì)胞器的易位和細(xì)胞外小泡的分泌。

2.1 直接跨質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)

直接跨質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)是分泌貨物不需要囊泡中間體而直接跨過細(xì)胞膜分泌。膜聯(lián)蛋白A6是鈣離子和脂質(zhì)結(jié)合蛋白家族中的一員，它在中等酸性的pH下可以穿透膜的疏水性區(qū)域，以不依賴于鈣離子的方式與膜相互作用，并作為膜整合蛋白發(fā)揮作用[18]。在低pH條件下，膜聯(lián)蛋白A5和膜聯(lián)蛋白A12在沒有鈣離子的情況下，能夠暴露在雙層疏水結(jié)構(gòu)域中形成離子通道，可逆地與磷脂囊泡結(jié)合[19]。綜上所述，膜聯(lián)蛋白可能不需要任何其他中間體，直接跨質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.2 通過ABC（ATP-binding-cassette）轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一種依賴于ATP的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)運(yùn)輸離子、重金屬、氨基酸和寡肽等貨物。在哺乳動物細(xì)胞中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也負(fù)責(zé)無信號肽蛋白的分泌。研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素可以刺激濾泡星狀細(xì)胞中膜聯(lián)蛋白A1的分泌，在這個(gè)過程中觀察到ABCA1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與細(xì)胞表面的膜聯(lián)蛋白A1共定位，且ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑格列本脲抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的膜聯(lián)蛋白A1的分泌。由此說明，ABCA1在膜聯(lián)蛋白A1的分泌中發(fā)揮作用[20]。

2.3 基于細(xì)胞器的易位和細(xì)胞外小泡的分泌

基于細(xì)胞器的易位和細(xì)胞外小泡的分泌，是將蛋白貨物整合到膜結(jié)合的細(xì)胞器或結(jié)構(gòu)中進(jìn)行分泌的途徑[21]。分泌形式包括微囊泡、外泌體、分泌型自噬和分泌型溶酶體等。

2.3.1 微囊泡形式分泌 微囊泡（microvesicles，MVs）是質(zhì)膜向外收縮時(shí)直接從質(zhì)膜上脫落的囊泡，含有非常規(guī)分泌的物質(zhì)。微囊泡是細(xì)胞外小泡（extracellular vesicles，EVs）的一部分，直徑在50 nm～1000 nm[22]。

Jeppesen等[23]用結(jié)構(gòu)照明顯微鏡(SIM)觀察到，膜聯(lián)蛋白A1在質(zhì)膜上染色較深，可直接在質(zhì)膜上觀察到膜聯(lián)蛋白 A1陽性囊泡的萌發(fā)；膜聯(lián)蛋白A1陽性囊泡的大小分布在150 nm~1000 nm之間，與經(jīng)典的微囊泡大小一致，其生物發(fā)生需要從質(zhì)膜上脫落，這使膜聯(lián)蛋白A1成為經(jīng)典微囊泡的特異性分子標(biāo)記。

2.3.2 外泌體 1983年，Pan和Johnstone[24]發(fā)現(xiàn)外泌體（exosome），它是細(xì)胞內(nèi)多泡體(multivesicular body，MVB)與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的膜性囊泡，是一種直徑為40 nm~100 nm的納米級脂質(zhì)包裹體結(jié)構(gòu)，內(nèi)部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物質(zhì)[25]。幾乎所有類型的細(xì)胞都可以產(chǎn)生并釋放外泌體。

在細(xì)胞質(zhì)中，膜聯(lián)蛋白在膜轉(zhuǎn)運(yùn)和內(nèi)吞作用中起重要作用。有研究表明，外泌體在膜聯(lián)蛋白的分泌中發(fā)揮了作用。Leoni等[27]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性膜聯(lián)蛋白A1定位于細(xì)胞外小泡（EV），通過免疫金標(biāo)記法和電子顯微鏡觀察到膜聯(lián)蛋白A1存在于與外泌體大小和形狀一致的小泡中。CD63已被報(bào)道為外泌體的一種成分，采用超速離心和瓊脂糖珠親和純化的方法分離外泌體，通過免疫印跡法檢測，在含有CD63的EVs中發(fā)現(xiàn)了膜聯(lián)蛋白A1[26]。Pessolano等[28]利用Western印跡分析也發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A1存在于細(xì)胞外泌體中，且可以通過內(nèi)吞和胞吐途徑與質(zhì)膜融合。Maji等[29]通過免疫電子顯微鏡分析表明，膜聯(lián)蛋白A2主要存在于外泌體的表面和管腔。Valapala等[30]研究發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白A2是受離子載體刺激后細(xì)胞釋放的外泌體的組成部分，在這個(gè)研究中，利用免疫印跡法證實(shí)了外泌體中含有膜聯(lián)蛋白A2，且經(jīng)過離子載體處理后，在外泌體標(biāo)記蛋白hsc70的水平增加的同時(shí)，膜聯(lián)蛋白A2的水平也增加。外泌體抑制劑DMA可以抑制干擾素-?刺激增加肺上皮細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A2的細(xì)胞表面易位[31]。研究表明，膜聯(lián)蛋白A5可以作為外泌體的標(biāo)記蛋白[32]。Comfort等[33]利用毛細(xì)管免疫分析方法對細(xì)胞外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，發(fā)現(xiàn)了膜聯(lián)蛋白A5的存在。Raj等[34]對超速離心得到的外泌體蛋白進(jìn)行iTRAQ分析也發(fā)現(xiàn)了膜聯(lián)蛋白A5的存在。Sakwe等[35]通過免疫印跡對分泌的提取物和細(xì)胞總蛋白進(jìn)行分析表明，膜聯(lián)蛋白A6由乳腺癌細(xì)胞以鈣離子依賴的方式通過外泌體分泌。綜上所述，膜聯(lián)蛋白可以通過外泌體分泌。

2.3.3 分泌型自噬 自噬是一種利用溶酶體降解失活蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的穩(wěn)態(tài)過程。有研究表明，自噬可以不涉及STX17及其復(fù)合體，由幾種與囊泡運(yùn)輸和融合有關(guān)的蛋白質(zhì)，如Rab蛋白(Rab8A)和SNARES蛋白(SEC22B)，通過避免經(jīng)典的自噬體-溶酶體融合來介導(dǎo)分泌型自噬，并驅(qū)動自噬體與細(xì)胞膜融合。自噬體也可以與MVB融合，形成amphisomes，將貨物運(yùn)輸?shù)侥ね狻?/p>

雖然自噬和囊泡運(yùn)輸之間的關(guān)系仍不清楚，但已知Rab蛋白參與了這兩個(gè)過程，例如，Rab7和Rab11A在自噬途徑和EV運(yùn)輸中都起作用[36]。在干擾素-?的刺激下，自噬小體可與MVB融合，將膜聯(lián)蛋白A2運(yùn)輸?shù)酵饷隗w。在這個(gè)途徑中，膜聯(lián)蛋白A2被運(yùn)輸?shù)阶允尚◇w中，自噬小體以Rab11依賴的方式與MVB融合后，以Rab8A和Rab27A依賴的方式與質(zhì)膜融合。在同一項(xiàng)研究中，自噬相關(guān)蛋白也被證明在膜聯(lián)蛋白A2感染外泌體的分泌中發(fā)揮作用，如當(dāng)自噬蛋白5(ATG5)被敲低時(shí)，外泌體中的膜聯(lián)蛋白A2分泌減少[37]。綜上所述，干擾素-?刺激可以誘導(dǎo)分泌型自噬增加細(xì)胞表面膜聯(lián)蛋白A2的數(shù)量。

2.3.4 分泌型溶酶體 分泌型溶酶體是一類能夠?qū)ν饨绱碳みM(jìn)行調(diào)節(jié)分泌的溶酶體。有研究表明，前列腺體是通過分泌型溶酶體與質(zhì)膜融合釋放到膜外的。前列腺體是由前列腺上皮細(xì)胞分泌的小泡，其中包括了膜聯(lián)蛋白A2[38]。由于沒有相關(guān)證據(jù)表明阻斷分泌型溶酶體途徑后，膜聯(lián)蛋白A2的分泌是否會發(fā)生變化，所以，尚不確定膜聯(lián)蛋白A2單蛋白是否可以通過分泌型溶酶體途徑運(yùn)輸?shù)侥ね狻?/p>

3 結(jié)語

自1978年Creutz等人發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白以來，到現(xiàn)在已經(jīng)將近50年了，其功能也被大家逐漸發(fā)現(xiàn)，然而，作為一種非常規(guī)分泌蛋白，膜聯(lián)蛋白的分泌模式尚未被完全認(rèn)知。雖然已經(jīng)了解了幾種膜聯(lián)蛋白A家族的非常規(guī)分泌機(jī)制，包括直接跨質(zhì)膜運(yùn)輸、通過細(xì)胞外囊泡運(yùn)輸以及通過分泌型自噬體等途徑，但仍有些問題亟待解決，如哪些刺激可以促進(jìn)或抑制膜聯(lián)蛋白的分泌，膜聯(lián)蛋白直接跨質(zhì)膜運(yùn)輸是否需要特定的環(huán)境，在沒有干擾素-?刺激的情況下，膜聯(lián)蛋白A2還能否通過分泌型自噬途徑分泌等。這些問題的解決將有助于更好地了解膜聯(lián)蛋白家族的分泌機(jī)制，對相關(guān)疾病的治療也將具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和價(jià)值。