劉力波，田志鵬，李志敏

（河北常山生化藥業(yè)股份有限公司，河北石家莊 050800）

0 引言

肝素鈉在臨床上，主要用于預(yù)防血栓形成和栓塞，以及治療各種原因引起的彌散性血管內(nèi)凝血。牛源肝素鈉區(qū)別于目前最廣泛使用的豬源肝素鈉，從牛腸黏膜提取。據(jù)UNFAO 2013年官方統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，全球活牛數(shù)量（包括家養(yǎng)牛和水牛） 約為17 億頭，而全球活豬數(shù)量約為10 億頭[1]，牛的數(shù)量是豬數(shù)量的1.7 倍，牛源肝素鈉具有更為廣闊的原料來源。牛源肝素粗品含有核酸、蛋白質(zhì)、硫酸皮膚素和硫酸軟骨素等雜質(zhì)，精制過程主要是對粗品肝素進(jìn)行去雜質(zhì)和脫色。國內(nèi)目前純化肝素的方法主要采用高錳酸鉀氧化法、過氧化氫- 高錳酸鉀組合氧化法、過氧化氫二次氧化法[2]。但是，高錳酸鉀氧化會在H 譜的2.10 mg/L 處出現(xiàn)一個特征信號峰[3]，存在可能不符合藥典標(biāo)準(zhǔn)的問題，而且高錳酸鉀氧化過程中會產(chǎn)生大量難以過濾的二氧化錳絮狀物，工藝操作復(fù)雜。而雙氧水氧化后分解成水和氧氣，是相對清潔的氧化劑。相較于多次氧化，單次雙氧水氧化工藝的生產(chǎn)周期短，更為節(jié)省物料，有利于企業(yè)控制成本。為了通過單次氧化既完成脫色任務(wù)，又不會因氧化過強(qiáng)而過多損失收率，這就需要設(shè)計正交試驗，挑選出最適宜的工藝參數(shù)。著重描述了最優(yōu)氧化工藝的篩選過程，并對精制的牛源肝素鈉進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

牛源粗品肝素，Wegmed 公司提供；肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所提供；綿羊血漿，東營博豐生物科技有限公司提供；過氧化氫、氯化鈉、氯化鈣、鹽酸、氫氧化鈉和過氧化氫，均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器

UV-8000 型紫外- 可見分光光度計，上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；DK-98-ⅡA 型恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；PB-10 型PH 計，Sartorius 公司產(chǎn)品；DZF-6210 型真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；S22-2 型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司產(chǎn)品；PL602-L 型電子天平，Mettler Toledo 公司產(chǎn)品；JB300-D 型電動攪拌機(jī)，上海標(biāo)本模型廠產(chǎn)品；E2695 型高效液相色譜儀，美國沃特斯公司產(chǎn)品；U3000 型高效液相色譜儀，美國賽默飛公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法

肝素鈉效價測定采用羊血漿法[4]，二糖測定參照Mourier P的方法[5]，分子量測定參照Fu L等人[6]的方法。將肝素精品的水溶液進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)溶液在400 nm 處有一個吸收峰值，因此將色素的檢測波長定為400 nm。

1.3.2 脫色率和效價收率的計算方法

式中：A前、A后——樣品脫色前后的吸光度。

式中：M1——氧化前質(zhì)量，g；

P1——氧化前效價；

M2——氧化后質(zhì)量，g；

P2——氧化后效價。

1.3.3 單因素試驗

取經(jīng)鹽解、高溫、離子交換、乙醇沉淀等步驟處理的沉淀物20 g，加純化水溶解至200 mL，進(jìn)行氧化步驟；氧化結(jié)束后，調(diào)藥液pH 值為6.0～7.0，加入乙醇使藥液乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%；乙醇沉淀16 h 后，將沉淀物烘干，對沉淀干燥品進(jìn)行效價和吸光值檢測；分別考查反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH 值、雙氧水添加量、反應(yīng)時間對脫色率和效價收率的影響。

1.3.4 正交試驗

將氧化步驟的反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH 值、雙氧水加量、反應(yīng)時間作為影響因素，以脫色率和效價收率為考查指標(biāo)，設(shè)計四因素三水平L9（34）正交試驗。

氧化反應(yīng)條件影響試驗正交因素與水平設(shè)計見表1。

表1 氧化反應(yīng)條件影響試驗正交因素與水平設(shè)計

1.3.5 牛源肝素鈉制備工藝

工藝首先通過鹽解與高溫處理將一部分蛋白質(zhì)與多糖分離；然后用陰離子樹脂進(jìn)行吸附，再用低濃度NaCl 溶液洗滌除去大量蛋白質(zhì)、核酸，用高濃度NaCl 溶液洗脫得到肝素溶液，并進(jìn)行乙醇沉淀除去硫酸皮膚素和硫酸軟骨素；隨后將沉淀物溶解進(jìn)行氧化，再經(jīng)乙醇沉淀、凍干，獲得效價較高、色澤良好的牛源肝素鈉精品。鹽解、高溫處理、離子交換和乙醇沉淀的工藝步驟與傳統(tǒng)的肝素鈉生產(chǎn)方法[7]基本一致，凍干的參數(shù)采用公司經(jīng)過驗證的參數(shù)。

牛源肝素鈉制備工藝流程見圖1。

圖1 牛源肝素鈉制備工藝流程

2 結(jié)果與分析

控制合適的氧化條件，才能使得色素被充分的去除，而牛源肝素的結(jié)構(gòu)不受影響。根據(jù)文獻(xiàn)[8-9]報道并結(jié)合實(shí)際，確定影響脫色率和效價收率的關(guān)鍵參數(shù)為反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH 值、雙氧水加量、反應(yīng)時間。

2.1 雙氧水加量對脫色率和效價收率的影響

固定反應(yīng)溫度60±2 ℃，反應(yīng)pH 值10.0±0.2，反應(yīng)時間6 h，進(jìn)行不同雙氧水添加量對脫色率和效價收率的影響。

雙氧水添加量對脫色率和效價收率的影響見圖2。

圖2 雙氧水添加量對脫色率和效價收率的影響

由圖2 可知，雙氧水添加量達(dá)到2%后，脫色率達(dá)到頂點(diǎn)，而效價收率隨著添加量升高緩慢下降，2%是一個較優(yōu)的雙氧水添加量。

2.2 反應(yīng)溫度對脫色率和效價收率的影響

固定反應(yīng)pH 值10.0±0.2，雙氧水添加量2%，反應(yīng)時間6 h，進(jìn)行不同反應(yīng)溫度對脫色率和效價收率的影響。

反應(yīng)溫度對脫色率和效價收率的影響見圖3。

圖3 反應(yīng)溫度對脫色率和效價收率的影響

由圖3 可知，反應(yīng)溫度達(dá)到50 ℃后，脫色率上升變得緩慢，而效價收率隨著溫度升高持續(xù)下降，50 ℃是一個較優(yōu)的反應(yīng)溫度。

2.3 反應(yīng)pH 值對脫色率和效價收率的影響

固定反應(yīng)溫度50±2 ℃，雙氧水加量2%，反應(yīng)時間6 h，進(jìn)行不同反應(yīng)pH 值對脫色率和效價收率的影響。

反應(yīng)pH 值對脫色率和效價收率的影響見圖4。

圖4 反應(yīng)pH 值對脫色率和效價收率的影響

由圖4 可知，反應(yīng)pH 值達(dá)到10 后，脫色率達(dá)到頂點(diǎn)，而效價收率隨著pH 值升高持續(xù)下降，pH值為10 是一個較優(yōu)的反應(yīng)pH 值。

2.4 反應(yīng)時間對脫色率和效價收率的影響

固定反應(yīng)溫度50±2 ℃，反應(yīng)pH 值10.0±0.2，雙氧水添加量2%，進(jìn)行不同反應(yīng)時間對脫色率和效價收率的影響。

反應(yīng)時間對脫色率和效價收率的影響見圖5。

由圖5 可知，反應(yīng)時間達(dá)到6 h 后，脫色率不再上升，而效價收率隨著反應(yīng)時間延長持續(xù)下降，6 h是一個較優(yōu)的反應(yīng)時間。

圖5 反應(yīng)時間對脫色率和效價收率的影響

2.5 氧化反應(yīng)條件的優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗，對比脫色率和效價收率。

氧化反應(yīng)條件及結(jié)果見表2。

表2 氧化反應(yīng)條件及結(jié)果

根據(jù)表2 中的極差R 值，對脫色率影響程度的順序是雙氧水加量＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)pH 值＞反應(yīng)時間，對效價收率影響程度的順序是反應(yīng)溫度＞反應(yīng)pH 值＞反應(yīng)時間＞雙氧水加量。雙氧水加量對脫色率影響排第1 位，取最優(yōu)雙氧水加量2.5%；反應(yīng)溫度對效價收率影響排第1 位，取最優(yōu)反應(yīng)溫度40±2 ℃；反應(yīng)pH 值對效價收率影響排第2 位，對脫色率排第3 位，取對效價收率影響的最優(yōu)反應(yīng)pH 值9.0±0.2；脫色率和效價收率的最優(yōu)反應(yīng)時間均為6 h。

2.6 較優(yōu)工藝條件試驗

選擇3 批牛源粗品肝素，按照研究篩選的最優(yōu)牛源肝素生產(chǎn)工藝，制備3 批牛源肝素鈉試驗樣品，進(jìn)行效價、核酸雜質(zhì)、蛋白質(zhì)、分子量等項目檢測。

檢測結(jié)果見表3。

表3 檢測結(jié)果

N-1，N-2，N-3 這3 批牛源肝素鈉試驗的脫色率依次為94.3%，94.7%，94.8%，平均為94.6%；氧化步驟的效價收率依次為97.5%，97.2%，97.3%，平均為97.3%。效價、雜質(zhì)含量、分子量等指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)要求，總的效價收率也大于90%，說明該工藝穩(wěn)定且高效。

2.7 牛源肝素鈉的二糖結(jié)構(gòu)分析

對N-1，N-2，N-3 這3 批牛源肝素鈉試驗樣品進(jìn)行二糖進(jìn)行檢測。

二糖分布檢測結(jié)果見表4。

表4 二糖分布檢測結(jié)果

ΔGlyser 峰表征肝素中的絲氨酸殘基，其可被強(qiáng)氧化劑氧化成ΔGlyser ox1 峰，ΔIVSgal 和ΔIISgal結(jié)構(gòu)源于- IdoA（2S）- GlcNS（6S）- 和- IdoA（2S）-GlcNS- 在堿性條件下2- O- 脫硫[10]，這2 個結(jié)構(gòu)的含量可以反映肝素是否經(jīng)歷過高堿性條件，工藝沒有高堿處理步驟，所以樣品的這2 個峰較低。ΔUA（2S）-GlcNS 峰和ΔUA（2S）-GlcNS（6S）峰可以用來辨別肝素的來源，牛源肝素的ΔUA（2S）- GlcNS 峰顯著高于豬源肝素[11]，ΔUA（2S）-GlcNS（6S）峰的含量與肝素的效價相關(guān)，牛源肝素的效價明顯低于豬源肝素就與該峰較低有關(guān)。

3 結(jié)論

經(jīng)設(shè)計正交試驗方案，并對試驗結(jié)果分析研究得出氧化步驟的最佳反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度40±2 ℃，反應(yīng)pH 值9.0±0.2，雙氧水添加量2.5%，反應(yīng)時間6 h。按最優(yōu)氧化條件進(jìn)行試驗，該步驟的脫色率為94.6%，效價收率為97.3%。制備的牛源肝素鈉效價、雜質(zhì)含量、分子量等指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)要求，總的效價收率也大于90%，說明該工藝穩(wěn)定且高效。

對牛源肝素鈉進(jìn)行二糖結(jié)構(gòu)分析，ΔGlyser 峰較高，ΔGlyser ox1 峰較低，ΔIVSgal 和ΔIISgal 峰含量較低，表明牛源肝素鈉結(jié)構(gòu)未被破壞，控制合適的氧化條件，才能使得色素被充分去除，而結(jié)構(gòu)不受影響。ΔUA（2S）-GlcNS 峰較豬源肝 素低，ΔUA（2S）-GlcNS（6S）峰較豬源肝素高，表現(xiàn)出牛源肝素的特征。從二糖結(jié)構(gòu)看，牛源肝素與豬源肝素的結(jié)構(gòu)存在著較大差異，與文獻(xiàn)報道一致[12]。