吳錦蘭，李靜怡，白 云，鞏 僖，盧凱玲，崔 娜，熊建文

（1. 柳州工學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545616；2. 柳州市螺螄粉植物源性配料研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545616；3. 柳州市特色食品風(fēng)味與品質(zhì)控制工程技術(shù)研究中心，廣西柳州 545616）

酸筍是一種特色的傳統(tǒng)性發(fā)酵食品，在我國(guó)南方地區(qū)被普遍應(yīng)用于菜肴烹煮及作為各類食品的調(diào)味料。酸筍是以新鮮竹筍為原材料，通過(guò)食鹽進(jìn)行腌制，經(jīng)過(guò)漂水排氣后密封自然發(fā)酵制作而成[1-2]。發(fā)酵后的酸筍風(fēng)味獨(dú)特，含有豐富膳食纖維成分與多種人體所必需的氨基酸，有輔助降血脂、提高機(jī)體抵抗力等作用[3-4]。酸筍作為柳州螺螄粉的靈魂，近年來(lái)受疫情影響，在“宅經(jīng)濟(jì)”形勢(shì)下，袋裝螺螄粉銷售量迅速增長(zhǎng)，對(duì)于袋裝酸筍的需求量也日益增加[5]。袋裝酸筍原料水分含量高、營(yíng)養(yǎng)豐富，在發(fā)酵、生產(chǎn)操作、貯存等過(guò)程中易受到微生物污染而腐敗變質(zhì)，發(fā)生脹袋、變色、軟化、腐臭變質(zhì)等現(xiàn)象。部分腐敗微生物在一定適宜條件下，甚至?xí)ㄟ^(guò)分泌產(chǎn)生相應(yīng)的毒素，從而嚴(yán)重影響人類健康和生命安全[6]。在微生物污染中，霉菌污染是其中最主要、影響最大、危害也最大的污染[7-8]。目前，有關(guān)食品霉菌污染分析及控制的研究已經(jīng)開(kāi)展。岳曉禹等人[9]對(duì)貯藏玉米中的腐敗霉菌進(jìn)行了分離，得到一株優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌M13，進(jìn)一步鑒定為米曲霉（Aspergillus oryzae），為糧食的科學(xué)貯藏和食品安全控制提供參考。姚衛(wèi)蓉等人[10]對(duì)焙烤食品的腐敗霉菌進(jìn)行了研究，表明導(dǎo)致焙烤食品發(fā)霉的菌種主要是曲霉菌和青霉菌。張容鵠等人[11]對(duì)檳榔干果貯藏中優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌進(jìn)行了分離和鑒定，得出2 種優(yōu)勢(shì)霉菌，分別鑒定為泡盛曲霉（Aspergillus awamori） 和灰綠曲霉（Aspergillus glaucus）。謝欣等人[12]從已發(fā)霉變質(zhì)的年糕中分離出優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌，初步鑒定為單端孢霉（Trichothecium）、青霉菌（Penicillium） 和曲霉菌（Aspergillus），并試用多種不同類型的防霉劑，結(jié)果表明脫氫醋酸鈉和肉桂精油結(jié)合使用，可達(dá)到抑菌、防腐和延長(zhǎng)年糕保質(zhì)期的目的。霉菌的種類和數(shù)量能基本反映食品的安全狀況，有效控制霉菌的生長(zhǎng)、繁殖對(duì)保持食品的安全與營(yíng)養(yǎng)非常重要。

目前，關(guān)于袋裝酸筍腐敗霉菌方面的研究甚少，為了預(yù)防和控制酸筍在腌制、生產(chǎn)和貯存中發(fā)生腐敗問(wèn)題，從腐敗變質(zhì)的袋裝酸筍中分離篩選得到優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌，并通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)結(jié)合的方法對(duì)腐敗霉菌進(jìn)行鑒定，分析腐敗霉菌的種屬特性，為袋裝酸筍生產(chǎn)工藝中篩選有效的抑菌劑及針對(duì)性的滅菌方法和優(yōu)化貯藏條件等方面提供一定參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

袋裝酸筍，市售，待其自然腐敗。

1.1.2 試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA（附加抗菌素）、真菌基因組DNA 提取試劑盒等，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

SQ810C 型自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋，上海嵐薈生物科技有限公司產(chǎn)品；LRH-150 型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Nikon Eclipse E200 型光學(xué)顯微鏡，上海衡浩儀器有限公司產(chǎn)品；L9800 型基因擴(kuò)增儀，北京萊普特科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DYY-6D 型電泳儀，北京六一儀器廠產(chǎn)品；GenoSens 1880 型凝膠成像分析系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌的分離純化

取已腐敗袋裝酸筍置于裝有適量的無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶中搖勻后進(jìn)行10 倍梯度稀釋，取適當(dāng)梯度的菌懸液200 μL 涂布于PDN 培養(yǎng)基中，于28 ℃條件下培養(yǎng)。待其長(zhǎng)出霉菌后，挑取形態(tài)各異的菌株進(jìn)一步分離純化，直至得到形態(tài)不同的單菌落并編號(hào)。

1.3.2 真菌菌株的形態(tài)學(xué)觀察

參考《真菌鑒定手冊(cè)》[13]進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.3 菌種分子生物學(xué)鑒定

（1） 菌體的培養(yǎng)與收集。將分離活化的菌株接種到PDA 液體培養(yǎng)基中，在28 ℃下以轉(zhuǎn)速200 r/min 振蕩培養(yǎng)6 d，得到的菌絲培養(yǎng)液通過(guò)抽濾后收集菌絲。

（2） 真菌總DNA 的提取。稱取50～100 mg 真菌菌絲后倒入液氨研磨成粉末，然后按照真菌基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總DNA。

（3） PCR 擴(kuò)增。以提取的霉菌DNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增待鑒定菌株的rDNA-ITS 區(qū)域，將最后得到的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

PCR 引物表見(jiàn)表1，ITS 基因PCR 反應(yīng)程序見(jiàn)表2，ITS 基因PCR 擴(kuò)增程序見(jiàn)表3。

表1 PCR 引物表

表2 ITS 基因PCR 反應(yīng)程序/μL

表3 ITS 基因PCR 擴(kuò)增程序/次

（4） rDNA-ITS 堿基序列分析。將檢測(cè)合格的擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI 網(wǎng)的BLAST 程序來(lái)搜索同源序列。

（5） 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析。挑選與靶目標(biāo)列相似性較高的參考序列，采用MEGA7.0 的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

（6） 菌種鑒定。根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育學(xué)結(jié)果，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗霉菌的分離純化

從腐敗袋裝酸筍中共分離純化出2 種主要的優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌，分別編號(hào)為F1、F2。在PDA 平板上28 ℃下培養(yǎng)7 d 后，菌株F1 菌落正面呈黃綠色，反面呈棕黑色，菌落中心有突起，質(zhì)地緊密，棉絮狀，生長(zhǎng)速度較慢，在PDA 平板上28 ℃下培養(yǎng)7 d 后直徑為15～20 mm（見(jiàn)圖1（a） 和（b））；菌株F2 菌落正面呈灰綠色四周呈白色，反面呈灰白色，菌落中心無(wú)突起，較平坦，質(zhì)地疏松，絨毛狀，生長(zhǎng)速度較快，在PDA 平板上28 ℃下培養(yǎng)7 d 后直徑為40～50 mm（見(jiàn)圖1（c） 和（d））。

在PDA 平板上28 ℃培養(yǎng)7 d 后菌落形態(tài)見(jiàn)表4，二種腐敗霉菌的菌落形態(tài)圖見(jiàn)圖1。

表4 在PDA 平板上28 ℃培養(yǎng)7 d 后菌落形態(tài)

圖1 二種腐敗霉菌的菌落形態(tài)圖

2.2 優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌的顯微結(jié)構(gòu)

菌株在顯微鏡下的形態(tài)見(jiàn)圖2。

圖2 菌株在顯微鏡下的形態(tài)

將分離得到的2 種目標(biāo)菌株進(jìn)行顯微觀察。由圖2 可知，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，菌株F1 的菌絲有橫隔，分生孢子頭呈分枝根狀，分生孢子鏈生呈寬圓柱或廣橢圓形，壁較平滑；菌株F2 的菌絲有橫隔，分生孢子頭呈球狀，分生孢子近球形或橢圓形，壁稍光滑。

2.3 優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌的的分子學(xué)鑒定結(jié)果

優(yōu)勢(shì)霉菌的PCR 產(chǎn)物電泳圖見(jiàn)圖3。

通過(guò)PCR 擴(kuò)增，得到優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌的rDNA-ITS片段。由圖3 可知，霉菌F1、F2 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物均在500～750 bp 出現(xiàn)明顯目標(biāo)條帶，ITS 序列分別為525 bp和555 bp，達(dá)到PCR 擴(kuò)增預(yù)期結(jié)果。

圖3 優(yōu)勢(shì)霉菌的PCR 產(chǎn)物電泳圖

將目標(biāo)菌株的rDNA-ITS 片段為模板，通過(guò)Blast 檢索進(jìn)行序列比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明，菌株F1 與枝狀枝孢霉（Cladosporium cladosporioides） 親緣關(guān)系最近，達(dá)99.43%；菌株F2 與煙曲霉（Aspergillus fumigatus） 親緣關(guān)系最近，達(dá)99.31%。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果可知菌株F1 為枝狀枝孢霉（Cladosporium cladosporioides），菌株F2 為煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。

基于rDNA-ITS 基因序列菌株F1 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖4，基于rDNA-ITS 基因序列菌株F2 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖5。

圖4 基于rDNA-ITS 基因序列菌株F1 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖5 基于rDNA-ITS 基因序列菌株F2 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 結(jié)論

主要分離出了袋裝酸筍中的腐敗霉菌，通過(guò)傳統(tǒng)的真菌形態(tài)特征和顯微鏡觀察對(duì)分離出的菌株作了初步的鑒定，然后對(duì)純化菌株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增rDNA-ITS 序列并測(cè)序和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)發(fā)育樹(shù)，結(jié)合分子生物學(xué)法，最終確定了導(dǎo)致袋裝酸筍腐敗的菌株的種屬。袋裝酸筍中的優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌主要為枝狀枝孢霉（Cladosporium cladosporioides） 與煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。其中，煙曲霉是常見(jiàn)食品腐敗霉菌，嗜高溫，在45 ℃或更高的溫度下生長(zhǎng)茂盛，會(huì)引起食品的快速腐敗變質(zhì)，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)大量損失[14]。袋裝酸筍在工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中，在不影響食品風(fēng)味的條件下，可以從包裝條件及貯存溫度等方面抑制優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌的生長(zhǎng)，從而達(dá)到延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期的目的，為今后防止袋裝酸筍在生產(chǎn)加工及銷售貯藏中腐敗變質(zhì)，選擇適宜的殺菌保鮮方式提供一定參考依據(jù)。