孔萌，白月霞，劉紅真，劉威，劉傳陽(yáng)，張士松

1 山東大學(xué)附屬兒童醫(yī)院（濟(jì)南市兒童醫(yī)院）普外科，濟(jì)南 250022；2 山東大學(xué)附屬兒童醫(yī)院（濟(jì)南市兒童醫(yī)院）病理科

膽管閉鎖是一種嚴(yán)重的小兒膽管疾病，病死率較高［1-2］。盡管Kasai 手術(shù)能夠解除部分患兒膽管梗阻，但肝纖維化持續(xù)性進(jìn)展是膽管閉鎖預(yù)后較差的重要因素［3］。目前關(guān)于膽管閉鎖發(fā)病的具體原因尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)該病可能與遺傳易感性、圍產(chǎn)期病毒感染、炎癥因素、免疫損傷和血管源性等因素有關(guān)［4］?？缒まD(zhuǎn)運(yùn)蛋白39A（TMEM39A）是跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的一員［5］。遺傳學(xué)研究證實(shí)，TMEM39A在原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）進(jìn)展中起著重要作用，而PBC 是一種以非化膿性膽管炎、肝纖維化及膽汁淤積性肝硬化為特征的慢性自身免疫性肝?。?］。最新研究發(fā)現(xiàn)，TMEM39A有調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和促進(jìn)前膠原蛋白的產(chǎn)生及分泌等功能，而膠原蛋白產(chǎn)生過(guò)多會(huì)加速器官衰老和組織纖維化［7］。關(guān)于TMEM39A是否參與膽管閉鎖發(fā)生發(fā)展及TMEM39A在肝臟中的表達(dá)情況，目前尚不明確。為此，本研究觀察了膽管閉鎖患兒肝臟組織中TMEM39A 的表達(dá)變化，初步探討TMEM39A與膽管閉鎖發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020 年1 月—2022 年8 月山東大學(xué)附屬兒童醫(yī)院收治的膽管閉鎖患兒30 例納入病例組，男15 例、女15 例，年齡28 ～ 90（45 ± 5）d，患兒均于術(shù)前診斷為膽管系統(tǒng)疾病，術(shù)中經(jīng)膽管造影和術(shù)后病理確診為膽管閉鎖，排除合并其他膽管閉鎖相關(guān)疾病者。由于受醫(yī)學(xué)倫理限制，無(wú)法獲取患兒正常肝臟作為對(duì)照，本研究在參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)［8-9］基礎(chǔ)上選取同期收治的先天性膽總管囊腫患兒30 例為對(duì)照組，男12 例、女18 例，年齡2 ～ 96（42 ± 1）個(gè)月，患兒經(jīng)手術(shù)確診為先天性膽總管囊腫且術(shù)后病理肝臟未見纖維化，患兒肝功能、膽紅素指標(biāo)均正常，排除合并其他肝功能、膽紅素異常的膽管系統(tǒng)疾病者。術(shù)中用組織剪分別剪取兩組患兒肝右葉前緣組織（約黃豆大小），電凝肝臟創(chuàng)面充分止血。部分肝組織置于4%甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋、4 μm 厚連續(xù)切片，60 ℃烘烤90 min，用于免疫組化染色。其余肝組織儲(chǔ)存于液氮罐中，用于Western blotting 和RT-qPCR 檢測(cè)。本研究經(jīng)山東大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批編號(hào)SDFE-IRB/P-2022023）。入組患兒家長(zhǎng)對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 肝臟組織中TMEM39A蛋白檢測(cè)

1.2.1 免疫組化法 取兩組4 μm厚石蠟切片脫蠟至水，放入檸檬酸鈉溶液高壓抗原修復(fù)3 min，冷卻至室溫后用3% H2O237 ℃孵育10 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次，羊血清封閉抗原30 min；滴加一抗TMEM39A（1∶200 稀釋），4 ℃冰箱過(guò)夜，次日取出切片后PBS 沖洗3 次；滴加二抗（1∶1 000 稀釋），37 ℃孵育30 min，PBS 沖洗3 次；二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染后脫水、透明、封片；顯微鏡下觀察切片，采用Image Pro Plus6.0 進(jìn)行半定量分析，計(jì)算光密度值，取5 個(gè)視野的平均值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 Western blotting 法 從液氮中取出肝臟組織后，用RIPA 裂解液進(jìn)行裂解并提取總蛋白，用二喹啉甲酸法測(cè)蛋白濃度；稀釋并定量蛋白樣品，取20 μL 進(jìn)行電泳并恒流轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜上；加多克隆抗體TMEM39A 一抗（1∶1 000 稀釋）和內(nèi)參β肌動(dòng)蛋白抗體（1∶10 000稀釋），4 ℃過(guò)夜，次日TBST清洗；加二抗（1∶10 000 稀釋）室溫孵育1 h，TBST 洗膜，顯色劑顯影；采用化學(xué)發(fā)光法對(duì)條帶灰度值進(jìn)行掃描，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.3 肝臟組織中TMEM39A mRNA 檢測(cè) 采用TRIzol 法提取肝臟組織總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定濃度及純度。總RNA 質(zhì)量合格后，依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明對(duì)RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)NCBI Genbank 中提供的基因全長(zhǎng)序列，用Primer-BLAST 軟件設(shè)計(jì)目的基因序列。TMEM39A 上游引物序列為5'-GCAGCATACGGGGCATAAGA-3'，下游引物序列為5'-TTACCCACCTTAGACCACCCA-3'，目的片段大小為354 bp；內(nèi)參GAPDH 上游引物序列為5'-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'，下游引物序列為5'-TTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'，目的片段大小為127 bp。引物由北京擎科生物公司合成。按照SYBR Green 10 μL 體系置于熒光定量PCR 儀中 進(jìn) 行PCR 反 應(yīng)。PCR 反 應(yīng) 條 件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組肝臟組織中TMEM39A 蛋白表達(dá)比較 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，TMEM39A 蛋白主要定位于肝細(xì)胞的胞質(zhì)，胞核不著色；病例組TMEM39A 蛋白在匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，相對(duì)表達(dá)量為0.695 ± 0.137；對(duì)照組TMEM39A 蛋白在肝細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)弱陽(yáng)性，相對(duì)表達(dá)量為0.375 ± 0.096；病例組肝臟組織中TMEM39A 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組（t=10.426，P＜0.05）。見OSID碼圖1。Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，病例組、對(duì)照組肝臟組織中TMEM39A 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.624 ± 0.082、0.352 ± 0.082，病例組高于對(duì)照組（t=12.188，P＜0.05）。見OSID碼圖2。

2.2 兩組肝臟組織中TMEM39A mRNA 表達(dá)比較 病例組、對(duì)照組肝臟組織中TMEM39A mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為5.724 ± 1.490、2.338 ± 0.984，病例組高于對(duì)照組（t=10.382，P＜0.05）。

3 討論

膽管閉鎖的具體病因尚未完全闡明。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為該病可能與圍生期病毒感染（如巨細(xì)胞病毒感染）、遺傳易感性、炎癥反應(yīng)、血管源性因素及免疫損傷有關(guān)［10］。肝臟持續(xù)進(jìn)行性纖維化是膽管閉鎖的典型特征［11］。在肝纖維化過(guò)程中，肝星狀細(xì)胞是主要的肌成纖維細(xì)胞祖細(xì)胞，因此是成纖維反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞［12］。在正常肝臟中，肝星狀細(xì)胞是靜止的、不增殖的；當(dāng)肝臟發(fā)生損傷時(shí)，肝星狀細(xì)胞被激活，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞。在此過(guò)程中，肝星狀細(xì)胞的增殖能力、趨化能力、成纖維能力增強(qiáng)，凋亡能力及基質(zhì)降解能力減弱，同時(shí)表達(dá)高水平的α 平滑肌肌動(dòng)蛋白，產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成分（包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白、纖維連接蛋白等）和促炎介質(zhì)［13］。膠原蛋白是結(jié)締組織的主要分子成分，是動(dòng)物中表達(dá)最豐富的蛋白質(zhì)。膠原蛋白的產(chǎn)生和分泌失調(diào)會(huì)導(dǎo)致多種疾病，包括自身免疫性疾病、脆性骨病、器官衰老和組織纖維化等。膠原蛋白的生物合成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括前膠原基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯、翻譯后修飾、在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)組裝成前膠原三聚體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡分泌、細(xì)胞外肽裂解和交聯(lián)合成膠原纖維［14-15］。盡管學(xué)者們一直致力于研究膽管閉鎖病因和肝纖維化治療方法，但目前膽管閉鎖尚無(wú)特效治療策略和治療靶點(diǎn)。因此需要進(jìn)一步探索膽管閉鎖發(fā)病的詳細(xì)機(jī)制，包括在發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因和蛋白。

TMEM 是一種存在于生物體中的完整膜蛋白，是細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體的組成部分，許多TMEMs 可作為允許特定元素通過(guò)生物膜運(yùn)輸?shù)耐ǖ溃?6］。TMEM39 蛋白家族包括人TMEM39A 和線蟲TMEM39。TMEM39A 是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的跨膜蛋白，其蛋白序列由488個(gè)氨基酸和8個(gè)跨膜螺旋片段組成，通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥、干擾素信號(hào)通路、自身抗體及線粒體的自噬作用來(lái)發(fā)揮作用［17］。遺傳學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)，TMEM39A 主要與PBC、橋本甲狀腺炎等自身免疫性疾病的發(fā)病有關(guān)［18］。PBC 是一種T 細(xì)胞介導(dǎo)的小葉內(nèi)膽管上皮細(xì)胞損傷的慢性自身免疫性肝病，肉芽腫破壞和膽管細(xì)胞壞死導(dǎo)致炎癥浸潤(rùn)，最終導(dǎo)致膽汁淤積和肝纖維化［19］。小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，PBC 免疫耐受的丟失可能與IL-9/IL-9R 軸的作用有關(guān)。IL-9R 是TMEM39A 的一個(gè)重要作用位點(diǎn)，TMEM39A 可能會(huì)影響IL-9/IL-9R 軸的作用，使PBC患者失去免疫耐受［20］。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，橋本甲狀腺炎的發(fā)病可能TMEM39A 有關(guān)［21］。上述研究結(jié)果提示，TMEM39A 很可能參與了組織慢性纖維化的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，TMEM39A 主要表達(dá)于匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，且TMEM39A mRNA 和蛋白在膽管閉鎖肝臟組織中的表達(dá)量高于正常肝臟組織，提示膽管閉鎖的發(fā)生可能與肝臟組織中TMEM39A 的高表達(dá)密切相關(guān)。ZHANG 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，TMEM39A 可調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和前膠原蛋白的產(chǎn)生、分泌和運(yùn)輸，而前膠原蛋白堆積可間接促進(jìn)組織纖維化。這項(xiàng)研究結(jié)果與本研究相一致，提示TMEM39A 高表達(dá)于肝臟組織中，并可能與膽管閉鎖和肝組織進(jìn)行性纖維化密切相關(guān)。我們前期研究通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)出SPP1 和ANKRD1 與膽管閉鎖的發(fā)生有關(guān)，兩者有望作為膽管閉鎖的早期診斷標(biāo)志物［23］。我們的另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，LECT2 在膽管閉鎖患兒肝臟中的表達(dá)明顯高于正常肝臟，LECT2 在人肝星狀細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)能促進(jìn)纖維化的發(fā)生，推測(cè)LECT2 可能與膽管閉鎖的發(fā)病有關(guān)，并且能夠促進(jìn)膽管閉鎖肝纖維化的進(jìn)展［24］。目前TMEM39A 蛋白促進(jìn)膽管閉鎖肝纖維化的詳細(xì)作用機(jī)制尚不明確，結(jié)合以上結(jié)果，我們推測(cè)TMEM39A 可能是通過(guò)加強(qiáng)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與囊泡外蛋白結(jié)合，促進(jìn)前膠原蛋白的產(chǎn)生、分泌和運(yùn)輸，而前膠原蛋白產(chǎn)生過(guò)多會(huì)使細(xì)胞外基質(zhì)大量堆積，從而誘發(fā)肝纖維化。當(dāng)然，這還需要大量的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，膽管閉鎖患兒肝臟組織中TMEM39A 蛋白及mRNA 表達(dá)升高，TMEM39A 異常表達(dá)可能與膽管閉鎖的發(fā)病和肝纖維化有關(guān)，這也為我們后續(xù)通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)深入研究TMEM39A 在膽管閉鎖發(fā)病中的作用機(jī)制提供了新的思路。同時(shí)，以上研究發(fā)現(xiàn)也為膽管閉鎖進(jìn)行性肝纖維化治療靶點(diǎn)的探索提供了新的方向，為延緩或終止肝纖維化的相關(guān)研究提供了參考。