付加煜，朱詩宇，奚鴻杰，華迪，邱玲，林建國

1 南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南京 211166；2 江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所 國家衛(wèi)生健康委員會核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

免疫治療是惡性腫瘤治療的重要手段。使用抗體阻斷免疫檢查點(diǎn)的免疫治療已被證實(shí)在晚期惡性腫瘤中有效，被批準(zhǔn)用于多種惡性腫瘤的治療［1-5］。然而目前僅有少部分腫瘤患者可以從免疫治療中受益，不當(dāng)治療還可誘發(fā)免疫相關(guān)不良反應(yīng)（如肝炎、結(jié)腸炎等），甚至?xí)鸹颊咚劳?。因此，在免疫治療早期評估患者的治療反應(yīng)，不僅可以最大限度地發(fā)揮免疫治療的作用，還能為治療不響應(yīng)的患者及時(shí)尋找替代策略［6-9］。免疫治療的療效可以通過檢測體內(nèi)免疫相關(guān)生物標(biāo)志物來進(jìn)行評估［10-11］。顆粒酶B 是一種由細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（CTLs）的細(xì)胞質(zhì)顆粒釋放的絲氨酸蛋白酶，在靶細(xì)胞中可誘導(dǎo)程序性死亡或凋亡［12-14］。當(dāng)CTLs 識別目標(biāo)細(xì)胞時(shí)，顆粒酶B被釋放，進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)后，觸發(fā)Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，并通過直接和間接的層壓處理及激活、線粒體滲透等方式，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡［15-17］。因此，顆粒酶B 不僅反映CTLs 在腫瘤區(qū)域的定位和表達(dá)水平，還直接反映CTLs 對腫瘤細(xì)胞的潛在殺傷能力，是一種可靠的免疫相關(guān)生物標(biāo)志物［18］。準(zhǔn)確檢測體內(nèi)顆粒酶B表達(dá)水平是免疫治療療效評估的關(guān)鍵。影像學(xué)技術(shù)能無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、定量地進(jìn)行全身動態(tài)成像［19-22］。靶向分子影像探針能夠準(zhǔn)確檢測免疫治療前后體內(nèi)顆粒酶B的表達(dá)水平。目前關(guān)于顆粒酶B的分子探針主要分為近紅外熒光（NIRF）探針和正電子發(fā)射斷層掃描（PET）探針兩類。NIRF 成像操作簡便，受背景的自發(fā)熒光影響較小，可提供較為準(zhǔn)確的顯像結(jié)果，但是其組織穿透能力較弱［23］。PET顯像具有組織穿透力強(qiáng)、靈敏度高、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，與電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）和核磁共振成像（MRI）聯(lián)合成像時(shí)可提供更為準(zhǔn)確的顯像結(jié)果，不過PET 需要借助放射性核素標(biāo)記分子探針，便捷性較差［24-26］?，F(xiàn)就靶向顆粒酶B 的分子影像探針的作用機(jī)制及應(yīng)用研究進(jìn)展綜述如下。

1 靶向顆粒酶B的NIRF探針的作用機(jī)制及應(yīng)用

根據(jù)作用機(jī)制，靶向顆粒酶B 的NIRF 探針主要分為可激活類和自組裝類?？杉せ铑怤IRF 探針是將熒光基團(tuán)與靶向肽序列相連接，在探針結(jié)構(gòu)末端引入熒光淬滅基團(tuán)，或在靶向肽兩端連接一對熒光共振對基團(tuán)，使得探針起初處于熒光信號關(guān)閉的狀態(tài)，隨后在體內(nèi)被顆粒酶B識別剪切靶向肽后，熒光信號開啟。自組裝類NIRF 探針是將靶向肽序列與熒光基團(tuán)連接，通過點(diǎn)擊縮合反應(yīng)后自組裝形成納米顆粒淬滅熒光，酶剪切后解組裝開啟熒光，或在體內(nèi)經(jīng)酶切后自組裝聚集增強(qiáng)熒光進(jìn)行顯像。

1.1 可激活類NIRF 探針CyGbPF和CyGbPP有學(xué)者通過在顆粒酶B 特異識別的多肽序列IEFD 和IEPD 上連接花菁染料（CyOH），構(gòu)建了NIRF 探針CyGbPF和CyGbPP［27-30］。該類探針的作用機(jī)制是Cy-OH 在連接上IEFD 或IEPD 及對氨基苯甲醇（PABA）后，其氧原子供電子能力減弱，分子探針最初處于熒光淬滅狀態(tài)，將底物序列剪切后，自毀基團(tuán)PABA 離去使得淬滅的熒光重新被開啟。CyGbPF和CyGbPP被注射進(jìn)入體內(nèi)后可被動靶向腫瘤，被腫瘤微環(huán)境中的顆粒酶B識別剪切，導(dǎo)致NIRF信號增強(qiáng)。

體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，兩個(gè)熒光探針均具有較好的生物安全性和靶向特異性。研究者分別用NLG919、R848、BMS-1、Pexidartinib 和BEC五種免疫治療藥物對乳腺癌（4T1）小鼠進(jìn)行治療，在治療過程中注射CyGbPF和CyGbPP進(jìn)行顯像以監(jiān)測療效，結(jié)果顯示，免疫治療后，腫瘤部位熒光信號明顯增強(qiáng)，而其余組織部位熒光信號較弱。體外免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)分析也證實(shí)，探針在體內(nèi)成像中的熒光信號強(qiáng)度也與其他免疫相關(guān)生物標(biāo)志物如CD8+、CD4+受體存在相關(guān)性。此外，CyGbPF和CyGbPP還具有高腎臟清除效率，使得無創(chuàng)的光學(xué)尿液分析較免疫熒光染色更方便。CyGbPF和CyGbPP作為第一種能夠?qū)崟r(shí)成像和進(jìn)行活體動物體內(nèi)顆粒酶B 尿液分析的NIRF探針，在推進(jìn)熒光成像在免疫治療中的應(yīng)用具有深遠(yuǎn)意義。

1.2 可激活類NIRF 探針GNR NGUYEN 等［31］在IEPD 兩端連接一對熒光共振對，隨后與納米聚合主鏈PIMA 相連使其形成納米聚集物，最終獲得探針GNR。在顆粒酶B 存在的條件下，GNR 結(jié)構(gòu)上的IEPD 會被剪切，造成分子結(jié)構(gòu)斷裂，從而使供體基團(tuán)的熒光重新被開啟，并通過熒光信號強(qiáng)度來反映顆粒酶B表達(dá)水平。由于實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)，GNR 進(jìn)入體內(nèi)后會聚集在腫瘤部位，而在其他組織中則會被快速清除。該研究還在GNR 的結(jié)構(gòu)上偶聯(lián)PD-L1抗體，納米顆粒聚集在腫瘤部位后，將阻斷PD-L1/PD-1通路，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)對腫瘤的免疫治療和療效監(jiān)測。

GNR在體內(nèi)外均具有良好的顆粒酶B靶向特異性和生物相容性。有學(xué)者對荷瘤小鼠進(jìn)行免疫治療，發(fā)現(xiàn)對治療響應(yīng)的小鼠結(jié)直腸癌（MC-38）組織有明顯的熒光信號開啟和增強(qiáng)，而在對治療不響應(yīng)的小鼠黑色素瘤（B16/F10）組織中則沒有檢測到熒光信號，說明該探針能夠有效區(qū)分治療響應(yīng)者和非響應(yīng)者。此外，離體組織分析結(jié)果表明，探針在體內(nèi)成像的熒光信號強(qiáng)度與顆粒酶B 表達(dá)水平高度一致。與腫瘤體積及形態(tài)監(jiān)測相比，GNR 的影像結(jié)果可以提供更早、更全面的腫瘤整體免疫反應(yīng)信息。該納米探針也可在未來臨床試驗(yàn)中偶聯(lián)其他免疫藥物，在進(jìn)行免疫治療的同時(shí)監(jiān)測療效。

1.3 自組裝類NIRF 探針G-SNAT-Cy5 XIE 等［32］在一個(gè)多功能骨架TESLA上連接IEFD，設(shè)計(jì)了分子探針G-SNAT-Cy5，通過分子內(nèi)點(diǎn)擊縮合自組裝策略來增強(qiáng)熒光信號進(jìn)行成像。在被顆粒酶B識別剪切后，TESLA 骨架上的半胱氨酸基團(tuán)與芳香腈發(fā)生點(diǎn)擊縮合，形成分子內(nèi)環(huán)化產(chǎn)物。由于疏水性和π-π相互作用，環(huán)化產(chǎn)物形成聚集體，從而延長探針在靶點(diǎn)部位的保留時(shí)間，以達(dá)到增強(qiáng)顯像效果的目的。

有學(xué)者對結(jié)直腸癌（CT-26）小鼠進(jìn)行抗PD-1 和抗CTLA4 聯(lián)合治療，采用G-SNAT-Cy5 監(jiān)測療效，結(jié)果顯示，聯(lián)合療法引發(fā)了異質(zhì)性反應(yīng)，治療小鼠出現(xiàn)了響應(yīng)和非響應(yīng)者。響應(yīng)者僅在治療的最初腫瘤體積有所增加，隨后持續(xù)縮小，而未經(jīng)治療的小鼠和經(jīng)治療無響應(yīng)的小鼠腫瘤則保持持續(xù)增長。該研究中，三組小鼠體內(nèi)的CTLs 均被激活，但只有治療響應(yīng)小鼠的腫瘤中有明顯的CTLs 浸潤和顆粒酶B 活性。在無響應(yīng)和未治療組中，只在腫瘤最外側(cè)一圈有明顯的熒光信號，可能代表腫瘤微環(huán)境在逐漸排斥免疫細(xì)胞；而在對治療響應(yīng)的小鼠腫瘤中則沒有觀察到該現(xiàn)象。與另外兩個(gè)自組裝熒光探針Dluciferin 和GBLI2 相比，G-SNAT-Cy5 雖然在總體上顯示出了相似的分布，但其在腫瘤內(nèi)熒光信號更強(qiáng)且對比度得到改善，這表明該探針在監(jiān)測惡性腫瘤免疫治療療效及協(xié)調(diào)免疫治療方面具有一定價(jià)值。

1.4 自組裝類NIRF 探針Cy5.5-CBT-NPs XU等［33］設(shè)計(jì)合成的Cy5.5-CBT-NPs同樣是基于半胱氨酸和氰基點(diǎn)擊縮合自組裝策略。與G-SNAT-Cy5 不同的是，該研究首先合成了一個(gè)小分子熒光探針Cy5.5-CBT，裸露出其結(jié)構(gòu)上的1，2-氨基硫醇基團(tuán)，與另一個(gè)Cy5.5-CBT 的CBT 部分點(diǎn)擊縮合，形成環(huán)狀二聚體產(chǎn)物Cy5.5-2CBT，隨后通過分子間疏水相互作用和π-π 堆積形成納米探針Cy5.5-CBT-NPs。納米顆粒的熒光最初由于聚集作用是淬滅的，被顆粒酶B 識別剪切后會導(dǎo)致二聚體產(chǎn)物的斷裂，造成納米顆粒解組裝，使熒光信號重新開啟。

體外研究中，有學(xué)者通過透射電鏡圖像、熒光光譜、熒光壽命譜和HPLC 分析，證實(shí)了Cy5.5-CBTNPs 的還原誘導(dǎo)自組裝和顆粒酶B 引發(fā)的解組裝，并伴有熒光淬滅和開啟。細(xì)胞成像結(jié)果表明，使用CD8+T 淋巴細(xì)胞對B16-OVA 腫瘤細(xì)胞進(jìn)行治療后，Cy5.5-CBT-NPs 能夠?qū)崟r(shí)、靈敏地檢測CD8+T 淋巴細(xì)胞的反應(yīng)。體內(nèi)顯像結(jié)果表明，Cy5.5-CBT-NPs能夠?qū)γ庖咧委燀憫?yīng)的腫瘤進(jìn)行顯示。體外免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)，開啟的NIFR 熒光與CTLs 的腫瘤內(nèi)浸潤和顆粒酶B表達(dá)水平有相關(guān)性。由于顆粒酶B 的活性與CTLs 對腫瘤細(xì)胞的殺傷強(qiáng)度直接相關(guān)，因此，Cy5.5-CBT-NPs 可直接用來監(jiān)測免疫治療期間腫瘤微環(huán)境中CTLs的活性。

2 靶向顆粒酶B的PET探針的作用機(jī)制及應(yīng)用

靶向顆粒酶B 的PET 探針設(shè)計(jì)思路是在靶向肽上連接標(biāo)記基團(tuán)以引入放射性核素，主要分為兩類，分別是酶結(jié)合類PET探針和酶剪切類PET探針。酶結(jié)合類探針作用機(jī)制為：探針進(jìn)入體內(nèi)被酶識別后，結(jié)構(gòu)上的靶向肽與顆粒酶B 結(jié)合，從而使放射性信號保留在該部位進(jìn)行PET顯像。酶剪切類探針作用機(jī)制為：探針在被顆粒酶B識別后，靶向肽序列會被其剪切，造成其結(jié)構(gòu)斷裂，隨后通過與細(xì)胞膜結(jié)合或自組裝等方式保留在靶部位進(jìn)行成像。

2.1 酶 結(jié) 合類PET 探 針68Ga-NOTA-GZP 和［18F］AlF-mNOTA-GZP 研究者在IEFD 后連接小型靈活接頭Gly-Gly-Gly，隨后連接金屬螯合劑1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷-1，4，7-三乙酸，以此合成NOTA-GZP。NOTA-GZP通過68Ga和18F標(biāo)記引入放射性核素獲得探 針68Ga-NOTA-GZP 和［18F］AlF-mNOTA-GZP［34-37］。68Ga 半衰期為68 min，18F 半衰期為109 min，二者均與短肽的快速藥代動力學(xué)相匹配。體外酶抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了NOTA-GZP 對顆粒酶B 具有高親和力和高特異性，68Ga-NOTA-GZP 和［18F］AlF-mNOTA-GZP 均具有較高的放射性化學(xué)產(chǎn)率和放射化學(xué)純度。在抗PD-1 單一療法、抗PD-1 與抗CLTA-4 聯(lián)合治療的CT-26 荷瘤小鼠體內(nèi)PET 顯像研究中，68Ga-NOTAGZP 在兩組小鼠腫瘤部位均有較高的攝取，且在聯(lián)合免疫治療組中攝取最高，而在未接受治療組的腫瘤部位沒有明顯攝取。68Ga-NOTA-GZP 在腎臟和膀胱中的同樣也存在高攝取，可能是由于其主要通過腎臟代謝。

有學(xué)者對結(jié)直腸癌CT-26、MC-38小鼠進(jìn)行化療聯(lián)合免疫治療后，注射［18F］AlF-mNOTA-GZP進(jìn)行顯像，PET-CT/MRI 圖像的腫瘤定量分析顯示，不同治療組小鼠探針的攝取有明顯差異，根據(jù)成像結(jié)果能夠區(qū)分治療應(yīng)答者與無應(yīng)答者。研究者在未治療組、無應(yīng)答者及未抑制腫瘤生長的治療組中觀察到［18F］AlF-mNOTA-GZP低攝取，而在成功抑制腫瘤生長的治療組中觀察到更高的攝取。此外，與CT-26小鼠腫瘤相比，在MC-38 小鼠腫瘤中觀察到更高的［18F］AlF-mNOTA-GZP攝取，且未治療組和無應(yīng)答者的背景攝取量也更高。

上述研究結(jié)果表明，68Ga-NOTA-GZP 和［18F］AlF-mNOTA-GZP 均有很好的靶向顆粒酶B 的能力，可有效預(yù)測免疫治療的療效。然而，上述兩種探針在腫瘤中的攝取較低，同時(shí)可能受腫瘤表型異常的影響，需要進(jìn)一步闡明相關(guān)原因。

2.2 酶結(jié)合類PET 探針68Ga-grazytracer ZHOU等［38］根據(jù)IEPD設(shè)計(jì)并合成了PET探針68Ga-grazytracer，與NOTA-GZP 不同的是，68Ga-grazytracer 結(jié)構(gòu)上含有一個(gè)有助于提高體內(nèi)穩(wěn)定性的剛性三環(huán)肽模擬支架和可以抑制與其他蛋白酶反應(yīng)的非醛藥效團(tuán)。荷瘤小鼠模型研究結(jié)果顯示，與68Ga-NOTA-GZP 相比，68Ga-grazytracer在荷瘤小鼠中顯示出顯著的腫瘤攝取并增強(qiáng)了成像對比度。這可能是由于剛性三環(huán)肽模擬支架和1，2，3-三唑藥效團(tuán)更耐水解和酶裂解，提高了68Ga-grazytracer在體內(nèi)的代謝穩(wěn)定性。學(xué)者們還進(jìn)行了初步臨床研究，在5 例腫瘤患者中，68Ga-Grazytracter的PET顯像能夠較好地監(jiān)測免疫治療效果。然而，由于招募患者數(shù)量有限，后續(xù)還需要進(jìn)行更多的臨床研究以提供更為全面和可靠的數(shù)據(jù)。

68Ga-grazytracer 在監(jiān)測多種免疫療法在不同腫瘤中的療效方面有一定優(yōu)勢，在評價(jià)腫瘤對免疫治療的響應(yīng)方面效果優(yōu)于18F-FDG。初步臨床研究證實(shí)了68Ga-grazytracer PET 顯像在腫瘤免疫治療療效監(jiān)測中的應(yīng)用價(jià)值，為未來進(jìn)行更大規(guī)模的臨床研究提供了基礎(chǔ)。

2.3 酶剪切類PET 探針64Cu-GRIP B ZHAO 等［21］根據(jù)一種名為相互作用肽（RIP）的長鏈肽設(shè)計(jì)了一個(gè)靶向顆粒酶B 的PET 探針64Cu-GRIP B。GRIP B的具體結(jié)構(gòu)是在IEPD 上連接一個(gè)與放射性同位素偶聯(lián)的無毒抗菌肽（AMP），以及一段阻止AMP 轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪龢?gòu)象的肽鏈，這使得其能夠保持直鏈。在被細(xì)胞外的顆粒酶B 剪切后，放射性標(biāo)記的AMP 被釋放，發(fā)生構(gòu)象變化形成螺旋結(jié)構(gòu)，并沉積在附近的細(xì)胞膜內(nèi)，緊密結(jié)合到磷脂雙分子層上。與上述兩類短肽探針有所不同，GRIP B 使用放射性核素64Cu 進(jìn)行標(biāo)記以獲得64Cu-GRIP B，64Cu 的半衰期為12.7 h，這與長鏈肽的藥代動力學(xué)較為匹配。并且，該探針可在胞外被識別并剪切后結(jié)合在細(xì)胞膜上，不會進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

64Cu-GRIP B 具有較高的放射性標(biāo)記產(chǎn)率和純度，與重組人顆粒酶B 孵育30 min 后會完全轉(zhuǎn)變?yōu)榧羟挟a(chǎn)物，同時(shí)在小鼠血清中也有較高的穩(wěn)定性。探針在小鼠體內(nèi)的血漿清除半衰期約為8 min，主要通過腎臟代謝。學(xué)者們對CT26 小鼠進(jìn)行抗PD1 和抗CTLA4 聯(lián)合治療，治療后注射64Cu-GRIP B，靜態(tài)圖像的感興趣區(qū)分析顯示，治療組64Cu-GRIP B 的腫瘤攝取在注射后2 h已明顯高于未治療組，且24 h后依舊有明顯的放射性積聚。通過動態(tài)PET采集圖像得到的時(shí)間—活性曲線顯示，治療組小鼠腫瘤中64Cu-GRIP B 積累迅速，注射后10 min 內(nèi)達(dá)到5% ID/g。然而，未治療組小鼠腫瘤中的放射性示蹤劑攝取量明顯較低，且不會隨時(shí)間變化。注射后2 h的生物分布研究結(jié)果顯示，治療組小鼠脾臟攝取也顯著增加，這與全身免疫對T 細(xì)胞的刺激有關(guān)。放射自顯影和免疫熒光結(jié)果顯示，組織中探針的結(jié)合區(qū)域與顆粒酶B 和T 細(xì)胞標(biāo)志物CD3 的表達(dá)一致。此外，由于該探針在淋巴組織中也可以顯示免疫細(xì)胞激活，研究者還將該探針應(yīng)用到了肺部炎癥模型的相關(guān)研究中。以上結(jié)果表明，64Cu-GRIP B 可以通過PET 成像對體內(nèi)顆粒酶B 的活性進(jìn)行評估，有望在未來應(yīng)用于臨床試驗(yàn)。

總之，顆粒酶B 檢測為惡性腫瘤免疫治療早期療效評估提供了可靠的依據(jù)，利用分子影像學(xué)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、無創(chuàng)監(jiān)測，有助于及時(shí)調(diào)整治療方案。上述靶向顆粒酶B 的NIRF 探針和PET 探針均具有較好的靶向特異性，而PET 探針由于成像方式的優(yōu)勢，其組織穿透力強(qiáng)，成像結(jié)果更為準(zhǔn)確，更適用于臨床轉(zhuǎn)化。但是這些分子探針也存在一定不足，如在靶部位的攝取較低、體內(nèi)不穩(wěn)定、易受體內(nèi)其他環(huán)境干擾等，對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性有一定影響?？偟膩碚f，這些相關(guān)研究為免疫治療療效評估提供了寶貴經(jīng)驗(yàn)。未來還會有更多靶向顆粒酶B的分子探針出現(xiàn)，為腫瘤免疫治療療效的精準(zhǔn)評估提供思路。