沈磊，張思航，周太成，韋嘉

1 昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院感染科，昆明 650000；2 云南大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室；3 云南大學(xué)附屬醫(yī)院感染科

盡管已有多種抗HBV 療法應(yīng)用于臨床，但HBV感染仍是全球主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題［1-2］。由于HBV的宿主范圍狹窄，導(dǎo)致建立理想的HBV 感染動(dòng)物模型成為難題。近年來(lái)，人源化小鼠模型引起了越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注［3-4］。人源化小鼠模型是一類攜帶人的功能基因、細(xì)胞、組織或器官的小鼠模型；人源化嵌合肝臟小鼠模型是具有肝損傷及免疫缺陷特點(diǎn)的小鼠模型，常通過(guò)手術(shù)、藥物或基因編輯來(lái)破壞小鼠肝細(xì)胞，再將人肝細(xì)胞在小鼠脾內(nèi)注射，移植的人肝細(xì)胞通過(guò)小鼠脾靜脈和門靜脈遷移到肝臟，并開始增殖以取代損傷的小鼠肝細(xì)胞，進(jìn)而形成嵌合肝臟小鼠［5］。與HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠模型、高壓水動(dòng)力注射小鼠模型及病毒載體介導(dǎo)小鼠模型相比，人源化嵌合肝臟小鼠模型可被HBV 成功感染，且支持完整的HBV 生命周期，可產(chǎn)生具有轉(zhuǎn)錄活性的共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA（cccDNA）［6-7］，是當(dāng)前HBV 研究及新藥研發(fā)的重要工具［8］?，F(xiàn)就HBV研究相關(guān)的人源化嵌合肝臟小鼠模型應(yīng)用進(jìn)展綜述如下，為相關(guān)研究中HBV易感動(dòng)物模型的選擇提供參考。

1 基于Alb-uPA小鼠的嵌合肝臟模型

Alb-uPA 轉(zhuǎn)基因小鼠是HECKEL 等于1990年研發(fā)，主要用于新生兒出血性疾病的研究［9］。該模型中，小鼠攜帶尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA），并由白蛋白（Alb）啟動(dòng)子控制。該模型通過(guò)上調(diào)小鼠體內(nèi)uPA 表達(dá)，導(dǎo)致小鼠形成嚴(yán)重的低纖維蛋白原血癥和肝細(xì)胞損傷。Alb-uPA 小鼠模型的肝損傷狀態(tài)為外源性肝細(xì)胞的植入創(chuàng)造了條件。在此背景下，研究人員將uPA轉(zhuǎn)基因小鼠與免疫缺陷鼠如無(wú)胸腺（nu/nu）裸 鼠、重 組 體 激 活 基 因2（Rag2）敲 除（Rag2-/-）小鼠或重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）小鼠進(jìn)行雜交，得到Alb-uPA/Rag2-/-或Alb-uPA/SCID 等免疫缺陷型肝損傷小鼠模型［10-11］。

該模型可被HBV 成功感染，且模型的構(gòu)建無(wú)外源性藥物干預(yù)，可適用于臨床抗HBV 相關(guān)藥物研究。KLUMPP 等［12］發(fā)現(xiàn)，在Alb-uPA/SCID 小鼠中，衣殼組裝調(diào)節(jié)劑NVR3-778 比恩替卡韋具有更高的抗病毒活性，可同時(shí)降低血清HBV DNA、HBV RNA水平。研究人員還利用該小鼠模型證明了HBV 感染不能誘導(dǎo)肝細(xì)胞干擾素應(yīng)答［13］。然而，該模型易導(dǎo)致新生小鼠出血及腎臟疾病，且小鼠繁殖效率低、移植時(shí)間窗窄，阻礙了Alb-uPA小鼠模型的應(yīng)用［14］。

2 Alb-rtTA/TRE-uPA嵌合肝臟小鼠模型

為優(yōu)化Alb-uPA 小鼠模型，SONG 等［15］將TREuPA 轉(zhuǎn)基因小鼠與Alb-rtTA 轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，構(gòu)建出Alb-rtTA/TRE-uPA 小鼠。在四環(huán)素強(qiáng)力霉素作用下，反義四環(huán)素轉(zhuǎn)錄活化因子（rtTA）與四環(huán)素應(yīng)答元件（TRE）結(jié)合并激活靶基因轉(zhuǎn)錄，uPA 在小鼠肝細(xì)胞中表達(dá)并引起廣泛肝損傷。在此基礎(chǔ)上，將Alb-rtTA/TRE-uPA 小鼠連續(xù)8 代回交到NRG（NOD背景的Rag2nullIl2rgnull小鼠）背景，獲得Alb-rtTA/TRE-uPA/Rag2null/Il2rgnull小鼠，簡(jiǎn)稱URG 小 鼠。在此模型中，可以通過(guò)調(diào)節(jié)Ad. TRE-uPA 及四環(huán)素強(qiáng)力霉素的劑量來(lái)控制肝損傷程度，實(shí)現(xiàn)肝損傷可控，以利于后續(xù)的人肝細(xì)胞體內(nèi)植入和增殖。

與原uPA 小鼠相比，URG 小鼠需要長(zhǎng)期使用外源性藥物四環(huán)素強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)肝損傷，但該模型實(shí)現(xiàn)了uPA 僅在肝內(nèi)可控性表達(dá)，成功解決了傳統(tǒng)Alb-uPA 嵌合小鼠模型的缺陷問(wèn)題，使其繁殖效率顯著提高，潛在出血情況減少，移植時(shí)間窗更加靈活，從而使該模型的應(yīng)用范圍更加廣泛。LI 等［16］通過(guò)URG 小鼠模型驗(yàn)證了肝細(xì)胞樣細(xì)胞的功能有效性，使肝功能衰竭的恢復(fù)成為可能。YANG 等［17］使用該小鼠模型發(fā)現(xiàn)組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶1的表達(dá)與HBV 復(fù)制呈正相關(guān)，并證實(shí)組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶1信號(hào)通路參與HBVcccDNA 小染色體的組裝和表觀遺傳調(diào)控。

3 FRG嵌合小鼠模型

2007 年，AZUMA 等［18］通過(guò)將延胡索乙酰乙酸水解酶（FAH）基因敲除小鼠（FAH-/-）與RAG2-/IL2RG-/-雙重免疫缺陷小鼠雜交，首次構(gòu)建出FAH-/-RAG2-/IL2RG-/-（FRG）小鼠。白細(xì)胞介素2（IL-2）受體γ鏈（IL-2Rγ）與淋巴細(xì)胞增殖活化及NK細(xì)胞的發(fā)育密切相關(guān)，將其敲除可使小鼠T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞的發(fā)育和功能嚴(yán)重受損，并完全阻斷NK 細(xì)胞的發(fā)育。富馬酰乙酰乙酸酯水解酶（FAH）是酪氨酸代謝過(guò)程中所必需的酶，其缺失會(huì)導(dǎo)致富馬酰乙酰乙酸酯在肝細(xì)胞中積累，后者對(duì)肝細(xì)胞具有毒性作用，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷［19］。為防止FRG 小鼠肝細(xì)胞中富馬酰乙酰乙酸酯過(guò)度積累，可通過(guò)口服2-（2-硝酸-4-三氟甲基苯甲酰）-1，3-環(huán)己基二酮（NTBC）來(lái)阻斷FAH 上游的羥苯基丙酮酸雙加氧酶活性，從而起到減輕肝損傷的作用［20］。

FRG 嵌合小鼠模型可以通過(guò)給予或停用NTBC來(lái)控制小鼠肝損傷程度，可以在任何鼠齡植入人肝細(xì)胞，并且可以連續(xù)多次植入［21］，人肝細(xì)胞嵌合率高達(dá)95%［20］。然而，F(xiàn)ah 小鼠也會(huì)因Ⅰ型酪氨酸血癥而發(fā)展為肝癌，并且需要在人源化后繼續(xù)或間歇性地進(jìn)行藥物治療以抑制肝癌的發(fā)展［22］。

4 TK-NOG嵌合小鼠模型

為了克服uPA/SCID 和FRG 小鼠的缺陷，日本學(xué)者將NOD/scid 小鼠和γ 鏈IL-2 受體敲除鼠進(jìn)行雜交，構(gòu)建出免疫缺陷NOD/Shi-scid（NOG）小鼠［23］。將單純皰疹病毒1 型胸苷激酶（HSVtk）表達(dá)片段顯微注射到NOD/Shi 品系小鼠受精卵中，構(gòu)建HSVtk轉(zhuǎn)基因小鼠，再將雌性轉(zhuǎn)基因小鼠與雄性NOG 小鼠交配，從而產(chǎn)生TK-NOG 小鼠。HSVtk 轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體包含小鼠白蛋白增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，HSVtk mRNA 在TK-NOG小鼠肝臟中選擇性表達(dá)，使TK-NOG小鼠發(fā)生特異性肝損傷［24］。

在TK-NOG 小鼠模型中，表達(dá)HSVtk 的小鼠肝細(xì)胞暴露于更昔洛韋后發(fā)生凋亡，使得移植的人肝細(xì)胞在小鼠肝臟中穩(wěn)定維持。該小鼠模型造模成功后，后續(xù)無(wú)需外源性藥物維持，且增加更昔洛韋劑量可提高人肝細(xì)胞移植率。該小鼠模型成功感染HBV 后，可至少連續(xù)20周觀察到肝組織中HBs抗原呈陽(yáng)性［25］。此外，與uPA/SCID 和FRG 小鼠模型相比，TK-NOG 小鼠模型的主要優(yōu)勢(shì)是不易出現(xiàn)腎病、肝臟腫瘤等疾病，其主要缺點(diǎn)是雄性小鼠不育［26］。

5 人源化雙嵌合小鼠模型

5.1 AFC8-hu HSC/Hep 雙嵌合小鼠模型 雖然上述人鼠嵌合肝臟模型成功克服宿主物種限制和疾病建模方面的障礙，但小鼠缺乏免疫系統(tǒng)，使其無(wú)法用于研究宿主免疫反應(yīng)和肝炎病毒誘導(dǎo)的免疫病理。2011年，WASHBURN等及ROBINET等［27-28］研發(fā)出一種具有人免疫系統(tǒng)和人肝細(xì)胞的人源化雙嵌合小鼠模型，即AFC8-hu HSC/Hep 小鼠模型。研究人員將FK506結(jié)合蛋白（FKBP）-Caspase-8結(jié)合蛋白（AFC8）基因轉(zhuǎn)入Balb/C Rag2-γ C-null 小鼠受精卵中，構(gòu)建出AFC8轉(zhuǎn)基因小鼠。FKBP與白蛋白啟動(dòng)子激活的Caspase-8結(jié)合，在AP20187的誘導(dǎo)下，可使小鼠肝細(xì)胞發(fā)生特異性凋亡。在此基礎(chǔ)上，將人原代肝細(xì)胞（Hep）和CD34+造血干細(xì)胞（HSC）移植到AFC8 轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，即構(gòu)成AFC8-hu HSC/Hep 雙嵌合小鼠模型［29-30］。

此模型可同時(shí)具備人免疫系統(tǒng)及人肝細(xì)胞，在HBV 免疫機(jī)制研究及疫苗研發(fā)中具有極大的應(yīng)用前景。然而該模型不僅造模困難、費(fèi)用昂貴，而且人肝細(xì)胞嵌合率較低，遠(yuǎn)不及Alb-uPA/SCID、FRG 等人源化小鼠模型的人源化肝臟重建率，使得該模型無(wú)法廣泛應(yīng)用于HBV相關(guān)研究［31］。

5.2 A2/NSG-hu HSC/Hep雙嵌合小鼠模型 BILITY等［32］將人原代肝細(xì)胞和CD34+造血干細(xì)胞直接注入HLA-A2轉(zhuǎn)基因的NOD/SCID/IL2rγnull（NSG）新生小鼠（A2/NSG）肝臟，實(shí)現(xiàn)人肝細(xì)胞及免疫系統(tǒng)雙嵌合。A2/NSG小鼠攜帶人類HLA-A2基因，可促進(jìn)主要組織相容性復(fù)合體限制T細(xì)胞的發(fā)育［33］。在該模型中使用小鼠特異性抗Fas激動(dòng)劑抗體可使小鼠肝細(xì)胞發(fā)生特異性凋亡，從而使移植的人肝細(xì)胞具有再生優(yōu)勢(shì)［34］。

與其他人源化嵌合肝臟小鼠相比，A2/NSG-hu HSC/Hep 雙嵌合小鼠模型不僅具有人肝細(xì)胞和免疫系統(tǒng)，還支持HBV持續(xù)性感染、抗HBV免疫反應(yīng)，且可在HBV 感染的嵌合肝組織中觀察到活化的人M2 樣巨噬細(xì)胞積累。該模型最顯著的缺點(diǎn)為人肝細(xì)胞來(lái)自胎兒肝祖細(xì)胞，且移植水平相對(duì)較低（20%），導(dǎo)致該小鼠模型血液HBV 滴度較低，同時(shí)也存在動(dòng)物倫理的限制［35］。

總之，發(fā)展有前景的HBV 易感動(dòng)物模型是研究HBV 感染機(jī)制、開發(fā)HBV 感染新療法的關(guān)鍵。由于HBV 及動(dòng)物模型的自身生理特性，高壓水動(dòng)力注射模型、轉(zhuǎn)基因小鼠模型及病毒載體介導(dǎo)小鼠模型等均無(wú)法在小鼠體內(nèi)形成HBVcccDNA，使其難以為后續(xù)研究提供強(qiáng)有力的科學(xué)支撐。相比之下，人肝嵌合小鼠不僅對(duì)HBV 感染敏感，而且能夠在小鼠體內(nèi)形成HBVcccDNA，是當(dāng)前模擬臨床HBV感染患者的最佳模型，被廣泛應(yīng)用于肝損傷、基因調(diào)節(jié)、藥物毒性和嗜肝病毒感染等相關(guān)研究中，并為抗HBV 藥物的研發(fā)與評(píng)估提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。目前為止，已有多種人源化嵌合小鼠模型被研發(fā)出來(lái)，具有各種優(yōu)點(diǎn)和局限性。人源化嵌合肝臟小鼠模型主要面臨著價(jià)格昂貴、制備過(guò)程復(fù)雜、技術(shù)要求苛刻、無(wú)法遺傳等共性問(wèn)題。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，相信以上種種限制會(huì)被逐一攻克，且在已有技術(shù)條件基礎(chǔ)上，最終服務(wù)于臨床，為HBV患者提供更加精準(zhǔn)的個(gè)性化治療。