周吟毅,陳搖田,楊雪寒,王曉涵,齊潔玉,柴人杰,2,3,4,5

(1. 東南大學生物電子學國家重點實驗室,附屬中大醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,生命科學與技術(shù)學院,生命健康高等研究院,江蘇省生物醫(yī)藥高新技術(shù)研究重點實驗室,江蘇南京 210096;2. 南通大學神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南通 226001; 3. 四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,四川成都 610072;4. 中國科學院干細胞與再生醫(yī)學研究中心,北京 100101;5. 首都醫(yī)科大學北京市神經(jīng)再生修復研究重點實驗室,北京 100069)

1 內(nèi)耳干細胞

新生小鼠耳蝸中感覺上皮中含有干細胞，這些干細胞能在體外進行自我更新，并分化成毛細胞。研究鑒定了內(nèi)耳聽覺上皮中的Lgr5、Axin2和Frizzled9陽性內(nèi)耳干細胞。Lgr5是一種Wnt共受體，是包括腸道、肝臟和皮膚在內(nèi)的多種組織中公認的祖細胞標記物[6]。耳蝸中，Lgr5表達于小鼠耳蝸部分支持細胞中，包括第三排Dieters細胞、內(nèi)柱細胞、內(nèi)指細胞以及內(nèi)邊界細胞[7]。小鼠耳蝸中Axin2是Wnt信號通路中的β-catenin負調(diào)節(jié)子，表達于鼓階邊緣細胞中[8]。Frizzled9也是Wnt受體之一，表達于內(nèi)指細胞、內(nèi)邊界細胞和第三排Deiters細胞，被認為是Lgr5陽性內(nèi)耳干細胞中的一個亞群。在受到損傷的內(nèi)耳組織中，內(nèi)耳干細胞都可以再生具有各種特定毛細胞標記物的毛細胞[9]。

2 毛細胞再生的信號調(diào)控

數(shù)十年來，許多調(diào)控內(nèi)耳發(fā)育過程的重要作用基因被發(fā)現(xiàn)。Atoh1在毛細胞發(fā)育和分化中起正向調(diào)節(jié)作用。小鼠胚胎期缺乏Atoh1會誘發(fā)毛細胞和相關(guān)支持細胞的完全喪失。同時，多種信號通路，包括Wnt、Notch等已被發(fā)現(xiàn)通過控制各種轉(zhuǎn)錄因子的表達來參與調(diào)節(jié)內(nèi)耳發(fā)育。

2.1 Wnt信號通路Wnt信號通路在細胞生長發(fā)育及其再生中起到至關(guān)重要的作用，主要包括Wnt/β-catenin、Wnt/PCP和Wnt/calcium信號通路。從低等到高等哺乳動物，Wnt信號通路表現(xiàn)出高度保守性。Wnt蛋白作為配體和細胞膜上的受體蛋白特異性結(jié)合，激發(fā)多個下游通道，向胞內(nèi)傳遞信號。Wnt/β-catenin參與哺乳動物內(nèi)耳早期的聽泡和聽基板的分化[10]，Wnt信號分子主要在蝸管中發(fā)揮作用，靶基因主要位于聽泡背側(cè)，調(diào)節(jié)細胞極性和耳蝸管的延伸。此外，在小鼠胚胎發(fā)育過程中限制Wnt表達也可以控制半規(guī)管的形成[11]，在耳蝸感覺前體和支持細胞中上調(diào)Wnt信號，可促進毛細胞分化[12]，Wnt信號通路的激活也可以阻止耳毒性藥物引起的毛細胞壞死和脫落[13]。然而，只有少數(shù)增殖的Lgr5陽性細胞轉(zhuǎn)分化成毛細胞[14]。這表明，盡管Wnt激活可以增加內(nèi)耳祖細胞，但Wnt激活本身并不能大量再生新的毛細胞。

2.2 Notch信號通路Notch信號在脊椎和非脊椎動物中廣泛存在并高度保守。Notch配體受體特異性結(jié)合以后，受體蛋白經(jīng)蛋白酶水解釋放出胞內(nèi)段，移位至核中與CSL、MAML蛋白家族結(jié)合構(gòu)成復合物，解除轉(zhuǎn)錄抑制，驅(qū)動下游Atoh1等轉(zhuǎn)錄表達。內(nèi)耳發(fā)育過程中，Notch信號通路在支持細胞和毛細胞的分化方面不可或缺，如參與耳蝸感覺前體細胞等形成[15]。Wnt和Notch通路在毛細胞再生過程中以拮抗的方式進行遺傳相互作用。Notch通路的抑制可以活化Wnt/β-catenin信號，促進支持細胞轉(zhuǎn)分化為毛細胞樣細胞[16]。然而，Notch抑制誘導的支持細胞分化為毛細胞，是以支持細胞減少為代價的[17～19]。支持細胞的缺失又會導致包括新分化的毛細胞的死亡[14]。因此，單純的Notch抑制也是長期毛細胞再生的理想解決方案。先讓支持細胞增殖，然后讓增殖的支持細胞分化為毛細胞可能是促進有絲分裂毛細胞再生的最佳途徑。

2.3 Atoh1信號堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子Atohl是內(nèi)耳毛細胞分化所必需的關(guān)鍵因子,它通過作用于下游靶基因從而啟動內(nèi)耳毛細胞的分化。Atoh1的過表達導致耳蝸非感覺區(qū)毛細胞和支持細胞的形成[20]或異位毛細胞的形成[21]。Atoh1由Notch信號通路下游基因Hes1、Hes5介導，調(diào)控毛細胞和支持細胞產(chǎn)生。抑制Hes1、Hes5能促進Atoh1的表達，從而促進支持細胞分化為毛細胞。盡管有這些有希望的發(fā)現(xiàn)，但Atoh1在動物中的強制表達顯示出毛細胞的再生效率和功能成熟度的巨大差異，并且再生效率隨著年齡的增長而進一步降低[22]。因此單純的Atoh1不足以再生具有生理功能的成熟的毛細胞，可能需要其它轉(zhuǎn)錄因子增強。

2.4 其他信號分子Fox蛋白家族是具有翼狀螺旋的轉(zhuǎn)錄因子，與染色質(zhì)結(jié)合參與其結(jié)構(gòu)重組。FoxG1是家族中的成員，在哺乳動物、果蠅、線蟲中高度同源，參與腦、內(nèi)耳等多種組織的增殖分化，在早期神經(jīng)發(fā)育、線粒體能量代謝和生物合成中具有重要的調(diào)節(jié)作用。FoxG1與多種細胞信號轉(zhuǎn)導通路網(wǎng)絡(luò)緊緊聯(lián)系。FoxG1缺失會對多個信號通路的表達產(chǎn)生影響，主要表現(xiàn)為細胞分化能力的增強和增殖能力的抑制。FoxG1可以直接或間接地對Wnt/β-catenin信號通路活性進行抑制。內(nèi)耳干細胞中敲除FoxG1后誘發(fā)其向毛細胞的轉(zhuǎn)分化[23]。

Lin28是一種進化上保守的RNA結(jié)合蛋白，作為胚胎干細胞自我更新的調(diào)節(jié)因子高度表達[24]。研究證明，由Lin28B蛋白和let-7 miRNA組成的通路通過增強mTOR信號通路活性調(diào)節(jié)P5期小鼠耳蝸外植體中新毛細胞的產(chǎn)生，Lin28B促進新毛細胞產(chǎn)生，let-7 miRNAs抑制其產(chǎn)生，兩者是抑制彼此表達的拮抗劑[25]。此外，LIN28B和卵泡抑素Follistatin共激活增強了新生小鼠的自發(fā)耳蝸毛細胞再生[26]。

Hippo信號通路參與內(nèi)耳毛細胞損傷和自我修復過程。調(diào)控Hippo信號通路的關(guān)鍵蛋白Mst1/2可以促進Hippo信號通路效應(yīng)因子YAP1的細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，誘導毛細胞再生[27]。

3 多基因協(xié)同調(diào)控毛細胞再生

毛細胞再生的經(jīng)典調(diào)控信號通路如Wnt、Notch、Atoh1、Hippo/Yap等信號之間存在豐富的通訊網(wǎng)絡(luò)。如Wnt激活與Notch抑制的協(xié)同調(diào)控可以促進出生后小鼠耳蝸的毛細胞再生[28, 29]。而Notch 通路抑制與Hippo通路抑制協(xié)同作用促進毛細胞再生[27],特別是在促進支持細胞直接轉(zhuǎn)化為毛細胞方面。在新生Lgr5陽性祖細胞中共同激活Wnt和Atoh1可以提高毛細胞生成的效率[30]；在Sox2陽性支持細胞中抑制Notch、激活Wnt和Atoh1，使得內(nèi)耳的感覺和非感覺區(qū)域誘導了毛細胞的異位生成[29]。然而，這些新生成的毛細胞部分沒有表達終末分化標志物(內(nèi)毛細胞的vGlut3和外毛細胞的Prestin)，也沒有顯示成熟耳蝸毛細胞的形態(tài)學特性，這表明這些新的毛細胞仍然不成熟且無功能。

在耳蝸發(fā)育過程中，毛細胞的形成和成熟受到多種信號和轉(zhuǎn)錄因子的時空調(diào)控。Atohl作為正性調(diào)控基因，可通過調(diào)控促進胚胎晚期毛細胞的發(fā)育成熟的轉(zhuǎn)錄因子Pou4f3或其他基因來掌控毛細胞的命運和發(fā)育[31]。Pou4f3位于Gfil上游，控制著Gfil蛋白在毛細胞中的表達[32]。聯(lián)合調(diào)控Gfi1、Pou4f3和Atoh1，發(fā)現(xiàn)多基因的聯(lián)合調(diào)控能夠顯著提高毛細胞再生的效率[22],表達耳蝸內(nèi)成熟毛細胞的標志物vGlut3或者Prestin，電生理的研究結(jié)果顯示新生內(nèi)毛細胞模擬了耳蝸固有內(nèi)毛細胞的發(fā)育過程[7]。Ikzf2是在耳蝸外毛細胞特異表達的一個基因，其功能突變導致外毛細胞發(fā)育障礙[33]。Atoh1和Ikzf2在內(nèi)耳干細胞中的共同過表達可以使出生后一個月小鼠耳蝸內(nèi)新生的毛細胞獲得比擬出生后1天小鼠外毛細胞的狀態(tài)[34]。Tbx2是一個在內(nèi)毛細胞，而不在外毛細胞表達的轉(zhuǎn)錄因子，是調(diào)控內(nèi)毛細胞正常分化的核心基因，缺失Tbx2后內(nèi)毛細胞將不能進行正常分化，反而轉(zhuǎn)變?yōu)橥饷毎鸞35]。Tbx2和Atoh1聯(lián)用產(chǎn)生的新生vGlut3陽性內(nèi)毛細胞無論在數(shù)量上，還是在分化程度上，都較之前單獨Atoh1過表達有顯著的提高。

小鼠耳蝸在出生后的成熟發(fā)育過程中，支持細胞再生毛細胞的能力大幅下降。p27Kip1缺失與異位Atoh1表達的結(jié)合克服了這種年齡相關(guān)性的干細胞可塑性下降，使成熟小鼠和噪聲損傷后的小鼠支持細胞轉(zhuǎn)化為毛細胞。p27kip1缺失，上調(diào)了隨年齡增長從內(nèi)耳干細胞中丟失的Atoh1的輔因子Gata3。Gata3和Pou4f3促進成熟耳蝸中Atoh1介導的毛細胞再生，Pou4f3的單獨激活、Gata3與Atoh1的共同激活、Pou4f3與Atoh1的共同激活可以促進成年小鼠支持細胞轉(zhuǎn)化為毛細胞。這表明p27kip1、Gata3和Pou4f3是Atoh1介導的毛細胞再生的共同治療靶點[36]。此外，Lin28b和Follistatin的短暫共激活能夠?qū)⒊墒於佒С旨毎匦戮幊虨樽婕毎麃碓鰪娖湓偕芰?，二者通過上調(diào)TGF-β增強了新生小鼠的耳蝸毛細胞的自發(fā)性再生[26]。機制上，耳蝸單細胞的轉(zhuǎn)錄組學和表觀遺傳組學分析顯示，隨著小鼠耳蝸出生后發(fā)育，毛細胞基因位點在內(nèi)耳干細胞中的表觀遺傳性下降[22],表明需要通過額外的毛細胞轉(zhuǎn)錄因子和支持細胞中毛細胞位點的表觀遺傳調(diào)節(jié)因子在重新編程期間降低支持細胞基因，從而產(chǎn)生功能性的毛細胞。

4 毛細胞再生療法

4.1 小分子藥物Frequency Therapeutics開發(fā)了一種新藥FX-322，旨在通過重編程祖細胞來激活人體先天毛細胞再生潛力的療法來恢復噪聲誘發(fā)或突發(fā)感音神經(jīng)性相關(guān)的聽力損失。該研究的主要結(jié)果測量是語音感知，這是一種衡量聲音清晰度和理解語音的測試聽力損失。單劑量FX-322的臨床研究表明，語言感知測量的聽力有所改善[37]。FX-322是第一個在感音神經(jīng)性聽力損失的臨床試驗中顯示出具有統(tǒng)計學意義和臨床意義的聽力改善的候選產(chǎn)品，目前處于二期臨床試驗階段。除了FX-322上的臨床工作，F(xiàn)requency正在開發(fā)一種新的臨床前候選藥物FX-345，通過毛細胞再生來治療感覺神經(jīng)性聽力損失。FX-345可以以不同的劑量水平治療不同的感音神經(jīng)性聽力損失患者群體。

南京大學的萬國強團隊優(yōu)化、表征并利用小鼠耳蝸類器官平臺，對一千多種FDA批準的小分子藥物進行了高通量篩選，發(fā)現(xiàn)腫瘤治療藥物瑞戈菲尼能夠顯著促進耳蝸類器官中毛細胞的分化。進一步的研究發(fā)現(xiàn)瑞戈菲尼在小鼠離體耳蝸組織中同樣高效促進毛細胞的再生和成熟，而這一過程是由VEGFR-MEK-TGFB1信號軸介導，并不依賴于Notch這一經(jīng)典的毛細胞再生通路[38]。盡管有一些有希望的發(fā)現(xiàn)，功能性毛細胞再生恢復聽覺功能暫時仍不能有效實現(xiàn)。

4.2 AAV介導的干細胞再生醫(yī)學基因遞送的理想載體需要將目的核酸片段準確遞送至內(nèi)耳和靶細胞并高效表達。此外，載體還需要轉(zhuǎn)染效率高，強度和時間可控，安全性高等指標要求。2005年，研究者首次使用腺病毒載體將Atoh1基因轉(zhuǎn)染到內(nèi)耳，發(fā)現(xiàn)Atoh1可以通過編碼HLH轉(zhuǎn)錄因子和與毛細胞發(fā)育有關(guān)的關(guān)鍵因素來實現(xiàn)耳聾后的部分聽力恢復和改善[39]。然而，腺病毒的不能長期表達和潛在的免疫毒性反應(yīng)限制了其在臨床上的應(yīng)用。Clinicaltrials.gov上顯示的正在進行的臨床實驗中，最常用的體內(nèi)基因治療載體是重組腺相關(guān)病毒AAV(recombined adeno-associated viruse, rAAV)。AAV載體介導的基因治療已在美國獲批，可用于治療罕見的遺傳性眼病。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)了一些理想的可在內(nèi)耳轉(zhuǎn)染的AAV載體?；贏AV衣殼的原始序列制作了可高效靶向耳蝸毛細胞載體AAV2/Anc80L65,解決了傳統(tǒng)AAVs感染外毛細胞效率低的問題[40]。隨后又發(fā)現(xiàn)具更高感染效力的AAV2.7m8[14]，不僅優(yōu)先靶向耳蝸毛細胞，還可以有效感染Lgr5陽性支持細胞。Tan等通過插入多肽DGTLAVPFK構(gòu)建了AAV-DJ的突變體AAV- inner ear(AAV-ie)，通過產(chǎn)生跨膜結(jié)構(gòu)提高感染效率[41]，AV-ie可以有效感染耳蝸毛細胞和前庭毛細胞。此外，研究發(fā)現(xiàn)AAV-ie不會影響毛細胞和聽覺系統(tǒng)的功能，其在糾正遺傳性聽力損傷和毛細胞再生治療方面具有重要的潛力。AAV-ie是能夠?qū)⑼庠碅toh1遞送至內(nèi)耳干細胞中，體內(nèi)實現(xiàn)內(nèi)耳干細胞向毛細胞的轉(zhuǎn)化等[41]。然而，AAV-ie對支持細胞的非特異靶向性限制了其在功能性毛細胞再生中的應(yīng)用，相同滴度下AAV-ie可以以幾乎100%的比例轉(zhuǎn)導毛細胞和螺旋神經(jīng)元。因此，開發(fā)高效特異靶向支持細胞的AAV對基于支持細胞，即內(nèi)耳干細胞的再生醫(yī)學研究至關(guān)重要。

5 結(jié)論與展望

耳蝸毛細胞的受損和缺失，是造成感音神經(jīng)性聾的核心原因之一。成年哺乳動物的耳蝸毛細胞屬于終末分化細胞，其受損缺失后不能自發(fā)再生得到補充。治療感音神經(jīng)性聾最理想的方法是通過干細胞使毛細胞再生，從而使耳蝸結(jié)構(gòu)和功能修復，從而在根本上恢復聽力。因此，如何激活并調(diào)控干細胞，使其有效增殖分化，再生為功能性毛細胞，是聽覺損傷修復的關(guān)鍵之處。對于損傷后內(nèi)耳干細胞的命運調(diào)控解碼和臨床上適用的治療方式的開發(fā)，將極大地推進通過干細胞修復聽覺損傷重建聽覺功能從基礎(chǔ)研究走向臨床轉(zhuǎn)化。