李佳璐，董 媛，王 宇，張曉莉

DNA甲基化是目前研究最廣泛、最深入的表觀遺傳修飾形式。它能夠引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，調(diào)控基因表達，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[1]。研究表明，腫瘤抑制基因啟動子和5 '區(qū)域的DNA 超甲基化是癌發(fā)生的早期事件[2]。婦科腫瘤方面，科研工作者們也在不斷進行基因DNA甲基化方向的研究。Doorbar等[3]發(fā)現(xiàn)，宮頸癌的發(fā)生與某個或多個基因的啟動子甲基化造成的基因表達缺失有著密切關(guān)系。PAX1基因是一種可以參與脊椎動物胚胎發(fā)生的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[4]，經(jīng)常因基因甲基化在宮頸癌中被沉默[5]。Lai等[6]發(fā)現(xiàn)，以PAX1為代表的一系列宮頸癌特異性甲基化基因在檢測CIN3級及以上的樣本時有較高的診斷價值。在針對亞洲人的多項 Meta分析研究中，Kon等[7]也發(fā)現(xiàn)在宮頸刮片中行PAX1基因甲基化和HPV檢測的準確性要高于單獨HPV檢測。2019年，我國部分地區(qū)已批準PAX1基因甲基化檢測作為細胞學輔助檢測手段[8]。本研究旨在分析PAX1基因甲基化水平與宮頸高級別上皮內(nèi)病變及HR-HPV分型之間關(guān)系，以及PAX1基因甲基化指導ASCUS患者分流中的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2021-06至2022-03在解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學中心婦產(chǎn)科就診患者。納入標準：(1)自愿進行PAX1基因甲基化檢測；(2)進行機會性篩查者；(3)因?qū)m頸病變治療后隨訪以及評價療效者。排除標準：(1)生殖系統(tǒng)惡性腫瘤及免疫系統(tǒng)疾病患者；(2)妊娠期；(3)就診時有下生殖道及外陰、陰道、宮頸等急性感染性疾病者或合并其他性傳播疾病患者。根據(jù)專家共識[9]，選取TCT結(jié)果異?！菀饬x不明的非典型鱗狀細胞(ASCUS)和(或)高危人類乳頭狀病毒(high-risk human papillmavirus DNA，HR-HPV)陽性患者194例；根據(jù)陰道鏡應(yīng)用標準，轉(zhuǎn)診陰道鏡下取病理活檢的患者共130例。入組患者分別進行液基薄層細胞檢測(Thinprep cytologic test，TCT)和人乳頭瘤病毒-DNA(HPV-DNA)分型檢測、定量PAX1基因甲基化檢測。研究對象平均年齡(40.62±4.90)歲；其中未見上皮內(nèi)細胞病變(no intraepithelial cell lesions were found，NILM)為21例，意義不明確的非典型鱗狀細胞(atypical squamouscells of undtermined significance，ASC-US)為45例，不除外高度鱗狀上皮內(nèi)病變(atypical squamous cells cannot exclude high grade intraepithelial lesion，ASC-H)為5例，或低度鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)為37例，高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)為22例；單一感染HPV16、18和非HPV16/18陽性患者分別為43、30和85例。本研究經(jīng)解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學中心倫理委員會批準(批準號：2021-D04-09)。入組患者均自愿參加該項臨床研究且已簽署相關(guān)知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 宮頸脫落細胞收集 非月經(jīng)期內(nèi)予以取材，紗布或棉球拭凈宮頸表面分泌物，取材刷于宮頸表面及宮頸管內(nèi)順時針充分旋轉(zhuǎn)10周，將刷到的組織脫落細胞移入細胞固定液的瓶內(nèi)保存。

1.2.2 TCT檢測 采用新柏氏薄層細胞檢測系統(tǒng)對標本進行處理，病理科醫(yī)師閱片診斷。細胞學診斷報告參考2014年修訂的宮頸細胞學結(jié)果分級系統(tǒng)(the bethesda system，TBS)，結(jié)果分為正常(NILM)、不明意義的非典型鱗狀上皮細胞(ASC-US)、非典型鱗狀細胞不除外高度病變(ASC-H)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)。

1.2.3 HR-HPV DNA檢測 采用Cobas 4800檢測系統(tǒng)對宮頸脫落細胞進行HR-HPV DNA檢測。

1.2.4 PAX1基因甲基化檢測 核酸提取試劑盒(OC130)提取宮頸刮片細胞中的基因組DNA(gDNA)，兩步法PCR擴增，對提取gDNA進行甲基化處理后，兩步法PCR制備測序文庫，并對測序文庫進行定量與質(zhì)控，最后經(jīng)定量的文庫采用基因測序儀進行高通量測序。甲基化評分算法：以本試劑盒提供DNA內(nèi)參，根據(jù)PAX1基因與內(nèi)參基因的Cp值，計算△Cp。其中，PAX1基因甲基化數(shù)值的大小將反映PAX1基因甲基化的程度，PAX1基因甲基化數(shù)值的高低與PAX1基因甲基化的程度呈反比(即△Cp值越小，PAX1基因甲基化程度越大)。

1.2.5 陰道鏡檢查 由同一名陰道鏡醫(yī)師完成陰道鏡檢查，可疑部位取材活檢；若未見明顯異常，則在宮頸3、6、9、12點多點活檢。宮頸管內(nèi)可疑病變，必要時行頸管內(nèi)膜診刮術(shù)(endocervical curettage，ECC)。病理切片由同一名病理科醫(yī)師判讀，另一名病理科醫(yī)師審核結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0 軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料采用 Shapiro-Wiilk(S-W)方法進行正態(tài)分布檢驗，測定指標值均不符合正態(tài)分布，采用四分位數(shù)[中位數(shù)(25%，75%)]來進行描述，組間差異采用非參數(shù)秩和，兩獨立樣本的非參數(shù)檢驗方法為Mann-WhitneyU檢驗，多樣本間兩兩比較的非參數(shù)檢驗方法為Kruskal-Wallis檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 活檢患者的PAX1基因甲基化程度 采集130例完整資料，其中CIN3+患者的甲基化程度為18.21(17.56，18.66)，高于正常/宮頸炎[20.5(20.07，20.80)]、CIN1[20.41(20.19，20.72)]及 CIN2[20.21(19.77，20.42)]患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2 ASCUS患者PAX1基因甲基化程度 TCT診斷為ASCUS患者，最終取得病理的為45例。其中正常/CIN1患者23例，CIN2+(CIN2、CIN3和宮頸癌)患者23例。正常/CIN1患者的PAX1基因甲基化數(shù)值的CP值為20.51(20.19，20.73)；CIN2+的患者PAX1基因甲基化CP值為18.87(17.80，20.26)，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.3 不同類型HPV感染患者PAX1基因甲基化程度 選擇單一感染HPV16、HPV18和非HPV16/18陽性患者，比較其PAX1基因甲基化程度。單一感染HPV16患者的PAX1基因甲基化程度為19.10(17.97，19.88)，單一感染HPV18患者的PAX1基因甲基化程度19.49(18.65，20.31)，均高于非HPV16/18陽性20.33(20.00，20.50)的患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，HPV18陽性與非HPV16/18陽性患者間的PAX1基因甲基化程度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。但單一HPV16陽性與單一HPV18陽性患者的PAX1基因甲基化數(shù)值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討 論

HPV在人體正常宮頸上皮細胞中持續(xù)性感染是宮頸癌發(fā)生的主要誘因之一[10]。TCT整個檢測流程受到人為因素影響較大，可能會導致低估患者宮頸上皮內(nèi)病變的程度，或?qū)Ψ磻?yīng)性改變做出一系列過度診斷。HPV-DNA檢測有較高的靈敏度，但特異性不高[11]。這可能會導致過度治療[12-13]。故尋找不依賴于傳統(tǒng)的形態(tài)學觀察、診斷效能更高且簡便易行的分子生物學篩查標記物十分重要。Kelly和Fang等[14-15]研究發(fā)現(xiàn)，基因DNA甲基化與宮頸癌的發(fā)生和進展有相關(guān)性。Liu等[16]也發(fā)現(xiàn)PAX1基因甲基化程度在宮頸癌患者中顯著高于其他宮頸病變患者。

本文研究結(jié)果顯示，PAX1基因甲基化數(shù)值高低與宮頸病變進展程度有關(guān)，PAX1基因的甲基化水平隨著宮頸病變程度的加深而逐漸增高。高危型HPV感染后3～5年即可進展為高級別病變，但由高級別病變進展成宮頸癌可能需要20～30年[3]。這為臨床上我們進行宮頸癌的早期篩查以及在癌前病變階段實行有效的干預(yù)措施提供了可能。

ASCUS是一種十分“令人頭疼”TCT檢測結(jié)果。2018年JAMA指南指出：在中國進行細胞學檢查的患者中，有10%的結(jié)果診斷為ASCUS和LSIL[17]。ASCUS的患者需在6～12個月重復細胞學檢查，或利用HR-HPV DNA分流。但HPV-DNA檢驗的特異性差，重復檢查浪費醫(yī)療資源。本研究也發(fā)現(xiàn)，ASCUS患者中，CIN2+的PAX1基因甲基化數(shù)值顯著高于正常/CIN1。結(jié)果表明定量PAX1基因甲基化檢測有助于早期識別ASCUS宮頸高級別病變，也有助于降低ASCUS陰道鏡轉(zhuǎn)診率。

王文杰等[18]研究表明，感染最高風險致癌型HPV16/18陽性比與非HPV16/18陽性患者PAX1檢出率不同。筆者發(fā)現(xiàn)，其中單一HPV16陽性、單一HPV18陽性患者的PAX1基因甲基化的數(shù)值顯著高于非HPV16/18陽性患者。推測HPV16/18的感染機制不同于非HPV16/18陽性。高危型HPV16/18對于PAX1基因甲基化過程的的影響更大，且HPV16型強于HPV18型。國外研發(fā)了六基因(ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17 和 ZNF671)DNA甲基化標記物組，發(fā)現(xiàn)它具有更高特異性和較高的靈敏度。目前該項檢測已被開發(fā)為GynTect，已于2015年9月獲得上海國際臨床檢驗及實驗室設(shè)備展覽會(CEIVD)認證[19]。相比于其它的宮頸癌DNA甲基化標記物，如CADM1、MAL、miR124、FAM19A4、ZNF582、SOX1和NKX6-1，GynTect檢測顯示相似的靈敏度，且具優(yōu)勢的特異性[20]。

今后研究中，課題組將聯(lián)合應(yīng)用多基因甲基化檢測，組織前瞻性、大規(guī)模的臨床試驗，進行更深入的研究以尋找更好的生物學篩查標記物。