郭梨梨 韓 玉 翟敬芳1,*

1.蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生院 (安徽 蚌埠 233000)

2.徐州醫(yī)科大學(xué)徐州臨床學(xué)院 (江蘇 徐州 221009)

3.徐州市中心醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心 (江蘇 徐州 221009)

染色體疾病是出生缺陷人群最常見的遺傳病，其中非整倍體的發(fā)生與同源染色體不分離有關(guān)，隨著女性妊娠年齡的增加，胎兒非整倍體的發(fā)生率增加[1]，但染色體微缺失、微重復(fù)的發(fā)生與妊娠年齡無關(guān)[2-3]。隨著對染色體微缺失/微重復(fù)綜合征(chromosome microdeletion/microduplication syndromes, MMS)的深入研究，微缺失、微重復(fù)綜合征文獻(xiàn)報道的種類超過300種，累積發(fā)病率約為1.0-2.5%[4-7]，即使在結(jié)構(gòu)正常染色體核型正常的胎兒中拷貝數(shù)變異累計發(fā)生率為1～1.7%。微缺失/微重復(fù)綜合征具有復(fù)雜的臨床表現(xiàn)如特殊面容、精神行為改變等[8]，常合并生長發(fā)育異常、智力缺陷，生活不能自理，給社會及家庭帶來極大的危害。相關(guān)指南推薦對妊娠婦女進(jìn)行相關(guān)篩查[4]，美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(ACMG)推薦無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(Non-invasive prenatal screening, NIPS)對年輕孕婦進(jìn)行22q11缺失綜合征篩查[9]，但傳統(tǒng)的NIPS局限于21三體、18三體、13三體及性染色體，對胎兒染色體微缺失/微重復(fù)篩查的效能低，侵入性產(chǎn)前診斷需要人力及實驗室條件要求，擴展性無創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查(expanded noninvasive prenatal screening, NIPS-Plus)能夠滿足臨床對胎兒染色體微缺失及微重復(fù)篩查的需要，現(xiàn)將其在胎兒染色體微缺失及微重復(fù)中的應(yīng)用情況作一綜述。

1 NIPS-Plus技術(shù)原理及實驗流程

NIPS-Plus是NIPS檢測升級版，也是基于高通量測序技術(shù)原理對母體外周血胎兒游離DNA進(jìn)行序列測定。相對NIPS而言，NIPS-Plus在測序數(shù)據(jù)量和算法方面做了很大改進(jìn)，使檢測范圍更加廣泛，臨床價值高于NIPS[10-11]。NIPS-Plus測序深度較NIPS增加2～3倍(～0.4 X，reads數(shù)量為800萬條)，有更好的檢測性能[12]。NIPS-Plus技術(shù)實驗流程與NIPS相似，包括血漿DNA提取分離、DNA文庫構(gòu)建、文庫擴增及上機測序分析三個過程，實驗流程按照實驗室相關(guān)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)進(jìn)行，對測序結(jié)果進(jìn)行分析判斷， 不同公司的檢測方法使用的測序平臺、實驗方案、測序方法以及納入的樣本量及測序數(shù)據(jù)量等方面存在差異，但均具有較高的靈敏度和特異度。

2 質(zhì)量控制程序

NIPS-Plus實驗室質(zhì)控嚴(yán)格遵循相關(guān)規(guī)范指南[13-14]。首先，采樣前超聲檢測證實為活胎，醫(yī)生需與孕婦進(jìn)行充分的知情告知NIPS-Plus檢測指征以及局限性如染色體平衡易位、多倍體等。同時，注意排查可能存在明顯影響結(jié)果準(zhǔn)確性的情況如干細(xì)胞治療、1年內(nèi)接受過異體輸血等。按照規(guī)定的采樣管進(jìn)行樣本收集，條型碼確保唯一，血漿無嚴(yán)重溶血。如系院外檢測，血漿及DNA 樣本采用干冰運輸，短期保存-20℃，超過7天需在-80℃保存，以上均為檢測前質(zhì)控。

檢測過程質(zhì)量控制：有資質(zhì)的檢測人員應(yīng)在具備NIFTY環(huán)評標(biāo)準(zhǔn)實驗室按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行實驗。使用經(jīng)CFDA批準(zhǔn)的體外診斷試劑盒，設(shè)置空白對照和陰陽性對照，使用Qubit熒光定量儀進(jìn)行文庫定量質(zhì)量控制，對檢測結(jié)果陽性的臨床樣本應(yīng)對該樣本進(jìn)行再次驗證。報告生成環(huán)節(jié)需在系統(tǒng)信息完成審核、分析等檢測后質(zhì)控環(huán)節(jié)，同時應(yīng)加強對NIPS-Plus發(fā)現(xiàn)的陽性、陰性及檢測失敗病例的管理。國內(nèi)大多數(shù)實驗室采用的是NextSeq CN500 (Illumina)和 BGISEQ-500平臺，不同的平臺產(chǎn)生的reads數(shù)及有效數(shù)據(jù)量有不同的要求。

3 NIPS-Plus檢測效能及適用人群

從理論上來說，NIPS-Plus能夠檢測出預(yù)設(shè)閾值以上的微缺失、微重復(fù)片段，但由于母體外周血胎兒濃度、測序所覆蓋的深度等不同，NIPS-Plus對具體的微缺失微重復(fù)檢測的效能不同[15-16]。關(guān)于NIPS在產(chǎn)前篩查中的應(yīng)用早在2015年國際產(chǎn)前診斷協(xié)會(International Society forPrenatal Diagnosis，ISPD)推薦NIPS檢測適用于全人群產(chǎn)前篩查[17]，2020年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(american college of obstetricians and gynecologists，ACOG)推薦NIPS可替代傳統(tǒng)血清學(xué)篩查作為全人群產(chǎn)前篩查的首選項目，而不建議進(jìn)行多種產(chǎn)前血清學(xué)篩查方法，但提醒臨床醫(yī)師無論篩查結(jié)果如何，所有篩查孕婦都需要進(jìn)行超聲檢查[18]。對于胎兒染色體拷貝數(shù)方面的研究，2016年美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會推薦NIPS對年輕孕婦進(jìn)行22q11缺失綜合征篩查[9]，2020年廣東省精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)應(yīng)用學(xué)組推薦NIPS對致病明確的微缺失微重復(fù)片段進(jìn)行NIPS篩查[19]。NIPS對拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNVs)的檢出率較低，NIPS-Plus在對CNVs檢出彰顯其優(yōu)勢[9]。與NIPS比較，梁德生等學(xué)者基于2015年至2018年對94085例大樣本孕婦NIPSPlus檢測發(fā)現(xiàn)對胎兒非整倍體(13、18、21、性染色體)和MMs篩查的特異度均大于99%，對Digeorge的陽性預(yù)測值(positive predictive value, PPV)93%，接近T21篩查的陽性預(yù)測值95%，對22q11.22重復(fù)綜合征、prder - willi /Angleman和Cri du Chat綜合征的PPV也在50%以上，推薦NIPS-Plus作為一線的篩查方法應(yīng)用于臨床[6]。另外，廣州婦女兒童醫(yī)學(xué)遺傳中心應(yīng)用對7710例選擇NIPS-Plus妊娠婦女與42969例妊娠婦女進(jìn)行NIPS的對比研究發(fā)現(xiàn)，對于不同大小的拷貝數(shù)變異，如DiGeorge綜合征、Prader Willi綜合征、貓叫綜合征等，NIPS-Plus均展現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，NIPS-Plus的檢出率提高了1.02% (0.58% vs 1.60%)，>10Mb的CNVs的PPV明顯高于NIPS組(P<0.05)，NIPS- Plus較NIPS檢測的總PPV 明顯比NIPS高(43.61% vs 30.96%)[12]。

NIPS-Plus檢測的理論基礎(chǔ)與NIPS相似，均是胎兒游離DNA(cell free fetal DNA,cff-DNA)，因此兩種檢測方法的適用人群相似，可以參照國衛(wèi)辦婦幼發(fā)〔2016〕45號文件關(guān)于適用人群、慎用人群及禁用人群的規(guī)定[13]。2015～2018年在一項42910例大樣本研究中，NIPS無論在以臨界高風(fēng)險為主的適用人群還是在高齡和超聲軟指標(biāo)異常及血清學(xué)高風(fēng)險人群中，對21三體均有較高的預(yù)測價值，PPV高達(dá)70%以上，最高達(dá)100%；在超聲結(jié)構(gòu)異常的禁用人群中，18三體和CNVs的PPV均達(dá)到了100%[7]，而后者常合并胎兒結(jié)構(gòu)異常，因此胎兒結(jié)構(gòu)異常中染色體非整倍體和微缺失微重復(fù)的概率增高，這一點與大多數(shù)文獻(xiàn)報道一致[20]。陳藝升等人研究發(fā)現(xiàn)NIPS-Plus臨床檢測指征中，高齡PPV(77.8%)最高，對血清學(xué)篩查高風(fēng)險或處于臨界風(fēng)險、超聲軟指標(biāo)或結(jié)構(gòu)異常的PPV分別為55.1%、73.9%[21]。陸婁愷奕等人對1312例IVF孕婦進(jìn)行了NIPS與NIPS-Plus復(fù)合檢測，發(fā)現(xiàn)NIPS及NIPS-Plus對體外受精與胚胎移植(invitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)胎兒的非整倍體篩查的PPV均超過80%，這說明NIPS-Plus對IVF-ET妊娠人群篩查具有一定的應(yīng)用價值[22]。但丁昭寧等通過研究認(rèn)為NIPS-Plus在CNVs的檢測中對常見染色體疾病如21、18-三體的檢測中陽性預(yù)測值較高，而在微缺失/微重復(fù)、性染色體異常等檢測中陽性預(yù)測值尚需進(jìn)一步提高[23]。

4 NIPS-Plus技術(shù)臨床應(yīng)用優(yōu)勢

NIPS-Plus是一種升級版的胎兒染色體拷貝數(shù)變異篩查技術(shù)，通過增加測序深度、擴大檢測范圍對胎兒染色體拷貝數(shù)變異進(jìn)行篩查。NIPS-Plus技術(shù)檢測的范圍更加全面，可以發(fā)現(xiàn)多種胎兒染色體異常，包括21、18及13-三體的24種常染色體非整倍體疾病、4種性染色體非整倍體疾病、百余種>3Mb的胎兒染色體缺失/重復(fù)綜合征[22-24]。吳夢詩等于2021年總結(jié)中提出對于染色體微缺失發(fā)生頻繁高的年輕女性，建議進(jìn)行 NIPS-Plus篩查[25]。2021年鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心通過對64135例妊娠婦女11～14周進(jìn)行NIPS與NIPS-Plus對比檢測，并同步結(jié)合超聲篩查，證實了NIPS-Plus不僅對常規(guī)的非整倍體篩查具有很好的臨床應(yīng)用潛力，而且對在妊娠早期超聲篩查中沒有異常的MMS也具有臨床檢測效能[26]，推薦超聲和NIPS- Plus結(jié)合后續(xù)的遺傳咨詢可以作為對所有孕婦的一種全面的一線篩查方法。2022年最新研究表明NIPS-Plus對高齡孕婦的胎兒SCAs和染色體非整倍體篩查方面優(yōu)于年輕孕婦[27]。對于NIPS對于高齡妊娠人群中的研究發(fā)現(xiàn)，與孕產(chǎn)婦的年齡呈負(fù)相關(guān)[28]，但cffDNA含量與孕齡呈正相關(guān)，由于NIPS-Plus對cffDNA有較高的富集程度，NIPS-Plus更適合作為高齡孕婦的早期篩查手段。

5 NIPS-Plus技術(shù)的局限性

臨床醫(yī)師在使用NIPS-Plus之前，需要深入了解該技術(shù)的局限性，方便對檢測結(jié)果的遺傳咨詢和后期隨訪處理。NIPS-Plus PPV和陰性預(yù)測值受到研究過程中多種因素的影響，隨著基因組CNVs數(shù)量的增加，假陽性和陰性結(jié)果預(yù)計會增加。隨著測序深度的增加，NIPS-Plus勢必檢測出更多的微缺失微重復(fù)片段[12]，臨床上進(jìn)行產(chǎn)前診斷對意義不明的拷貝數(shù)變異一方面增加了產(chǎn)前診斷成本，另一方面無疑增加了產(chǎn)前診斷咨詢的難度，其中NIPSPlus檢測出的小于5～10Mb的染色體變異，但對于未發(fā)生基因劑量變化的染色體結(jié)構(gòu)異常無法判斷[29]，以上這些都需要后續(xù)的實踐和研究來提高其準(zhǔn)確性。另外，由于母體因素、胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞、性染色體互換因素、限制性胎盤嵌合等因素可能會導(dǎo)致假陽性及假陰性結(jié)果的出現(xiàn)[16]。與NIPS相比，NIPS-Plus目前檢測費用較高，一定程度上限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。

6 總結(jié)及發(fā)展前景

總而言之，微缺失/微重復(fù)綜合征臨床發(fā)病率較高，NIPSPlus對胎兒拷貝數(shù)變異檢測不是確診的手段，但其能一定程度上滿足臨床對胎兒染色體微缺失及微重復(fù)篩查的需要，緩解臨床產(chǎn)前診斷的壓力，實現(xiàn)了更加全面的出生前對胎兒染色體篩查。隨著分子檢測技術(shù)的發(fā)展，越來越多的孕婦傾向于選擇NIPS。同時，隨著測序價格的降低，NIPS-Plus有望成為孕婦首選的一線產(chǎn)前篩查技術(shù)。但仍需要對NIPS-Plus應(yīng)用產(chǎn)前篩查方面做深入的研究,使其在指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育方面有更近一步的突破。