洪 冕，黃佳敏，陳冬梅,2，謝書宇*

(1.國家獸藥殘留基準實驗室(HZAU)，華中農(nóng)業(yè)大學，武漢 430070；2.國家獸藥安全評價實驗室(HZAU)，華中農(nóng)業(yè)大學，武漢 430070)

1 研究背景

細菌性感染是危害動物健康的重要因素，通常根據(jù)感染部位的不同而呈現(xiàn)出不同癥狀，嚴重者亦可發(fā)展成敗血癥或膿毒血癥，最終導致動物死亡?？咕幨侵改軌蛴行б种苹驓缂毦?，用于預防和治療細菌性感染的藥物。其可大致分為人工合成抗菌藥以及天然抗生素兩類。人工合成抗菌藥主要包括有磺胺類、喹諾酮類、呋喃類等，其中磺胺類是抗生素開始應用于抗菌治療前的細菌性感染主治藥物[1]。第一種抗生素——青霉素則由亞歷山大·弗萊明于1928年發(fā)現(xiàn)，并在19世紀40年代開始應用于臨床治療，對二戰(zhàn)期間士兵細菌性感染的控制發(fā)揮重要作用[2]。此后近百年間，抗生素被廣泛研究并大規(guī)模使用。

抗菌藥物的使用降低了細菌性感染所致的高發(fā)病率及死亡率，有效維護人與動物生命建康，同時也提高了畜禽生產(chǎn)效率，實現(xiàn)動物性食品的穩(wěn)定供應，有效避免畜牧業(yè)經(jīng)濟損失。然而，其過度使用亦引起了嚴重的耐藥性問題。細菌通過表達滅活酶、酶促修飾、降低細胞膜通透性、改變作用靶位、改變代謝途徑、形成生物被膜以及主動外排等方式抵抗藥物殺傷作用[3]。研究表明，早在青霉素被發(fā)現(xiàn)并使用之前，便已有了耐青霉素葡萄球菌菌株的存在[4]。細菌不斷增強的耐藥性，導致抗菌藥物治療效果減弱。而若加大抗菌藥物劑量以期增強療效，則又會給機體帶來過重負擔，提高毒副作用發(fā)生幾率。大劑量的抗菌藥物還極可能在動物體內(nèi)形成殘留，降低動物性產(chǎn)品質(zhì)量。同時，由于耐藥菌的耐藥基因可傳遞至子代或其他種屬細菌，因此耐藥菌能不斷擴散及污染周邊區(qū)域。動物性食品中的耐藥菌更是可借助食物鏈直接感染人甚至將耐藥基因轉(zhuǎn)移至人體內(nèi)病原菌中，進一步危害人體健康。此外，細菌適應性的突變進化必將導致新型耐藥菌不斷出現(xiàn)，不斷降低已有抗菌藥物療效。據(jù)報道，世界衛(wèi)生組織(WHO)已于2015年將抗微生物藥物耐藥性列為全球十大健康威脅之一[5]。面對日益嚴峻的細菌耐藥性威脅，人們迫切需要尋找新方法來提高傳統(tǒng)抗菌藥物治療效果。

包合技術是指在一定條件下，將一種分子完全或部分嵌入另一種空穴結構分子內(nèi)部的技術[6]。包合物，即通過包合技術形成的絡合物。其不僅能有效提高抗菌藥物穩(wěn)定性及溶解度，促進藥物體內(nèi)吸收，增加生物利用度，亦可協(xié)助藥物穿越細菌生物膜及細胞膜，提高藥物的抗菌效率。因此，將抗菌藥物制備成包合物，可作為解決細菌耐藥性問題的新方案。本文將簡要概述包合技術的發(fā)展歷史、增強抗菌藥物活性應用現(xiàn)狀以及提高抗菌藥物藥效學機制，以期為獸藥研究者提供些許思路和借鑒。

2 包合技術發(fā)展歷程

1886年，Mylius觀察到某些揮發(fā)性化合物可以與對苯二酚形成包合物，他通過X-射線衍射發(fā)現(xiàn)三分子的對苯二酚可以形成籠狀結構，而某些氣體或液體分子則被包裹于籠中[7]。

1916年，德國化學家Wieland通過X-射線分析觀察到膽酸與其親脂且水不溶性伴侶之間會形成水溶性包合物(如絡合膽酸便是由去氧膽酸和脂肪酸形成的包合物)，并得出“膽汁酸原理”[8]。該發(fā)現(xiàn)使其獲得1927年諾貝爾化學獎[9]。

1940年，Bengen在測量牛奶中脂肪含量時發(fā)現(xiàn)正辛醇和尿素在水相與脂相間形成了一種結晶(即尿素-辛醇包合物)，在去除牛奶后這種結晶依然可以形成[10]。后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，尿素可與含4個碳原子以上的直鏈化合物形成結晶型尿素包合物[11]。這種特性開始被應用于分離純化脂肪族化合物，即尿素包合法[12]。

Freudenberg、Cramer和Plieninger等人在20世紀30年代開始對環(huán)糊精進行研究并于1953年獲得專利，他們證明環(huán)糊精包合物可以保護易氧化物質(zhì)不被氧化、提高難溶藥物溶解度以及減少高揮發(fā)性物質(zhì)損失等[13]。在早期，人們針對小分子物質(zhì)的環(huán)糊精包合技術進行研究。隨著環(huán)糊精在溶液中可與高分子物質(zhì)產(chǎn)生包合反應這一性能被發(fā)現(xiàn)，對高分子物質(zhì)的環(huán)糊精包合技術研究也開始增多[6]。

20世紀50年代Higuchi和Zuck闡明了包合現(xiàn)象的固有特性，自此包合技術開始應用于藥學領域[6]。1967年，Pedersen合成了冠醚并發(fā)現(xiàn)了其與堿性金屬陽離子的選擇性絡合特性[14]。基于Pedersen的工作，Cram開展了一系列關于主——客體化學的研究，認為高度結構化的配合物是合成有機化合物的中心[15]。1968年，Lehn合成了能與多種金屬離子形成包合物的籠狀分子，并首次提出“超分子化學”概念[16]。1987年，Pedersen、Cram同Lehn一起獲得諾貝爾化學獎。在超分子化學引起人們注意的同時，與超分子主體分子有關的包合技術也開始受到關注[6]。

時至今日，以包合物為基礎的藥物，尤其是以β-環(huán)糊精(β-CD)為主體、其他藥物為客體所制成的包合物已經(jīng)被廣泛研究。

3 包合技術增強抗菌藥物活性應用現(xiàn)狀

目前，包合技術在抗菌藥物制劑研制方面的應用主要集中于增強療效及提高生物利用度，以期實現(xiàn)減抗，避免耐藥性問題的進一步發(fā)展。例如，Hsiung等人通過靜電紡絲技術將支鏈淀粉/四環(huán)素-環(huán)糊精包合物轉(zhuǎn)化成抗菌納米纖維，其在唾液中易崩解，對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌的抑菌圈均寬于游離四環(huán)素，這可能是包合物形式增加了四環(huán)素溶解度所致[17]。甲硝唑作為一種溶解性差的抗生素，其臨床應用受到一定限制。Celebioglu等人將其同羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)制備成包合物以提高溶解性，外溶出曲線結果顯示該包合物前30 s藥物溶解量是甲硝唑粉末的4.2～5.1倍[18]。萬古霉素是目前治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染最有效的抗生素。Salih等人用β-CD和油酰胺構成的兩親性衍生物包合萬古霉素以增強其遞送，同游離萬古霉素相比，該包合物對金黃色葡萄球菌以及MRSA的最小抑菌濃度(MIC)分別降低了2倍和4倍，并具有更強的胞內(nèi)細菌清除能力[19]。

4 包合技術提高抗菌藥物藥效學機制

4.1 提高抗菌藥物的穩(wěn)定性 包合物結構能將抗菌藥物同外部惡劣環(huán)境隔開，進而提高藥物穩(wěn)定性。美羅培南作為一種治療耐藥性細菌感染的常用抗菌藥物，其化學不穩(wěn)定性影響了臨床療效[20]。美羅培南結構中的羰基即是親核攻擊重要位點，也是導致其化學不穩(wěn)定性的關鍵所在。Paczkowska等人利用β-CD制備美羅培南包合物，通過封閉羰基提高了其穩(wěn)定性[21]。恩諾沙星同HP-β-CD制備而成的包合物在擁有較好穩(wěn)定性的同時也具有較高溶解度，其于4 ℃環(huán)境中密封儲存6個月，內(nèi)載恩諾沙星含量并無明顯變化[22]。利福平對結核病的治療功效因其溶解性差以及穩(wěn)定性低而被限制。通過捏合法制備利福平的無環(huán)葫蘆脲包合物可有效提高其光穩(wěn)定性，試驗表明，暴露于強光10 d后，該包合物中利福平含量仍高達97.93±0.52%，而在相同條件下普通利福平含量則降低至95.19±0.46%[23]。納他霉素在極端pH值和光照條件下易被破壞從而喪失抗真菌能力，將納他霉素封裝于甲基-β-環(huán)糊精中絡合成包合物，可保留抗真菌活性同時有效緩解極端pH條件下的降解，此外包合物內(nèi)納他霉素在紫外光照射下的保留率也比游離納他霉素高出1倍以上[24]。

4.2 提高抗菌藥物溶解度 某些抗菌藥物由于溶解度偏低而無法最大程度發(fā)揮其抗菌作用。包合物空腔內(nèi)部具有疏水特性，可避免藥物與外部水環(huán)境直接接觸，間接增加疏水性抗菌藥物溶解性，減少藥物使用劑量[25]。研究表明，用HP-β-CD制備的恩諾沙星包合物，可使恩諾沙星溶解度提高916倍[22]。Anjum等人通過共蒸發(fā)法制備了漆樹酸(AnAc)與HP-β-CD的包合物，AnAc水溶性提高了2009倍，同時對金黃色葡萄球菌展示出更高的抗菌及抗生物膜活性[26]。Siva等人采用超聲技術制備了分別含枯茗醛(CA)和異丁香酚(ISOE)的甲基-β-環(huán)糊精包合物，它們使得CA和ISOE溶解度提高10倍及12倍，同時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有更強抑制作用[27]。

4.3 提高抗菌藥物的吸收及生物利用度 環(huán)糊精可通過細胞旁途徑和跨細胞途徑促進機體對抗菌藥物的吸收。一方面，其降低了刷狀緣膜囊泡中緊密連接相關蛋白claudin-4的表達，通過暫時性破壞緊密連接從而協(xié)助藥物分子進入細胞間隙及血液[28]。另一方面，其能提取質(zhì)膜結構成分，破壞脂質(zhì)雙分子層剛性并增加膜流動性，促進藥物分子的跨細胞轉(zhuǎn)運[28]。因此，將抗菌藥物同環(huán)糊精制備成包合物，可改善機體對藥物的吸收，提高抗菌藥物生物利用度。例如，姜黃素作為一種具有強大抗菌效果的光敏劑，因水溶性低和腸膜滲透性差導致生物利用度偏低，這在一定程度上限制了其臨床治療效果。Li等人將姜黃素同環(huán)糊精絡合以形成包合物，有效促進了機體對姜黃素的吸收，其AUC0-∞增加了2.6～2.8倍[28]。Ding等人運用HP-β-CD制備的恩諾沙星包合物，AUC0-∞高達25.97 μg·h/mL，是游離恩諾沙星的2.08倍，這顯著提高了恩諾沙星生物利用度[22]。阿昔洛韋因飽和吸收機制而存在一定的吸收問題，口服生物利用度僅有15～30%，若將其包封進HP-β-CD中，該包合物的AUC0-∞則提升為游離阿昔洛韋的1.5倍[29]。Fan等人通過攪拌法制備了氟苯尼考與HP-β-CD的包合物，其凍干粉末注射液比氟苯尼考商業(yè)注射液吸收速度更快、吸收量更高且消除半衰期延長，有效提高了氟苯尼考生物利用度[30]。

4.4 利用緩釋性能增強抗菌藥物在體內(nèi)作用時間 包合物類似于微型膠囊，具有持續(xù)釋放抗菌藥物的作用，可延長藥物消除半衰期。Basaran與Bozkir將鹽酸環(huán)丙沙星包合進HP-β-CD中，鹽酸環(huán)丙沙星可在8 h內(nèi)持續(xù)釋放[31]。在37 ℃條件下，用于對抗大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的p-茴香醛/β-CD包合物具有24 h持續(xù)釋放作用，其在初始階段呈現(xiàn)明顯突釋現(xiàn)象， 10 h內(nèi)釋放50%以上[32]。而通過將包合物摻進親水性聚合物微粒中，可實現(xiàn)更為優(yōu)異的藥物控釋功能。Li等人制備了含鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的包合物微?；鞈乙?，在開始2 h內(nèi)呈現(xiàn)突釋現(xiàn)象，而后保持一定時間的緩慢持續(xù)釋放，二者在體內(nèi)的消除半衰期分別延長了1.71倍和2.17倍[33]。將氯己定/β-CD包合物與含有牛血清白蛋白的殼聚糖納米顆粒于殼聚糖醋酸溶液中混合以制備新型熱敏水凝膠雙重緩釋系統(tǒng)，該系統(tǒng)中的氯己定可持續(xù)釋放30天[34]。氟苯尼考包合物僅在3 min左右就完全釋放，而Rogel等人將HP-β-CD和氟苯尼考的包合物摻入殼聚糖微粒則實現(xiàn)了氟苯尼考在16 min內(nèi)的持續(xù)釋放[35]。此外，分別將甲硝唑與β-CD及HP-β-CD的包合物摻進殼聚糖納米顆粒內(nèi)，亦可實現(xiàn)甲硝唑500 min的持續(xù)釋放[36]。

4.5 協(xié)助抗菌藥物穿越細菌生物被膜 生物被膜由細菌產(chǎn)生的聚合物基質(zhì)粘合在一起形成，主要成分為多糖、分泌蛋白以及胞外DNA[37]。受到持久性細胞形成、適應性應激、高度粘性、有限營養(yǎng)、較少生長代謝活動以及胞外聚合物基質(zhì)成分等因素影響，生物膜對抗菌藥物具備一定抵抗力，且高度耐受機體免疫系統(tǒng)，抵抗宿主細胞吞噬作用[38]。生物被膜的形成引發(fā)細菌廣泛的適應性變化，使得細菌對傳統(tǒng)抗生素治療與宿主免疫反應的抵抗力提高了近1000倍[39]。

包合物形式可協(xié)助抗菌藥物穿越細菌生物膜，提高其抗菌效果。研究表明，HP-β-CD是具有生物粘附性及生物相容性的生物材料，可促進包合物粘附生物膜[26]。將多西環(huán)素與HP-β-CD絡合，所形成的包合物可借助環(huán)糊精分子與生物膜產(chǎn)生弱相互作用來延長多西環(huán)素與細菌的接觸時間，同游離多西環(huán)素相比，其對放線桿菌的MIC值降低了87.5%[40]。Han等人將二氫卟吩e6和β-CD合成前藥，并與金剛烷封端的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)敏感肽組裝成包合物，通過包合物間的自主裝形成MMP敏感型超分子納米顆粒，該納米顆粒在富含MMP的生物膜微環(huán)境中會發(fā)生表面電荷逆轉(zhuǎn)以及粒徑尺寸變化，實現(xiàn)在生物膜中的高滲透與長期保留[41]。帶正電荷的γ-環(huán)糊精衍生物也能完全穿透細菌生物膜，并通過與帶負電荷的細胞壁產(chǎn)生相互作用來黏附細菌，其與利福平組成的包合物在降低生物膜中細菌活力方面要比游離利福平高出60%[42]。以明膠與環(huán)糊精的共聚物作為主體分子、大黃酸作為客體分子制備而成的包合物則可借助靜電相互作用等方式短時間內(nèi)聚集于細菌生物膜上，通過增加生物膜對其攝取量來高效清除細菌，研究表明其對豬鏈球菌的清除能力是游離大黃酸的2.8倍[43]。

4.6 破壞細菌細胞膜 細胞膜是細菌的保護性屏障。細菌通過改變孔蛋白等組分的表達數(shù)量及類型來降低細胞膜通透性，進而將抗生素隔絕在外，這是細菌產(chǎn)生耐藥性的重要機制之一[44]。研究表明，銅綠假單胞菌的膜通透性比大腸桿菌低10～80倍，因此其對多種抗生素具有更強的抵抗力[45]。同時，孔蛋白表達減少也導致其可在短時間內(nèi)對碳青霉烯類以及頭孢菌素類新型抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性[45]。

包合物能夠直接破壞細菌細胞膜結構，提高膜通透性，增加藥物進入量[46]。研究表明，裝載藥物的環(huán)糊精分子可通過與脂質(zhì)雙分子層發(fā)生疏水相互作用、形成氫鍵等方式來改變細胞膜流動性、通透性及穩(wěn)定性，同時引起胞內(nèi)成分泄漏[47]。Zhao等人制備了六氫-β-酸與環(huán)糊精衍生物的包合物，用其處理金黃色葡萄球菌，細菌細胞膜呈現(xiàn)局部破裂狀態(tài)且通透性升高，同時伴有電解質(zhì)及核酸泄漏[48]。Lin等人將青蒿素封裝至β-CD中以期發(fā)揮較強殺菌作用，該包合物可對MRSA細胞膜造成不可逆破壞，經(jīng)透射電子顯微鏡觀察到處理后的細胞膜呈現(xiàn)出明顯的變形、破壞以及不完整形態(tài)[49]。同樣，用β-CD包封氯己定也顯著增強了氯己定的抗菌活性。該包合物可通過同細胞膜中負電荷受體結合以穿越細胞膜并于胞內(nèi)釋放藥物，經(jīng)透射電子顯微鏡可觀察到其引起細菌產(chǎn)生空泡化、滲漏以及膜缺陷等變化[50]。Hay等人將直鏈淀粉與脂肪胺絡合成新型抗菌包合物，該包合物中的伯胺基團可通過氫鍵和靜電相互作用同細胞膜中陰離子磷酸鹽基團復合，進而借助疏水基團誘導脂質(zhì)雙分子層重組，破壞細胞膜[51]。

5 展 望

抗菌藥物在過去一百年中發(fā)展迅速。然而，多數(shù)細菌對傳統(tǒng)抗菌藥物都產(chǎn)生了一定耐藥性。如今，由細胞膜通透性下降、生物膜形成、主動外排等機制導致的細菌耐藥性已經(jīng)成為全球性問題。如何在避免細菌耐藥性產(chǎn)生的同時減少抗菌藥物的使用劑量，是當前醫(yī)藥領域的一個重點研究方向。自1886年首次發(fā)現(xiàn)籠狀包合物以來，包合技術一直在不斷發(fā)展，并于上世紀50年代開始應用于醫(yī)藥領域。包合物不僅能提高抗菌藥物穩(wěn)定性及溶解度，還能實現(xiàn)持續(xù)釋放，這有效提高了抗菌藥物生物利用度，減少了細菌性感染治療過程中的藥物劑量。更為重要的是，它可通過氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用等方式同細菌生物被膜、細胞膜結合。生物被膜上藥物濃度的提高，促進了膜對藥物的攝取。同時，與細胞膜結合后磷脂雙分子層結構將發(fā)生改變，導致膜通透性升高，利于抗菌藥物穿越細胞膜。因此，將抗菌藥物制備成包合物可提高其抗菌活性，為實現(xiàn)臨床減抗提供新策略。不過，目前包合技術多以環(huán)糊精及其衍生物作為主體分子，在其他主體分子領域研究較少。醫(yī)藥研究者可繼續(xù)探索針對性破壞細菌耐藥機制的新型主體分子并將其與傳統(tǒng)抗菌藥物結合，制備成難以誘導細菌產(chǎn)生耐藥性的新制劑。相信隨著包合技術領域研究的不斷拓寬與深入，其在減抗和限抗領域必將得到進一步發(fā)展。

6 致 謝

本項目感謝中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項“納米抗菌藥物胞內(nèi)靶向轉(zhuǎn)運與釋放及其調(diào)控機制研究”(2662020DKPY008)。