張 聰，程嬋嬋，郝 潔，姚路路，卞夢(mèng)芹，周 冰，李煥娟，周德剛

(洛陽(yáng)惠中獸藥有限公司,河南洛陽(yáng) 471000)

頭孢泊肟酯是日本三共公司開(kāi)發(fā)的第三代口服頭孢菌素，為頭孢泊肟的前體藥物，1990年首次在日本上市，其口服后在腸壁被非特異性酯酶水解為頭孢泊肟經(jīng)腸道吸收[1-2]。頭孢泊肟抗菌作用廣譜，其具有組織分布廣泛，對(duì)β內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，耐受性良好，治療劑量小等優(yōu)點(diǎn)，臨床上主要用敏感菌引起的上、下呼吸道感染、皮膚和軟組織感染、生殖泌尿系統(tǒng)感染、兒科感染[3-5]。在獸醫(yī)臨床領(lǐng)域，2004年碩騰公司開(kāi)發(fā)的頭孢泊肟酯片(商品名：SIMPLICEF?)經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市，用于治療犬由金黃色葡萄球菌等敏感菌引起的皮膚感染，2014年頭孢泊肟酯咀嚼片在美國(guó)批準(zhǔn)上市。為滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)寵物臨床用藥需求，洛陽(yáng)惠中獸藥有限公司仿制開(kāi)發(fā)了頭孢泊肟酯片，并通過(guò)與參比制劑在多種溶出介質(zhì)中溶出行為比較，評(píng)價(jià)自制產(chǎn)品與參比制劑體外溶出的一致性，以期控制并提高自制產(chǎn)品的質(zhì)量，提高生物等效性試驗(yàn)的成功率。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 RC1207DP-RZQ12D型溶出試驗(yàn)儀(配取樣收集系統(tǒng))，天津市天大天發(fā)科技有限公司；UV2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司；AB265-S電子分析天平，梅特勒托利多公司；Seven easy型酸度計(jì)，梅特勒托利多公司。冰醋酸、鹽酸、甘氨酸、氯化鈉、醋酸鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉均為分析純；甲醇為色譜純；水為純化水。

1.2 試藥 頭孢泊肟酯對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130517-201503，含量：以頭孢泊肟計(jì)73.4%)；SIMPLICEF?(碩騰公司，批號(hào)：JH8427，規(guī)格：100 mg)；自制頭孢泊肟酯片(洛陽(yáng)惠中獸藥有限公司，批號(hào)：ZS20191101、ZS20191201、ZS20191202，規(guī)格：100 mg)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶出介質(zhì)的配制 鹽酸溶液(pH 1.5)：量取鹽酸3.73 mL，用水稀釋至1000 mL，搖勻，即得。

甘氨酸-氯化鈉-鹽酸溶液(pH 3.0)：取甘氨酸54.5 g和氯化鈉42.6 g，置1000 mL量瓶中，加水500 mL溶解，緩緩加入鹽酸14.2 mL，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。取貯備液50 mL，加水至900 mL(必要時(shí)，用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0±0.1)。

醋酸鹽緩沖液(pH 4.0)：稱(chēng)取醋酸鈉1.22 g，用適量水溶解后，加入2 mol/L醋酸溶液20.5 mL，用水稀釋至1000 mL，搖勻，即得。

磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)：量取0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液250 mL，0.2 mol/L氫氧化鈉溶液112 mL，用水稀釋至1000 mL，搖勻，即得。

2.2 溶出試驗(yàn)方法 取本品，照《中國(guó)獸藥典》2015年版一部溶出度與釋放度測(cè)定法(附錄0931第二法)[6]，分別在2.1項(xiàng)下的4種溶出介質(zhì)中開(kāi)展溶出試驗(yàn)，體積為900 mL，轉(zhuǎn)速為75 r/min，依法操作，分別在5、10、15、30、45、60 min取樣10 mL，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，同時(shí)補(bǔ)加同溫等體積溶出介質(zhì)。

取上述過(guò)濾后的溶出液，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；另精密稱(chēng)取頭孢泊肟酯對(duì)照品適量，加甲醇適量溶解并用溶出介質(zhì)定量稀釋制成每1 mL中約含頭孢泊肟11 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取供試品溶液和對(duì)照品溶液，照《中國(guó)獸藥典》2015年版一部紫外-可見(jiàn)分光光度法(附錄0401)[6]，分別測(cè)定吸光度，計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累積溶出度。鹽酸溶液(pH=1.5)、甘氨酸-氯化鈉-鹽酸溶液(pH=3.0)、醋酸鹽緩沖液(pH=4.0)、磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為262、259、255、253 nm。

根據(jù)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累積溶出度，繪制溶出曲線(xiàn)，計(jì)算自制產(chǎn)品與參比制劑溶出曲線(xiàn)相似因子(f2)。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 稱(chēng)取頭孢泊肟酯對(duì)照品約30 mg，置200 mL量瓶中，加甲醇2 mL溶解后，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，制成濃度為0.11 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取儲(chǔ)備液10 mL，置100 mL量瓶中，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，制成濃度為11 μg/mL的對(duì)照品溶液，在190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.2 輔料干擾試驗(yàn) 稱(chēng)取空白輔料10.35 mg，置100 mL量瓶中，加溶出介質(zhì)至近刻度，超聲充分溶解后，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，過(guò)濾，取續(xù)濾液10 mL，置100 mL量瓶，加溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，在190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.3 取樣時(shí)間點(diǎn)選擇 取參比制劑SIMPLICEF?，照2.2項(xiàng)下方法試驗(yàn)，分別于為5、10、15、20、30、45、60 min時(shí)取樣測(cè)定，計(jì)算各取樣時(shí)間點(diǎn)的累積溶出度，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.4 重復(fù)性考察 取自制頭孢泊肟酯片12片，照2.2項(xiàng)下方法試驗(yàn)，在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)分別取樣測(cè)定，計(jì)算各取樣時(shí)間點(diǎn)的累積溶出度，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.5 溶出液穩(wěn)定性考察 溶出液室溫放置，分別在0、0.5、1、2、3、4 h，照2.2項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.6 濾膜吸附考察 用注射器吸取溶出液10 mL，經(jīng)聚醚砜微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾，分別棄去前1、2、3、4、5 mL濾液后，收集剩余續(xù)濾液；另取溶出液10 mL，4000轉(zhuǎn)/min離心5 min，取上清液。取各續(xù)濾液及上清液，照2.2項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.7 線(xiàn)性和范圍考察 精密量取2.3.1項(xiàng)下制備的對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、5、10、12 mL，分別置100 mL量瓶中，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液，照2.2項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.8 回收率考察 分別精密稱(chēng)取頭孢泊肟酯適量，再精密加入適量空白輔料，混勻，制成含頭孢泊肟相當(dāng)于標(biāo)示量的50%、70%、100%的供試品。精密稱(chēng)取供試品適量，置250 mL量瓶中，加入適量溶出介質(zhì)，超聲處理30 min使完全溶解，放冷，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，分別制成相當(dāng)于檢測(cè)濃度50%、70%、100%的供試品溶液。照2.2項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 溶出曲線(xiàn)測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證總結(jié)Tab 1 Summary of validation of dissolution curve determination methodology

2.4 不同溶出介質(zhì)中溶出曲線(xiàn)考察 取自制頭孢泊肟酯片和參比制劑SIMPLICEF?，照2.2項(xiàng)下方法試驗(yàn)，分別測(cè)定樣品在4種溶出介質(zhì)中的溶出曲線(xiàn)，自制頭孢泊肟酯片與SIMPLICEF?在鹽酸溶液(pH=1.5)中15 min內(nèi)的累積溶出度均超過(guò)85%，在其他3種介質(zhì)中的相似因子(f2)均大于50，根據(jù)《普通口服固體制劑溶出曲線(xiàn)測(cè)定與比較指導(dǎo)原則》，表明3批自制頭孢泊肟酯片與參比制劑SIMPLICEF?在4種溶出介質(zhì)中的溶出行為均相似，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖4和表2所示。

表2 自制頭孢泊肟酯片與SIMPLICEF?在4種介質(zhì)中的溶出結(jié)果(n=12)Tab 2 Dissolution results of self made cefpodoxime proxetil tablets and simplicef ?in four media (n=12)

圖1 自制頭孢泊肟酯片與SIMPLICEF?在鹽酸溶液(pH 1.5)中的溶出曲線(xiàn)對(duì)比Fig 1 self made cefpodoxime proxetil tablets and simplicef ? Comparison of dissolution curves in hydrochloric acid solution (pH 1.5)

圖2 自制頭孢泊肟酯片與SIMPLICEF?在甘氨酸-氯化鈉-鹽酸溶液(pH 3.0)中的溶出曲線(xiàn)對(duì)比Fig 2 self made cefpodoxime proxetil tablets andsimplicef ? Comparison of dissolution curves in Glycine-sodium-chloride hydrochloric acid solution (pH 3.0)

圖3 自制頭孢泊肟酯片與SIMPLICEF?在醋酸鹽緩沖液(pH 4.0)中的溶出曲線(xiàn)對(duì)比Fig 3 self made cefpodoxime proxetil tablets and simplicef ? Comparison of dissolution Acetate buffer (pH 4.0)

圖4 自制頭孢泊肟酯片與SIMPLICEF?在磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)中的溶出曲線(xiàn)對(duì)比Fig 4 self made cefpodoxime proxetil tablets andcurves in simplicef ? Comparison of dissolution curves inPhosphate buffer (pH 6.8)

3 討論與小結(jié)

3.1 不同介質(zhì)溶出曲線(xiàn)區(qū)分力比較 頭孢泊肟酯片在《中國(guó)藥典》2020年版、USP 40版和JP 17版均有收載，JP17版中溶出度測(cè)定使用的介質(zhì)為水，在《中國(guó)藥典》2020年版和USP 40版中溶出度測(cè)定使用的介質(zhì)為甘氨酸-氯化鈉-鹽酸溶液(pH 3.0)[7-9]。國(guó)內(nèi)學(xué)者曾對(duì)頭孢泊肟酯片的溶出度方法進(jìn)行研究[10-11]，分別以0.1 mol/L鹽酸溶液(pH 1.2)、甘氨酸-氯化鈉-鹽酸溶液(pH 3.0)和水為溶出介質(zhì)對(duì)國(guó)內(nèi)樣品的溶出度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甘氨酸-氯化鈉-鹽酸溶液(pH 3.0)和水為溶出介質(zhì)時(shí)溶出曲線(xiàn)有較好的區(qū)分力，以甘氨酸-氯化鈉-鹽酸溶液(pH 3.0)為溶出介質(zhì)更為合理。

3.2 溶出介質(zhì)的選擇依據(jù) 根據(jù)FDA文件公開(kāi)的Putney公司犬用頭孢泊肟酯片研究資料，除了以甘氨酸-氯化鈉-鹽酸溶液(pH 3.0)為溶出介質(zhì)進(jìn)行溶出曲線(xiàn)的考察之外，也采用了甘氨酸-氯化鈉-鹽酸溶液(pH 1.5)、甘氨酸-氯化鈉-鹽酸溶液(pH 3.5)、甘氨酸-氯化鈉-鹽酸溶液(pH 6.8)進(jìn)行溶出曲線(xiàn)的考察。根據(jù)《普通口服固體制劑溶出曲線(xiàn)測(cè)定與比較指導(dǎo)原則》，選擇與FDA公開(kāi)資料中pH值相近的溶出介質(zhì)進(jìn)行溶出曲線(xiàn)的考察，溶出介質(zhì)分別為：鹽酸溶液(pH值1.5)、甘氨酸-氯化鈉-鹽酸溶液(pH 3.0)、醋酸鹽緩沖溶液(pH值4.0)、磷酸鹽緩沖溶液(pH值6.8)。

體外溶出試驗(yàn)是評(píng)價(jià)口服固體制劑質(zhì)量的重要方法之一，其與制劑的生物利用度存在很大的關(guān)聯(lián)性[12]。普通口服固體制劑，可采用比較仿制制劑與參比制劑體外多條溶出曲線(xiàn)相似性的方法，評(píng)價(jià)仿制制劑的質(zhì)量，該法可降低兩者出現(xiàn)臨床療效差異的風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過(guò)比較自制頭孢泊肟酯片與參比制劑SIMPLICEF?在多種pH值溶出介質(zhì)中的溶出行為，評(píng)價(jià)其體外溶出一致性，結(jié)果顯示，在各種介質(zhì)中兩者的溶出曲線(xiàn)均相似，表明自制頭孢泊肟酯片與參比制劑SIMPLICEF?的溶出行為基本一致，為其體內(nèi)生物等效性評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。