謝仁芬 申曉東 鄧榮界 劉陽麗 敖道嬌 陳天美 李昌玉 楊群松

流行性感冒多數(shù)是因流感病毒引發(fā)的上呼吸道感染，一般表現(xiàn)為高熱、全身酸痛、咳嗽、流鼻涕等，同時會伴有呼吸道癥狀［1］。流感病毒是一種RNA 病毒，為呼吸道感染的病原體之一，具人群普遍易感、季節(jié)性流行等特點［2］。該病毒傳播迅速，在學校、幼托機構(gòu)及養(yǎng)老院等人群聚集場所可爆發(fā)疫情，既往報道顯示［3］，全球成人流感病毒感染率與患病率較高，每年季節(jié)性流感在全球可致300～500 萬重癥病例，其中約有29～65 萬病例發(fā)生死亡，兒童為重癥流感高危人群，患流感后病人發(fā)生嚴重疾病風險將會極大提高，嚴重威脅其生命安全。因此，了解流感發(fā)病的流行病學特征，對流感預(yù)防具重要意義。本研究對流感樣病例鼻咽拭子分別行流感病毒陽性樣本篩選及陽性毒株分離，以了解研究地區(qū)流感病毒監(jiān)測情況及流行病學特征，旨在為該地區(qū)流感預(yù)防與診療提供可靠依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2020 至2021年昭通市中醫(yī)醫(yī)院及送檢的18 798 份流感樣病例進行病原學監(jiān)測，并將流感樣病例（influenza-like illness，ILI）監(jiān)測數(shù)據(jù)年齡、性別、職業(yè)、季節(jié)等進行錄入，據(jù)《全國流感監(jiān)測方案》［4］相關(guān)定義與標準，體溫在38℃及以上且伴發(fā)咳嗽、咽痛其中一種癥狀為ILI。流感樣病例暴發(fā)疫情報告標準［5］：同一集體環(huán)境如學校、集體單位等在1 周內(nèi)發(fā)生ILI≥10 例。ILI 突發(fā)公共衛(wèi)生事件：同一集體環(huán)境如學校、集體單位等在1 周內(nèi)1 周內(nèi)發(fā)生ILI≥30 例，或存在5 例及以上ILI（留觀除外），或存在2 例及以上ILI 發(fā)生死亡。采集的標本均在48 h 之內(nèi)送至流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室，于2～8℃環(huán)境保存，且防止反復凍融。接收標本的人員需在2 d 內(nèi)于“中國流感監(jiān)測信息系統(tǒng)”將“流感樣病例標本原始登記送檢表”錄入其中。

1.2 方法

1.2.1 實驗試劑與儀器

主要實驗試劑與儀器：依據(jù)流感診斷相關(guān)標準指南［6］流感病毒核酸檢測試劑由廣州達安基因股份有限公司提供，胎牛血清（10100147-Gibco，澳洲）及賽默飛Nunc EasYFlask 細胞培養(yǎng)瓶，安譽AGS4800 型實時熒光定量PCR 儀，Nextera XT DNA 文庫構(gòu)建試劑盒（上海雅思創(chuàng)生物科技有限公司，規(guī)格：24samples）。

1.2.2 鼻咽拭子PCR 檢測

采用real-time RT-PCR 技術(shù)與甲型/乙型流病毒分型的鑒定的特異性引物探針檢測，PCR 擴增循環(huán)條件設(shè)置為：50℃15 分鐘1 個循環(huán)、95℃15 分鐘1 個循環(huán)、94℃15 秒→58℃45 秒（收集熒光）45 個循環(huán)。將檢測結(jié)果為陽性的核酸標本篩選出來，進行進一步試驗。

1.2.3 病原學監(jiān)測

采用MDCK 細胞培養(yǎng)技術(shù)行流感病毒核酸陽性標本細胞分離，流感病毒MDCK 細胞分離步驟：①細胞維持液和病毒生長液配置；②75%～90%成片細胞的準備（細胞需用Hank's 液清洗3 遍）；③細胞培養(yǎng)瓶的接種（細胞病變的特征是細胞腫脹圓化，細胞間隙增大，細胞核固縮或破裂，嚴重時細胞部分或全部脫落）；④細胞培養(yǎng)物的收獲：當75%～100%細胞出現(xiàn)病變時進行收獲，收獲之前可以將細胞放于-70℃冰箱，凍融1～2 次，以提高收獲標本的病毒滴度。即使無細胞病變也應(yīng)該于接種后第7 天收獲。收獲病毒液時，先溫和搖動細胞瓶數(shù)次，然后用10 mL 的無菌移液管吸取病毒液置于15 mL 無菌離心管中，混勻病毒。收獲的病毒液可以立即進行后續(xù)試驗，或凍于-80℃冰箱待以后試驗使用。并采用血凝抑制實驗鑒定病毒毒株型號。

1.3 統(tǒng)計學方法

用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理；計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗；以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 2020年～2021年昭通市中醫(yī)醫(yī)院及不同變量流感病毒分布情況與陽性率檢出情況

18 798 份流感樣病例鼻咽拭子共檢出2 054份流感陽性標本，檢出陽性率為10.93%（2 054/18 798）。鼻拭子、鼻炎抽取物和鼻洗液樣本檢出率較咽拭子樣本檢出率高，冬季檢出率高于其他季節(jié)檢出率，5～15 歲年齡段檢出陽性率高于其他年齡段陽性檢出率占比，學生流感病毒檢出陽性率占真?zhèn)€陽性檢出率高于其他職業(yè)流感病毒陽性率檢出占比，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；多數(shù)初診首要診斷以急性上呼吸道感染、急性扁桃體炎、發(fā)熱原因待查為主，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 2020年～2021年及醫(yī)院不同變量流感病毒分布情況與陽性率檢出情況［n（%）］Table 1 Distribution of influenza virus and positive detection rate with different variables in hospitals between 2020 and 2021［n（%）］

2.2 2020年2月～2021年1月及各月份流感樣病例ILI 病原監(jiān)測情況

病原檢測結(jié)果顯示，流感病毒陽性檢出率較高月份分別為2020年2月、12月及2021年1月，其中2021年1月檢出率最高。ILI 病原甲型（A型）H1N1 居主要流行優(yōu)勢，乙型（B 型）BV 系居次要流行優(yōu)勢。2020年4～6月，ILI 病原甲型（A 型）H1N1 居主要流行優(yōu)勢，乙型（B 型）BV 系居次要流行優(yōu)勢；2020年7～9月ILI 病原甲型（A 型）H2N3 居主要流行優(yōu)勢，乙型（B 型）BV 系居次要流行優(yōu)勢。見表2。

表2 2020年2月～2021年1月及各月份流感樣病例ILI 病原監(jiān)測情況Table 2 Surveillance of ILI pathogens between February 2020 and January 2021

3 討論

本研究流感樣病例病原檢測結(jié)果與廈門［7］、南寧市［8］等地流感病毒監(jiān)測結(jié)果相近。由于地理原因本研究與崔燕紅等［9］研究乙型流感占據(jù)主要流行優(yōu)勢不同，我國南方多地如蘇州、溫州等乙型ILI 病原為主要流行毒株。另相關(guān)文獻報道［10］，近年乙型流感病毒監(jiān)測檢出陽性毒株概率有上升趨勢。分析其原因為，既往感染乙型流感病毒的人群相對較少，多數(shù)人體不具備相應(yīng)病毒抗體，加上人員流動性大，氣候多變，擴大了傳播可能性，在適當情況下會引起乙型流感病毒大范圍感染。

本研究結(jié)果顯示，從樣本類型看，鼻拭子、鼻炎抽取物和鼻洗液樣本檢出率較咽拭子樣本檢出率的高。有研究表明［11］，采集方式不同卻直接影響著核算檢測準確率，被采集者在口腔提取咽拭子時，會有嚴重的惡心反應(yīng)，就有可能采不到咽后壁，因而會影響檢出率；從流行年齡段看，不同年齡段流感病毒檢出率存在差異，5～15 歲年齡段檢出陽性率明顯高于其他年齡段，這與Jackson等［12］的研究結(jié)果基本一致。分析其原因，年齡在15 以下的人群存在免疫系統(tǒng)發(fā)育未完全的問題，加之處在學校等人群聚集場所，為流感病毒提供了較好的傳播條件，從而明顯提高了大范圍感染風險。其次，已有研究結(jié)果顯示［13］，年齡在5 歲以下的兒童乙型流感病毒為占據(jù)主要流行優(yōu)勢，可能是因為流感病毒為引發(fā)兒童社區(qū)獲得性肺炎的重要病原之一。

從病原監(jiān)測情況看，2020年4～6月，ILI 病原甲型（A 型）H1N1 居主要流行優(yōu)勢，乙型（B 型）BV 系居次要流行優(yōu)勢；2020年7～9月ILI 病原甲型（A 型）H2N3 居主要流行優(yōu)勢，乙型（B 型）BV 系居次要流行優(yōu)勢，主要呈現(xiàn)甲型、乙型流感交替流行的趨勢。這與Pi?igoi 等［14］研究結(jié)果相一致。樊佩佩等［15］報道顯示，我國南方城市流感爆發(fā)主要在冬季和春季，流感病毒陽性率檢出高峰出現(xiàn)在冬季，由于病毒流行與氣候及降雨情況有關(guān)，因而顯示春季流行病毒感染率較高。本研究調(diào)查地區(qū)屬于南方，氣候較為溫暖多雨，因而符合上述季節(jié)性流行趨勢。

另外，不同職業(yè)及初診首要診斷情況流感病毒檢出率比較差異有統(tǒng)計學意義，學生流感病毒檢出陽性率高于其他職業(yè)。分析其原因，學生與外界接觸較多，學齡兒童為高感染風險人群，因此感染風險較其他職業(yè)高［16］。本研究，多數(shù)初診首要診斷以急性上呼吸道感染、急性扁桃體炎、發(fā)熱原因待查為主，提示診斷時當患者患有上述疾患時，需根據(jù)季節(jié)特點考慮流感發(fā)生可能性。

綜上所述，2020～2021年昭通市中醫(yī)醫(yī)院及流感病毒陽性檢出類型以甲型為主，乙型占據(jù)次要流行優(yōu)勢，其流行趨勢與季節(jié)、人群年齡段、職業(yè)等情況相關(guān)，可根據(jù)毒株流行優(yōu)勢情況，對學齡兒童施行組織性流感疫苗接種，做好相關(guān)防護知識宣傳，并采取有效措施來預(yù)防和控制疫情暴發(fā)流行。