石慧敏，葉建仁*，王 焱，陸藍翔，史紀武

(1.南京林業(yè)大學林學院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.上海市林業(yè)總站，上海 200072)

農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中常施用大量化肥促植物增產(chǎn)，而過度的化肥使用會導致土壤養(yǎng)分結(jié)構(gòu)失調(diào)，微生物活性降低[1-2]。隨著人們對生態(tài)環(huán)境和可持續(xù)發(fā)展的重視，一些化學藥劑在許多地區(qū)已被限制使用，無污染高效率的微生物制劑逐漸被重視起來[3]。微生物制劑是指一類含有活性微生物的生物產(chǎn)品，有促生增產(chǎn)、改善生態(tài)、抗蟲抗病的效果[4]。隨著生產(chǎn)研究的深入，微生物制劑的需求量急劇上升，但有效活菌數(shù)少、產(chǎn)品儲存時間短、發(fā)酵成本高等問題，嚴重限制了微生物制劑的快速發(fā)展。芽孢桿菌隸屬芽孢桿菌科芽孢桿菌屬(Bacillus)，是一類能產(chǎn)生內(nèi)生芽孢的革蘭陽性菌。該菌能產(chǎn)生壁厚、含水量低、抗逆性強的休眠芽孢，以此度過不良逆境[5]，因而得到廣泛開發(fā)利用。在現(xiàn)有微生物制劑中，80%以上為芽孢桿菌屬制劑。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是一類有良好應(yīng)用價值的芽孢桿菌，其分泌的酶、抗生素或抗菌蛋白等活性物質(zhì)能夠廣泛抑制植物病原真菌和細菌的活性，減少植物病害；且具有解磷、解鉀、固氮，產(chǎn)生植物生長因子等作用，可促進植物養(yǎng)分吸收[6]。Vardharajula等[7]發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌能夠影響作物滲透調(diào)節(jié)，從而緩解玉米幼苗干旱脅迫負效應(yīng)，提高植物生長量。Chowdhury等[8]研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌菌株FZB42的生防作用的主要機制可能是其代謝產(chǎn)物對植物誘導抗性的刺激，從而保護植物免受病原菌、病毒和線蟲的攻擊。Fu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，生防貝萊斯芽孢桿菌菌株NJN-6能夠有效防止香蕉枯萎病，降低尖孢鐮刀菌的豐度，且貝萊斯芽孢桿菌還具有安全、抗逆性強、穩(wěn)定性好、耐儲存、復活率高、易定殖等優(yōu)勢[10]。因此，研究開發(fā)具有促生抗病作用的貝萊斯芽孢桿菌菌株具有廣闊應(yīng)用前景。

貝萊斯芽孢桿菌菌株YH-18是從櫻花枝干中分離出來的1株具有固氮、耐鹽、解磷、可提高植物抗性和促生增產(chǎn)的有益微生物，能有效預防櫻花、桃樹、葡萄等植物的根癌病，防效達80%以上[11-12]。本研究以提高發(fā)酵液中的芽孢數(shù)和延長儲存時間為目標，通過優(yōu)化菌株YH-18的培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件，降低發(fā)酵生產(chǎn)成本，提高發(fā)酵液有效活菌數(shù)，為貝萊斯芽孢桿菌的工業(yè)化擴大生產(chǎn)和推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與菌株

細菌活化、種子液和單因素基礎(chǔ)培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基。菌落計數(shù)培養(yǎng)基為LB固體培養(yǎng)基。

貝萊斯芽孢桿菌菌株YH-18，前期從櫻花枝干中分離篩獲，保藏于南京林業(yè)大學森林保護實驗室。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株C58，為山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院周傳恩教授惠贈。

1.2 菌株活化、種子液的制備及活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率計數(shù)方法

采用平板劃線法將根癌農(nóng)桿菌菌株C58、貝萊斯芽孢桿菌菌株YH-18原菌液接種在LB固體平板上，在28 ℃細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h得到單菌落。

挑取劃線長出的單菌落，轉(zhuǎn)接于裝液20 mL的LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、200 r/min恒溫搖床中培養(yǎng)18 h，得到一級種子液。將活化后的一級種子液以1%(體積分數(shù))的接菌量接種于相同條件下培養(yǎng)18 h后得到的菌液作為后續(xù)種子液。

活菌計數(shù)采用稀釋涂布平板法[13]。

芽孢數(shù)統(tǒng)計時，先將待測菌液于80 ℃水浴15 min，使菌體失活，再使用稀釋涂布平板法，確定發(fā)酵液中芽孢數(shù)量[14]。

1.3 單因素優(yōu)化試驗

1.3.1 最適培養(yǎng)基組分優(yōu)化

參照洪鵬等[15]、葉云峰等[16]的研究方法，分別選擇幾種供試碳源(葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉、牛肉膏、酵母提取物、糖蜜)、氮源[豆粕、豆餅、玉米漿干粉、生豆粉、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、NH4Cl、(NH4)2SO4、尿素]和無機鹽[氯化鈉(NaCl)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)、碳酸鈣(CaCO3)、硫酸鎂(MgSO4)、硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)]，等量替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的相應(yīng)組分。在50 mL三角瓶裝液量40%(后同)、接菌量1%(體積分數(shù)、后同)、轉(zhuǎn)速200 r/min、28 ℃的條件下，搖培72 h后計數(shù)，測定每毫升活菌數(shù)和芽孢數(shù)并計算芽孢率，確定最佳碳源、氮源和無機鹽種類。篩選各組分在不同濃度(質(zhì)量分數(shù))時對菌株YH-18產(chǎn)孢的影響，以此確定后續(xù)添加濃度。

1.3.2 最適培養(yǎng)條件優(yōu)化

使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分，以接菌量1%，初始pH 7.0、裝液量40%、溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min為初始(常規(guī))培養(yǎng)條件。分別對發(fā)酵溫度、初始pH、接菌量、裝液量、轉(zhuǎn)速等5個因素的不同設(shè)置值依次進行單因素試驗，考查YH-18發(fā)酵液中的芽孢數(shù)和芽孢率的變化情況，以確定后續(xù)發(fā)酵條件的控制范圍。

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

1.4.1 Plackett-burman(PB)試驗

參照胡升等[17]、張麗霞[18]的研究方法，在單因素優(yōu)化試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，利用Design expert 10.0.1制定PB試驗方案，每個變量設(shè)置1個低水平和1個高水平，每組試驗均設(shè)3次重復。以菌株YH-18發(fā)酵液芽孢數(shù)為響應(yīng)值，篩選出對芽孢數(shù)量影響顯著的因素。

1.4.2 最陡爬坡試驗

根據(jù)PB試驗結(jié)果篩選出影響產(chǎn)孢比較顯著的因素，并確定爬坡方向和步長，快速逼近最佳區(qū)域，以此得到box-behnken design(BBD)的中心點。

1.4.3 BBD試驗

依據(jù)PB試驗和爬坡試驗篩選出的變量及濃度設(shè)計BBD試驗，使用Design expert 10.0.1軟件對試驗結(jié)果進行分析處理。

1.5 優(yōu)化發(fā)酵液去菌體濾液抑菌能力檢測及儲存時間檢測

將未使用優(yōu)化配方(LB培養(yǎng)基、初始培養(yǎng)條件)的發(fā)酵液和使用優(yōu)化配方的發(fā)酵液5 000 r/min離心10 min，取上清液過細菌濾膜。隨后將根癌農(nóng)桿菌菌株C58種子液以0.2%(體積分數(shù))接種于兩種(優(yōu)化與未優(yōu)化)分別添加了0.5%(體積分數(shù))發(fā)酵液去菌體濾液的LB培養(yǎng)基中，使用全自動微生物生長曲線分析儀，觀察48 h內(nèi)根癌農(nóng)桿菌的生長情況。

在100 L發(fā)酵罐中采用常規(guī)發(fā)酵，即使用NA培養(yǎng)基(60%體積分數(shù)裝液量)、2%(體積分數(shù))種子液接種量、200 r/min、pH 7.0～7.2、初始通氣量50 L/h、溫度28 ℃條件下，發(fā)酵24 h后得到未優(yōu)化配方發(fā)酵液。另在100 L發(fā)酵罐中采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行發(fā)酵，且保持后續(xù)溶氧在50%以上的條件下，待發(fā)酵液芽孢率在80%以上后停止發(fā)酵，得到優(yōu)化配方發(fā)酵液。將使用未優(yōu)化配方和優(yōu)化后配方發(fā)酵得到的發(fā)酵液同時保存在4 ℃冰箱內(nèi)，每隔4個月檢測其發(fā)酵液內(nèi)活菌數(shù)和芽孢數(shù)量。

不同小寫字母表示同一指標不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Different lower case letters indicate significant differences of the same index among different treatments at 0.05 level.The same below.圖1 不同碳氮源及其質(zhì)量分數(shù)對貝萊斯芽孢桿菌菌株YH-18活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率的影響Fig.1 Effects of different types of carbon and nitrogen sources and concentrations of carbon and nitrogen sources on the number of viable bacteria,spores and spore rate of Bacillus velezensis strain YH-18

1.6 數(shù)據(jù)分析與處理

利用SPSS 22.0軟件進行方差分析和Duncan多重比較(α=0.05)，采用Origin 8.5進行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝萊斯芽孢桿菌菌株YH-18產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基成分篩選

2.1.1 不同碳源對菌株YH-18產(chǎn)芽孢的影響

分析可知，在不同碳源中貝萊斯芽孢桿菌菌株YH-18的芽孢數(shù)由高到低為葡萄糖>糖蜜>酵母提取物>可溶性淀粉>玉米粉>蔗糖>牛肉膏(圖1A)。葡萄糖為碳源時，活菌數(shù)和芽孢數(shù)最多，為8.89×108和5.44×108cfu/mL，芽孢率達61.25%。因此宜選擇葡萄糖作為YH-18產(chǎn)芽孢的最適碳源。由圖1B可知，芽孢數(shù)和活菌數(shù)在不同質(zhì)量分數(shù)葡萄糖處理下數(shù)量不同，芽孢數(shù)和芽孢率都是當葡萄糖質(zhì)量分數(shù)為1.0%時達到最高值，活菌數(shù)和芽孢數(shù)達4.96×108和4.78×108cfu/mL，芽孢率為96.37%。因此，選擇質(zhì)量分數(shù)1%的葡萄糖作為YH-18產(chǎn)芽孢發(fā)酵的后續(xù)碳源濃度。

2.1.2 不同氮源對菌株YH-18產(chǎn)芽孢的影響

分析(圖1C)可知，菌株YH-18以植物源材料(豆粕、豆餅、玉米漿干粉、生豆粉)為氮源時活菌數(shù)和芽孢數(shù)普遍較高，以無機氮源[NH4Cl、(NH4)2SO4、尿素]為氮源時活菌數(shù)和芽孢數(shù)都非常低，以蛋白胨、胰蛋白胨、魚蛋白胨、大豆蛋白胨等有機氮源作為氮源時活菌數(shù)和芽孢數(shù)介于兩者之間。當以玉米漿干粉作為氮源時，活菌數(shù)和芽孢數(shù)最多，分別為1.54×109和1.34×109cfu/mL，芽孢率為87.30%。因此，選擇玉米漿干粉為菌株YH-18產(chǎn)芽孢的最適發(fā)酵培養(yǎng)基氮源。由圖1D可知，雖然活菌數(shù)總體是隨玉米漿干粉質(zhì)量分數(shù)增加呈現(xiàn)逐步升高趨勢，但芽孢數(shù)則是在玉米漿干粉質(zhì)量分數(shù)為1.0%時，YH-18的芽孢數(shù)最多，達1.35×109cfu/mL，此時芽孢率為77.19%。因此，選擇1.0%的玉米漿干粉作為YH-18產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)的后續(xù)氮源濃度。

2.1.3 不同無機鹽對菌株YH-18產(chǎn)芽孢的影響

經(jīng)分析可知(圖2A)，在7種不同的無機鹽中，以磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)、碳酸鈣(CaCO3)或硫酸鎂(MgSO4)為無機鹽時，菌株YH-18產(chǎn)芽孢數(shù)相對較多，分別是1.02×109、1.12×109和1.00×109cfu/mL，芽孢率分別為89.20%、51.42%和85.90%。雖然硫酸錳(MnSO4)的芽孢數(shù)也較多，但由于錳離子易造成土壤污染，故不選擇硫酸錳作為后續(xù)無機鹽?？紤]到不同無機鹽種類可以提供不同的生長和產(chǎn)孢作用，因此選擇磷酸氫二鉀、碳酸鈣、硫酸鎂三者混合使用作為供試菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的無機鹽。由圖2B-2D可知，當碳酸鈣質(zhì)量分數(shù)為0.4%時，芽孢數(shù)最多，活菌數(shù)和芽孢數(shù)分別為1.11×109和1.11×109cfu/mL，芽孢率為99.85%。當硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)為0.2%時，芽孢數(shù)最多，活菌數(shù)和芽孢數(shù)分別為2.10×109和1.46×109cfu/mL，芽孢率為69.18%。當磷酸氫二鉀質(zhì)量分數(shù)為0.4%時，芽孢數(shù)最多，活菌數(shù)和芽孢數(shù)分別為1.60×109和1.50×109cfu/mL，芽孢率為93.34%。因此，選擇0.4%碳酸鈣、0.2%硫酸鎂、0.4%磷酸氫二鉀為后續(xù)培養(yǎng)基中無機鹽添加量。

圖2 不同種類無機鹽及其質(zhì)量分數(shù)對貝萊斯芽孢桿菌菌株YH-18活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率的影響Fig.2 Effects of different types of inorganic salts and different concentrations of inorganic salts on the number of viable bacteria,spores and spore rate of Bacillus velezensis strain YH-18

2.2 貝萊斯芽孢桿菌菌株YH-18產(chǎn)芽孢的培養(yǎng)條件篩選

由培養(yǎng)轉(zhuǎn)速篩選結(jié)果(圖3A)可知，當轉(zhuǎn)速為200 r/min時，菌體數(shù)和芽孢數(shù)最高，分別為1.53×109和1.16×109cfu/mL，芽孢率為75.54%，活菌數(shù)和芽孢數(shù)均顯著優(yōu)于其他處理。因此，選擇菌株YH-18產(chǎn)芽孢發(fā)酵后續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為200 r/min。

由裝液量篩選結(jié)果(圖3B)可知，當裝液量為20%時，雖然芽孢率可達100%，但菌體數(shù)和芽孢數(shù)都較低。當裝液量為40%時，菌體數(shù)和芽孢數(shù)最高，分別為1.80×109和1.30×109cfu/mL，芽孢率為72.52%。因此，選擇菌株YH-18產(chǎn)芽孢發(fā)酵的后續(xù)培養(yǎng)裝液量為40%。

由初始pH的篩選結(jié)果(圖3C)可知，活菌數(shù)和芽孢數(shù)在pH為6.4～7.9范圍比較合適，其中當pH為7.3時，菌體數(shù)和芽孢數(shù)達最高，分別為1.83×109和1.52×109cfu/mL，芽孢率為83.21%。較低和較高pH都不太適合大量活菌和芽孢產(chǎn)生。因此選擇菌株YH-18產(chǎn)芽孢后續(xù)培養(yǎng)的pH為7.3。

圖3 不同培養(yǎng)條件對貝萊斯芽孢桿菌菌株YH-18活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率的影響Fig.3 Effects of different incubation conditions on the number of viable bacteria,spores and spore rate of Bacillus velezensis strain YH-18

由培養(yǎng)溫度篩選結(jié)果(圖3D)可知，菌株YH-18在22～37 ℃溫度范圍均可生長繁殖，菌體數(shù)、產(chǎn)芽孢數(shù)和芽孢率在不同溫度下有明顯變化。當培養(yǎng)溫度為33 ℃時，活菌數(shù)和芽孢數(shù)均達到最高值，分別為1.73×109和1.62×109cfu/mL，芽孢率為93.74%。因此，選擇YH-18產(chǎn)芽孢發(fā)酵的后續(xù)培養(yǎng)溫度為33 ℃。

由接菌量篩選結(jié)果(圖3E)可知，當接菌量為0.5%時，活菌數(shù)和芽孢數(shù)最高，分別為2.14×109和1.65×109cfu/mL，芽孢率為77.36%。當接菌量超過0.5%時，芽孢數(shù)降低。因此，選擇菌株YH-18產(chǎn)芽孢發(fā)酵的后續(xù)培養(yǎng)接菌量為0.5%。

2.3 貝萊斯芽孢桿菌YH-18產(chǎn)芽孢培養(yǎng)的響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 PB試驗

運用Design expert 10.0.1軟件設(shè)計PB試驗，結(jié)果與分析見表1。

表1 PB試驗各因素方差分析Table 1 Analysis of variance for each factor in the PB trial

2.3.2 最陡爬坡試驗

由PB試驗可知，氮源(玉米漿干粉)和裝液量具有負效應(yīng)，在爬坡試驗中應(yīng)逐漸減小，接菌量具有正效應(yīng)，應(yīng)逐漸增大。經(jīng)分析可知(表2)，菌株YH-18發(fā)酵液芽孢數(shù)最高值出現(xiàn)在試驗4，應(yīng)選擇試驗4的條件作為響應(yīng)面試驗因素水平的中心點，即0.8%質(zhì)量分數(shù)玉米漿干粉、1.1%接菌量、32%裝液量。

表2 最陡爬坡試驗Table 2 Steepest climb test

2.3.3 BBD試驗

將最陡爬坡試驗中的氮源質(zhì)量分數(shù)、接菌量和裝液量分別標記為A、B、C，BBD試驗結(jié)果與分析見表3。模型R2=90.68%，R2adj=78.70%，P<0.01，失擬項P>0.05，說明該模型可靠，可用于分析與預測響應(yīng)值。A、A2、B2、C2對YH-18發(fā)酵產(chǎn)芽孢有極顯著影響(P<0.01)，C、A×C有一定影響但不顯著(P>0.05)。通過Design expert 10.0.1軟件分析試驗結(jié)果，并擬合出響應(yīng)值與試驗因子的二次回歸方程為：芽孢數(shù)=-83.311 50+50.185 25A+34.943 63B+2.935 37C-0.143 75AC-0.44500AB-0.034 53BC-21.819 69A2-15.091 56B2-0.040 12C2。

表3 BBD方差分析結(jié)果Table 3 BBD ANOVA results

根據(jù)回歸方程繪制等高線圖和3D曲面圖，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，氮源質(zhì)量分數(shù)和裝液量交互效應(yīng)的等高線圖呈橢圓形，3D曲面圖陡峭，交互作用最強；接菌量和裝液量交互效應(yīng)的等高線圖呈圓形，3D曲面圖平穩(wěn)，交互作用相對較弱。

A.裝液量與接菌量對菌株YH-18 芽孢產(chǎn)量交互效應(yīng)等高線圖contour plot of the interaction effect of liquid loading and inoculation amount on spore yield of strain YH-18；B.裝液量與氮源(玉米漿干粉)質(zhì)量分數(shù)對菌株YH-18 芽孢產(chǎn)量交互效應(yīng)等高線圖contour plot of the interaction effect of liquid loading and nitrogen (dried corn steep liquor powder) concentration on spore yield of strain YH-18；C.接菌量與氮源玉米漿干粉質(zhì)量分數(shù)對菌株YH-18 芽孢產(chǎn)量交互效應(yīng)等高線圖contour plot of the interaction effect of inoculation amount and nitrogen (dried corn steep liquor powder) concentration on spore yield of strain YH-18；D.裝液量與接菌量對菌株YH-18 芽孢產(chǎn)量交互效應(yīng)3D曲面圖 3D curred surface graph of the interaction effect of liquid loading and inoculation amount on spore yield of strain YH-18；E.裝液量與氮源(玉米漿干粉)質(zhì)量分數(shù)對菌株YH-18 芽孢產(chǎn)量交互效應(yīng)3D曲面圖 3D curred surface graph of the interaction effect of liquid loading and nitrogen (dried corn steep liquor powder) concentration on spore yield of strain YH-18；F.接菌量與氮源(玉米漿干粉)質(zhì)量分數(shù)對 YH-18 芽孢產(chǎn)量交互效應(yīng)3D曲面圖 surface of the interaction effect of inoculation amount and nitrogen (dried corn steep liquor powder) concentration on spore yield of strain YH-18圖4 影響貝萊斯芽孢桿菌菌株YH-18芽孢數(shù)的相應(yīng)等高線圖和曲面圖Fig.4 Corresponding contour and 3D surface affecting spore quantity of Bacillus velezensis strain YH-18

不同小寫字母表示同一處理在不同時間上差異顯著(P<0.05)。Different lowercase letters at the same treatments indicate significant difference among different times at 0.05 level.圖5 優(yōu)化前后發(fā)酵濾液抑制根癌農(nóng)桿菌菌株C58生長情況(A)及優(yōu)化前后發(fā)酵液儲存時間情況(B)Fig.5 Inhibition of growth of Agrobacterium tumefaciens strain C58 by fermentation filtrate before and after optimization(A) and shelf life of fermentation broth before and after optimization(B)

2.4 培養(yǎng)基質(zhì)和條件優(yōu)化前后相應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)酵液抑菌能力和儲存時間比較

使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵液對根癌農(nóng)桿菌菌株C58生長的抑制作用明顯比優(yōu)化前發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵液去菌體濾液更強(圖5)。

由圖5可知，發(fā)酵液能在前16 h明顯防止根癌農(nóng)桿菌菌株C58生長，且優(yōu)化后的發(fā)酵液去菌體濾液在48 h后仍為較好的抑制效果。將優(yōu)化后的發(fā)酵液和平時使用NA發(fā)酵24 h的發(fā)酵液同時保藏在4 ℃條件下，優(yōu)化后的發(fā)酵液儲存時間明顯更長，且在1年后活菌數(shù)和芽孢數(shù)仍為初始發(fā)酵液的87.5%和89.74%。而未優(yōu)化的發(fā)酵液在第4個月時活菌數(shù)就急劇減少，僅為初始菌體的0.06%，芽孢數(shù)反而有所增加，但僅為2.08×105cfu/mL，遠低于初始活菌數(shù)。

3 討 論

不同菌株對于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的偏好各不相同[19]。本試驗表明貝萊斯芽孢桿菌菌株YH-18偏向植源性氮源，這與王繼雯等[20]優(yōu)化巨大芽孢桿菌(Bacillusmegatherium)菌株C2氮源時的結(jié)果一致。認為可能是由于菌株YH-18分離自櫻花枝干[21]，對植源性氮源的敏感程度較高，而無機氮源不利于菌株YH-18的生長和產(chǎn)孢；也可能由于植物源的氮源營養(yǎng)成分遠高于普通有機氮源和無機氮源，在質(zhì)量分數(shù)1.0%時更適合菌株YH-18的生長和產(chǎn)孢。因此，以葡萄糖作為速效碳源，以農(nóng)副產(chǎn)品玉米漿干粉為氮源有利于菌體的快速生長，而高密度細胞培養(yǎng)是合理提高芽孢產(chǎn)量的有效途徑之一。此外，培養(yǎng)基中的C/N對菌體的生長和代謝也具有重要影響[22-23]，本試驗對碳氮源濃度進行篩選時，發(fā)現(xiàn)較低或較高的碳氮源濃度都會減少芽孢數(shù)量，且過高的氮源濃度還會導致產(chǎn)孢緩慢。說明培養(yǎng)基養(yǎng)分不足不利于菌體和芽孢的大量繁殖，而過高的葡萄糖或玉米漿干粉濃度不僅造成材料的浪費，也會使菌體衰老自溶，造成不產(chǎn)孢或產(chǎn)孢緩慢現(xiàn)象，發(fā)酵液芽孢數(shù)量低[24]。這些結(jié)果對于后續(xù)發(fā)酵罐擴大性生產(chǎn)的培養(yǎng)投料量確定和補料量具有重要參考作用。

適宜的培養(yǎng)條件有利于菌體的快速繁殖和產(chǎn)孢。菌株YH-18產(chǎn)孢需要較高轉(zhuǎn)速和較低裝液量，說明YH-18是1株耗氧能力較強的菌株，可以通過在對數(shù)生長期和芽孢形成期采用較大通氣量和較高轉(zhuǎn)速來提高芽孢形成率[25]。周向平等[26]研究報道貝萊斯芽孢桿菌菌株Xe01最佳pH為7.0，最適溫度為30 ℃。王朝恩等[27]發(fā)現(xiàn)短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)菌株HR10在溫度37 ℃、pH 7.0條件下生物量最多。菌株YH-18與大部分研究芽孢桿菌的培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速相近。有研究表明，接菌量過多會導致前期生長快，后期營養(yǎng)不足而影響最終菌體量，過少則會造成發(fā)酵延滯，發(fā)酵周期長[28]。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)菌株HG-15的最佳接種量為10%[29]，枯草芽孢桿菌菌株SR096最適接菌量為3%[30]，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株CQN-2最適接菌量為3%[31]。但在本研究中，菌株YH-18的最適接菌量相較于其他芽孢桿菌最適接菌量少，可能會導致發(fā)酵時間延長。所以，在后續(xù)發(fā)酵罐發(fā)酵中可適當增加接菌量，縮短發(fā)酵時間，節(jié)約用電成本。不同培養(yǎng)條件的篩選表明，不同菌株之間最適培養(yǎng)條件存在較大差異，開發(fā)優(yōu)良菌株時需對特定菌株進行培養(yǎng)條件優(yōu)化。微生物制劑除了嚴格要求發(fā)酵液中的菌體數(shù)量，菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)也會嚴重影響菌劑的作用效果[32]。優(yōu)化后配方發(fā)酵液抑菌能力增強，進一步說明了優(yōu)化配方的使用可行性。使用優(yōu)化配方的發(fā)酵液儲存時間明顯優(yōu)于未優(yōu)化發(fā)酵液，這主要是由于未優(yōu)化配方的發(fā)酵液芽孢率低，菌體到后期衰老死亡，而優(yōu)化后配方芽孢率高，抗逆性的芽孢更耐存儲。這些優(yōu)良條件為菌株YH-18液體制劑推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。