袁芳草，吳 然，李 倩，張丹林，彭 超，唐姍姍

（1.貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550002；2.貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院皮膚科，貴州 貴陽 550001）

淺部真菌?。⊿uperficial mycosis）是一種真菌疾病，其病灶主要局限于皮膚、指甲或頭發(fā)的外層，但可能會侵入更深層的組織[1]。此病由皮膚癬菌、霉菌、酵母菌和酵母樣真菌引起，會對患者的心理和社會心理因素產生負面影響，并降低其生活質量，是全世界重點關注的健康問題[2]。目前由于抗真菌藥物在淺部真菌病治療中的廣泛應用，有關抗真菌藥物耐藥性的報道不斷增加，抗真菌藥物耐藥性的增加正在成為一個公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)[3]。中醫(yī)藥治療淺部真菌病歷史悠久，中藥外治淺部真菌病的療效可與西醫(yī)抗真菌藥媲美，且具有不良反應少和復發(fā)率低的優(yōu)勢[4]。土荊皮（Pseudolarix kamepferi）又名土槿皮，為我國特有松科植物金錢松的干燥根皮或近根樹皮，始載于趙學敏的《本草綱目拾遺》，具有殺蟲止癢、祛風除濕的功效[5]。土荊皮的多種化學成分具有抗腫瘤、抗血管生成、抗真菌等活性[6]，其中抗真菌活性應用前景廣闊，是目前研究的熱點。本研究通過網絡藥理學結合體外實驗對土荊皮治療淺部真菌病的效果進行研究，旨在為淺部真菌病的中藥治療提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 菌種和藥物

紅色毛癬菌由貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院皮膚科饋贈；土荊皮飲片購自貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥房。

1.2 試劑和儀器

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）購自青島海博生物技術有限公司；氯霉素購自北京索萊寶科技有限公司。恒溫培養(yǎng)箱（美國致微ZWALWAY 產品）；顯微鏡（瑞士TECAN 公司產品）；麥氏比濁儀（北京海富達科技有限公司產品）；玻璃冷凝管回流裝置（山東禹王公司產品）；真空干燥箱（天津鑫州儀器有限公司產品）。

1.3 土荊皮成分和靶點的篩選

在TCMSP 數據庫平臺輸入土荊皮作為關鍵詞進行檢索，將OB 值≥30% 和DL 值≥0.18 作為篩選標準。將篩選出的有效成分上傳至PubChem 數據庫中得到對應的SMILES 號，隨后通過SwissTargetPrediction數據庫進行靶點預測，將得出的所有靶點進行去重整理，并通過Cytoscape 軟件進行可視化分析。

1.4 土荊皮治療淺部真菌病的有效靶點

將Superficial mycosis 作 為 關 鍵 詞，通 過GeneCards 疾病數據庫進行檢索，即得出淺部真菌病的靶點。將得出的土荊皮靶點和疾病靶點進行交集處理，得出的靶點為土荊皮治療淺部真菌病的有效靶點。

1.5 構建PPI 網絡

將得到的土荊皮治療淺部真菌病的有效靶點上傳至STRING 數據庫中，將其生物物種設置為H.sapiens，根據所需要求導出TSV 格式上傳至Cytoscape 軟件對得出的結果進行可視化分析。

1.6 GO 分析和KEGG 通路分析

通過Metascape 數據庫對土荊皮治療淺部真菌病的有效靶點進行GO 和KEGG 分析，并設置物種選項為H.sapiens 和P＜0.01，并 通 過Cytoscape 軟 件 構建出成分- 通路- 靶點圖。

1.7 土荊皮醇提物對紅色毛癬菌的抑菌實驗研究

1.7.1 藥物提取 先將土荊皮粉碎成粗粉，并置于無水乙醇中浸泡5 ～6h（無水乙醇：藥材為10：1），通過回流冷凝法提取1h，并用絹布過濾，得出藥液。再向藥渣中加入8 ～10 倍體積的無水乙醇，浸泡、加熱回流提取并過濾。將得到的兩次乙醇液混合，加熱過濾，并進行減壓干燥。置于-20℃環(huán)境中冷凍至少24h，然后通過進行真空冷凍干燥得出提取物。

1.7.2 藥敏實驗 取PDA 培養(yǎng)基和氯霉素溶于蒸餾水中，高溫高壓滅菌，備用。將封存的紅色毛癬菌菌種接種于制備好的PDA 培養(yǎng)基中，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d。用棉拭子蘸取活化后的菌種溶于3mL 的生理鹽水中，用比濁儀將濃度調至0.5 麥氏（1×106～6×106cfu/mL），再用生理鹽水稀釋至1×103～6×103cfu/mL，備用。取SDA 培養(yǎng)基和氯霉素溶于蒸餾水中，滅菌后制含藥培養(yǎng)基備用。將1g土荊皮醇提物用1mL 無水乙醇和9mL 生理鹽水進行溶解，取2mL 藥液用二倍稀釋法分別稀釋為50 mg/mL至0.097 mg/mL 共10 個濃度。分別加入12 孔板中，隨后各孔均加入100μL 濃度為1×103～6×103cfu/mL的菌液。陽性對照組加菌液不加藥液，空白對照組不加菌液和藥液，最后在各孔加入1mL 的SDA 培養(yǎng)基。于28℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育7d，當陽性對照組生長出菌絲時，肉眼觀察加藥組沒有菌落生長的最低藥物濃度為MIC，實驗重復三次。

2 結果

2.1 土荊皮的有效成分及靶點的預測

通過TCMSP 數據庫篩選出OB 值≥30%、DL值≥0.18 的有效成分共8 種，由于土荊皮丙酸無對應靶點，最終符合要求的成分為7 種，見表1。采用SwissTargetPrediction 數據庫預測以上7 種有效成分的藥物靶點，對其整理后去重得出土荊皮的109 個靶點，上傳至Cytoscape 軟件構建出成分—靶點網絡圖，見圖1。

圖1 成分—靶點網絡圖

表1 土荊皮的有效成分

2.2 土荊皮治療淺部真菌病的靶點獲取和PPI 網絡的構建

通過GeneCards 數據庫獲得淺部真菌病的靶點421 個，將土荊皮和疾病的靶點進行交集處理得出治療的有效靶點共17 個。將土荊皮治療淺部真菌病的17 個靶點上傳至STRING 數據庫中，得出的PPI 網絡包含17 個節(jié)點、39 條邊，平均節(jié)點度為4.59。導入Cytoscape 軟件中進行可視化，見圖2。圖中可見IL2、HSP90AA1、NOS2 等為關鍵靶點。

圖2 土荊皮治療淺部真菌病的靶點PPI 分析

2.3 GO 分析和KEGG 分析

將土荊皮治療淺部真菌病的17 個治療靶點導入Metascape 數據庫中進行GO 分析和KEGG 分析。GO分析的結果顯示，治療靶點主要與缺氧反應、蛋白質轉運的調節(jié)、白細胞介素-6 產生的正調節(jié)、氧化還原酶活性、轉錄調節(jié)復合物等相關。KEGG 通路分析得出的通路為癌癥的途徑、CLRs 信號通路、恰加斯病、Th17細胞分化。將相關的藥物成分和靶點上傳至Cytoscape中進行可視化分析，得出成分—靶點—通路圖，見圖3。

圖3 土荊皮治療淺部真菌病的“成分—靶點—通路”圖

2.4 土荊皮醇提物對紅色毛癬菌的抑菌實驗研究

在12 孔板的1 ～10 號孔中分別加入10 個濃度的土荊皮醇提物，并設置空白對照組（-）和陽性對照組（+）。將12 孔板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d。培養(yǎng)觀察至第7d 后，結果顯示土荊皮醇提物對紅色毛癬菌有明顯抑制作用，最小抑菌濃度（MIC）為1.562 mg/mL，見表2、圖4。

表2 土荊皮醇提物對紅色毛癬菌的抑菌作用

圖4 土荊皮醇提物對紅色毛癬菌抑制作用的鏡下觀察

3 討論

在TCMSP 數據庫中篩選出土荊皮的主要成分為樺木酸、β- 谷甾醇、芒柄花黃素等。樺木酸作為一種三萜類化合物，在濃度為8 ～128μg/mL 的范圍內可達到殺滅真菌的效果。樺木酸的哌嗪基衍生物表現出與特比萘芬相似的抗真菌譜，并且是抗皮膚真菌最有效的衍生物[7]。有研究發(fā)現β- 谷甾醇是一種具有廣泛抗真菌活性的植物代謝產物，可通過結合Osh4蛋白達到抗真菌的效果[8]。國外研究表明芒柄花黃素對白色念珠菌、新生隱球菌、熱帶念珠菌等真菌都表現出良好的抗真菌活性，MIC 值為25 μg/mL[9]。PPI網絡分析的結果顯示，IL2、HSP90AA1、NOS2 等為關鍵靶點。研究表明，由皮膚癬菌、足馬杜拉分枝菌等真菌感染引起的淺部真菌病患者的血清中，細胞因子IL-2、IL-4 的表達水平明顯提升。另有動物實驗表明，由須癬毛癬菌建立的動物淺部真菌感染模型中，血清中IL-2、IL-6 的水平明顯升高[10]。HSP90 類蛋白在病原菌的生長、毒力以及藥物耐藥性等方面具有多重調控作用，靶向HSP90 在抗真菌治療中有著巨大的潛力，研發(fā)選擇性作用于真菌HSP90 的治療藥物具有廣闊的前景[11]。田珂[12]通過臨床觀察得出，紅色毛癬菌感染的甲真菌病患者外周血血清中NO 及NOS 的表達下降，這可能是導致感染易反復的原因之一。GO 分析顯示土荊皮主要通過缺氧反應、蛋白質轉運的調節(jié)、白細胞介素-6 產生的正調節(jié)等途徑對淺部真菌病產生作用。KEGG 分析得出土荊皮治療淺部真菌病的通路主要為癌癥的途徑、CLRs 信號通路、Th17 細胞分化等。目前有研究發(fā)現癌癥與真菌感染有著密切的聯系，白色念珠菌引起的感染能夠通過產生致癌副產物、引發(fā)炎癥、誘導Th17 反應等促進癌癥的發(fā)生發(fā)展[13]；而且，癌癥病人的免疫力低下，更易出現淺部真菌感染。CLRs 信號通路與淺部真菌病聯系密切，在真菌感染期間，CLRs 和Toll 樣受體(TLR)可通過識別各種真菌表面成分在宿主防御真菌病原體中發(fā)揮重要作用[14]。Th17 途徑的一些關鍵要素可被皮膚癬菌激活，如Th17 途徑的刺激可以通過抗原呈遞細胞中一些CLRs 受體和炎癥小體的激活而發(fā)生，進而參與皮膚癬菌免疫反應[15]。另有臨床研究表明，真菌感染患者會出現Th17、Th17/Treg 水平的明顯降低，Th17/Treg 免疫失衡是真菌入侵機體的重要途徑[16]。紅色毛癬菌是誘發(fā)淺部真菌病的主要病原體之一，本次體外抑菌實驗的結果顯示土荊皮的醇提物對紅色毛癬菌有明顯的抑制作用，最小抑菌濃度為1.562 mg/mL。有研究指出，土荊皮醇提物可通過抑制菌絲及孢子生長或破壞菌絲形態(tài)來抑制紅色毛癬菌的活性。近年來，中藥抗真菌作用是臨床研究的熱點。高璐等[17]研究發(fā)現，知母水提物對紅色毛癬菌有著明顯的抑制效果。劉登宇等[18]發(fā)現，白鮮堿對紅色毛癬菌的抑菌機制可能與抑制細胞膜結構的完整性、降低耐藥性等途徑有關。

本研究通過網絡藥理學分析發(fā)現土荊皮治療淺部真菌病的主要起效成分為樺木酸、β- 谷甾醇、芒柄花黃素等。此藥通過作用于IL2、HSP90AA1、NOS2等靶點以及對CLRs 信號通路、Th17 細胞分化等通路的調節(jié)來發(fā)揮對淺部真菌病的治療作用。體外抑菌實驗表明土荊皮對紅色毛癬菌有著明顯的抑制作用，其機制與抑制菌絲及孢子生長相關。本研究為治療淺部真菌病提供了新的思路和方向，同時也為土荊皮的開發(fā)利用奠定了堅實的理論基礎。