魯曉娟，沈玉芹，付應(yīng)盼，陳海英，郭 迪(皖西衛(wèi)生職業(yè)學院附屬醫(yī)院口腔科，六安 37005；山東大學附屬醫(yī)院口腔科；通訊作者，E-mail:ym0505@63.com)

口腔鱗狀細胞癌是一種原發(fā)性的口腔內(nèi)腫瘤，易發(fā)生早期遠處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，患者總生存期較短[1]?？谇击[狀細胞癌的治療方式包括手術(shù)治療、化療和放療等，但多數(shù)患者預(yù)后不佳[2]?？谇击[狀細胞癌的發(fā)病機制并不清楚，在分子水平上明確其發(fā)生和發(fā)展機制，進行分子靶向治療是口腔鱗狀細胞癌研究的焦點。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類無法編碼蛋白的內(nèi)源性RNA分子，其轉(zhuǎn)錄本通常大于200個核苷酸[3]。lncRNA作為細胞內(nèi)的功能單位，主要定位在細胞質(zhì)中，廣泛參與正常細胞的分化、增殖、衰老等過程[4]。研究指出，lncRNA在多種惡性腫瘤如神經(jīng)母細胞瘤、淋巴瘤、口腔鱗狀細胞癌中異常表達，影響惡性腫瘤的進展[5-7]。研究顯示，NUTM2B-AS1基因定位于10號染色體，包含兩個外顯子，NUTM2B-AS1參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展[8]。有關(guān)NUTM2B-AS1在口腔鱗狀細胞癌中的表達及對癌細胞生物學行為的影響尚未明確，NUTM2B-AS1可能在口腔鱗狀細胞癌中發(fā)揮生物學功能。本研究旨在分析NUTM2B-AS1在口腔鱗狀細胞癌組織和細胞系中的表達，探討高表達NUTM2B-AS1對口腔鱗狀細胞癌細胞侵襲和遷移的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

口腔鱗狀細胞癌細胞系Cal-27、SCC-25、SCC-9、HSC-3和口腔上皮角質(zhì)細胞系HOK均購自中國科學院上海細胞所。pmirGLO-NUTM2B-AS1過表達載體和pmirGLO空載體購自上海吉凱基因有限公司。DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、口腔角質(zhì)細胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。miR-NC、miR-770-5p、WT-NUTM2B-AS1載體、MUT-NUTM2B-AS1載體購自上海碧云天生物技術(shù)公司。Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑和基質(zhì)膠購自美國Sigma公司。Transwell小室、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Fermentas公司。BCA蛋白檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技公司。一抗Sirt7、E-cadherin、Smad4、MMP-7、vimentin、β-actin和二抗均購自美國Cell Signaling公司。

1.2 生物信息學方法

通過TCGA數(shù)據(jù)庫(https://www.genome.gov/Funded-Programs-Projects/Cancer-Genome-Atlas)分析口腔鱗狀細胞癌組織和癌旁組織中NUTM2B-AS1的表達量。通過LncCeRBase生物信息學軟件(http://www.insect-genome.com/LncCeRBase/front/)分析NUTM2B-AS1能夠互補結(jié)合的微小RNA(miRNA)。

1.3 細胞培養(yǎng)和分組轉(zhuǎn)染

口腔鱗狀細胞癌細胞系Cal-27、SCC-25用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，HSC-3、SCC-9細胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，口腔上皮角質(zhì)細胞系HOK用含10%胎牛血清的口腔角質(zhì)細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的Cal-27細胞接種于12孔板，融合度為50%時，分別轉(zhuǎn)染pmirGLO-NUTM2B-AS1載體(NUTM2B-AS1組)與pmirGLO載體(對照組)，參照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h，收集各組Cal-27細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測NUTM2B-AS1和miR-770-5p表達

用PBS清洗細胞4次，加入Trizol試劑提取細胞總RNA。通過微量核酸儀分析RNA濃度以及純度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。β-actin用于標準化NUTM2B-AS1表達量，U6用于標準化miR-770-5p表達量。qRT-PCR擴增條件：96 ℃ 8 min、59 ℃ 25 s、70 ℃ 25 s，共34個循環(huán)。NUTM2B-AS1上游引物序列為5′-CCCTCCCGTAGCTGTCATAC-3′，下游引物序列為5′-ACCCATTTTACATTTTGAGAACA-3′；β-actin上游引物序列為5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物序列為5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′；U6上游引物序列為5′-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3′，下游引物序列為5′-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3′；miR-770-5p上游引物序列為5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′，下游引物序列為5′-TGCTTCCAGTACCACGTGTC-3′。

1.5 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲

預(yù)先用DMEM培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠(稀釋比例8 ∶1)，培養(yǎng)箱內(nèi)晾干。用PBS清洗NUTM2B-AS1組和對照組轉(zhuǎn)染后的Cal-27細胞，用不含血清的培養(yǎng)基重懸細胞，分別取140 μl細胞懸液加入Transwell上室，在下室加入含15%的培養(yǎng)基640 μl。培養(yǎng)24 h，加入多聚甲醛固定細胞，加入結(jié)晶紫染液染色，采用棉簽擦去上室底部的細胞，流水沖洗并晾干，在倒置顯微鏡觀察、計數(shù)。

1.6 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移

將NUTM2B-AS1組和對照組轉(zhuǎn)染后的Cal-27接種于24孔板，培養(yǎng)至融合度為85%，用200 μl移液器吸頭在24孔板底直線劃痕，用預(yù)冷PBS清洗6次，倒置顯微鏡拍照，測定細胞劃痕寬度W0。培養(yǎng)24 h，在倒置顯微鏡拍照，測定細胞劃痕寬度W1。細胞劃痕愈合率=(W0-W1)/W0×100%。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測NUTM2B-AS1與miR-770-5p的互補結(jié)合

將對數(shù)生長期Cal-27細胞接種于24孔板，細胞貼壁后，分別將miR-NC、miR-770-5p或WT-NUTM2B-AS1載體、MUT-NUTM2B-AS1載體共轉(zhuǎn)染至Cal-27細胞。培養(yǎng)48 h，收集各組細胞裂解液，根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測每組Cal-27細胞的相對熒光素酶活性。

1.8 Western blot法檢測Sirt7/Smad4信號通路蛋白表達

采用細胞裂解液提取NUTM2B-AS1組和對照組Cal-27細胞總蛋白，采用BCA法檢測每組蛋白含量，在100 ℃沸水中煮沸變性。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。9%脫脂牛奶中封閉1.5 h，加入一抗Sirt7抗體(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶1 000)、Smad4(1 ∶2 000)、MMP-7(1 ∶2 000)、Vimentin(1 ∶3 000)、β-actin(1 ∶1 000)，孵育14 h。加入HRP標記的二抗(1 ∶10 000)，37 ℃孵育1 h。加入電化學發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光、顯影、拍照。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 NUTM2B-AS1在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達量

TCGA數(shù)據(jù)庫顯示，與癌旁組織相比，口腔鱗狀細胞癌組織中NUTM2B-AS1表達顯著降低(P<0.01，見圖1)。

與癌旁組織相比，**P<0.01圖1 NUTM2B-AS1在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達量Figure 1 Expression of NUTM2B-AS1 in oral squamous cell carcinoma tissues

2.2 NUTM2B-AS1在口腔鱗狀細胞癌細胞系中的表達

與口腔上皮角質(zhì)細胞系HOK相比，口腔鱗狀細胞癌細胞系Cal-27、SCC-25、SCC-9、HSC-3中NUTM2B-AS1的表達水平顯著降低(P<0.01)，NUTM2B-AS1在Cal-27細胞中表達水平最低(P<0.01，見圖2)。

與HOK細胞相比，**P<0.01圖2 NUTM2B-AS1在口腔鱗狀細胞癌細胞系中的表達Figure 2 Expression of NUTM2B-AS1 in oral squamous cell carcinoma cell lines

2.3 NUTM2B-AS1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率

對照組和NUTM2B-AS1組Cal-27細胞中NUTM2B-AS1表達分別為0.18±0.08和1.03±0.29，NUTM2B-AS1組顯著高于對照組(P<0.01)，表明NUTM2B-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。

2.4 高表達NUTM2B-AS1對Cal-27細胞侵襲的影響

Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，對照組和NUTM2B-AS1組Cal-27細胞侵襲數(shù)分別為(82.16±13.94)個/視野和(36.40±8.02)個/視野，NUTM2B-AS1組細胞侵襲數(shù)顯著低于對照組(P<0.01，見圖3)。

圖3 高表達NUTM2B-AS1對Cal-27細胞侵襲的影響Figure 3 Effect of high expression of NUTM2B-AS1 on the invasion of Cal-27 cells

2.5 高表達NUTM2B-AS1對Cal-27細胞遷移的影響

細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，對照組和NUTM2B-AS1組Cal-27細胞劃痕愈合率分別為(62.63±6.31)%和(26.86±12.88)%；與對照組比較，NUTM2B-AS1組劃痕愈合率顯著降低(P<0.01，見圖4)。

圖4 高表達NUTM2B-AS1對Cal-27細胞遷移的影響Figure 4 Effect of high expression of NUTM2B-AS1 on the migration of Cal-27 cells

2.6 NUTM2B-AS1能夠靶向結(jié)合miR-770-5p

生物信息學數(shù)據(jù)庫LncCeRBase預(yù)測結(jié)果顯示，NUTM2B-AS1與miR-770-5p可能存在結(jié)合關(guān)系(見圖5)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，與miR-NC相比，miR-770-5p+WT-NUTM2B-AS1組的Cal-27細胞相對熒光素酶活性明顯著降低(P<0.01)，對于突變型NUTM2B-AS1，各組相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖6)，證實miR-770-5p是NUTM2B-AS1的靶向調(diào)控基因。

圖5 NUTM2B-AS1與miR-770-5p的結(jié)合位點Figure 5 Binding site of NUTM2B-AS1 and miR-770-5p

與miR-NC相比，**P<0.01圖6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CNUTM2B-AS1與miR-770-5p互補結(jié)合Figure 6 Verification of complementary binding between NUTM2B-AS1 and miR-770-5p by dual-luciferase reporter gene assay

2.7 高表達NUTM2B-AS1對miR-770-5p表達的影響

對照組和NUTM2B-AS1組Cal-27細胞中miR-770-5p表達分別為9.36±2.79和1.01±0.38，與對照組比較，NUTM2B-AS1組miR-770-5p表達顯著降低(P<0.01)。

2.8 高表達NUTM2B-AS1對Sirt7/Smad4信號通路蛋白表達的影響

Western blot實驗結(jié)果表明，與對照組比較，NUTM2B-AS1組Cal-27細胞Sirt7/Smad4信號通路蛋白Sirt7、E-cadherin蛋白顯著升高(均P<0.01)，Smad4、MMP-7、Vimentin蛋白表達下降(均P<0.01，見圖7)。

與對照組相比，**P<0.01圖7 高表達NUTM2B-AS1對Cal-27細胞Sirt7/Smad4信號通路蛋白表達的影響Figure 7 Effect of high expression of NUTM2B-AS1 on protein expression of Sirt7/Smad4 signaling pathway in Cal-27 cells

3 討論

lncRNA可在表觀遺傳水平發(fā)揮調(diào)控作用，影響細胞的代謝、氧化應(yīng)激、凋亡等細胞活動，進而影響疾病的發(fā)展[9]。隨著研究的深入，很多l(xiāng)ncRNA被證實在口腔鱗狀細胞癌組織和正常組織之間存在差異性表達，可能成為口腔鱗狀細胞癌的潛在性生物學標志物和治療靶點[10-12]。Tian等[13]研究發(fā)現(xiàn)，LINC00974在口腔鱗狀細胞癌組織中表達上調(diào)，LINC00974高表達的患者生存率較低，LINC00974通過降低miR-122表達抑制口腔鱗狀細胞癌細胞的遷移和侵襲。Tong等[14]研究發(fā)現(xiàn)，口腔鱗狀細胞癌臨床樣本中l(wèi)ncRNA SNHG17的表達顯著增加，并與病理指標相關(guān)，lncRNA SNHG17可顯著促進口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，同時減少細胞的凋亡。Chen等[15]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA GACAT1在口腔鱗狀細胞癌組織和細胞系中高表達，lncRNA GACAT1通過靶向結(jié)合miR-149加速口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖和遷移，抑制細胞凋亡和自噬。

NUTM2B-AS1由510個核苷酸組成，在宮頸癌組織中異常表達且與宮頸癌患者的總生存期相關(guān)[8]。本研究通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中口腔鱗狀細胞癌組織和癌旁組織中NUTM2B-AS1表達量分析顯示，口腔鱗狀細胞癌組織中NUTM2B-AS1表達降低，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示NUTM2B-AS1在口腔鱗狀細胞癌細胞系中的表達低于口腔上皮角質(zhì)細胞系，提示NUTM2B-AS1可能參與口腔鱗狀細胞癌的進展。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)NUTM2B-AS1能夠抑制口腔鱗狀細胞癌細胞的侵襲和遷移。

目前研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA能夠作為競爭內(nèi)源性RNA，與miRNA互補結(jié)合，從而調(diào)控腫瘤細胞的生物學行為[16-18]。本研究通過生物信息學方法和雙熒光素酶報告基因檢測顯示，NUTM2B-AS1可以與miR-770-5p靶向結(jié)合。已有的研究顯示，miR-770-5p在甲氨蝶呤抗性的結(jié)直腸癌細胞系中高表達，上調(diào)miR-770-5p顯著抑制結(jié)直腸癌HT-29細胞對甲氨蝶呤的敏感性[19]。Jia等[20]發(fā)現(xiàn)，miR-770-5p在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的口腔鱗狀細胞癌組織中高表達，與患者的生存率較低有關(guān)，miR-770-5p能夠顯著促進口腔鱗狀細胞癌的遷移和侵襲。本研究證明，高表達NUTM2B-AS1后，miR-770-5p表達顯著降低，NUTM2B-AS1靶向負調(diào)控miR-770-5p表達。在口腔鱗狀細胞癌細胞中，miR-770-5p通過抑制Sirt7/Smad4信號通路活化起到促癌作用[20]。本研究中，高表達NUTM2B-AS1表達后，Sirt7/Smad4信號通路被激活，與相關(guān)研究報道一致[20]。

綜上所述，本研究證實NUTM2B-AS1在口腔鱗狀細胞癌組織和細胞系中低表達，高表達NUTM2B-AS1通過下調(diào)miR-770-5p抑制口腔鱗狀細胞癌Cal-27細胞的侵襲和遷移。NUTM2B-AS1可能成為口腔鱗狀細胞癌的生物學標志物和治療靶點。