尚 辰，郝文婷，任義樂

（徐州市第一人民醫(yī)院，江蘇 徐州 221000）

類風濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種典型的慢性自身免疫性疾病，其特征是關(guān)節(jié)呈進行性對稱性破壞并伴有全身炎癥反應(yīng)[1]。該病與幾種代謝性疾病和心血管疾病等共病高度相關(guān)[2]。值得注意的是，先天性危險因素（如遺傳、性別和年齡）和獲得性危險因素（如肥胖、吸煙和創(chuàng)傷）與RA 的分解代謝及炎癥過程有關(guān)[3-5]。幾種脂肪來源的細胞因子，如瘦素、脂聯(lián)素和內(nèi)脂素在局部或全身水平的紊亂，對RA 的炎癥和分解代謝改變起著重要作用[3]。其中內(nèi)脂素是一種新型的脂肪因子，已有研究發(fā)現(xiàn)其是炎癥和代謝過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子。內(nèi)脂素也被稱為煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（NAMPT），是哺乳動物中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）生物合成補救途徑中的限速酶。NAD+ 是一種普遍存在的參與氧化還原反應(yīng)的輔酶，在氧化應(yīng)激條件下，需要增加NAD+ 的再生，因此，內(nèi)脂素作為NAD+ 代謝的調(diào)節(jié)因子在基本細胞過程中占有關(guān)鍵地位[6]。谷胱甘肽（GSH）是人體內(nèi)最重要的抗氧化物質(zhì)，前期研究[7]已證明GSH可能通過降低成纖維滑膜細胞中的活性氧（ROS）水平進一步抑制炎癥因子的釋放，本試驗進一步研究其對脂肪因子中內(nèi)脂素的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

MH7A 細胞系（購自上海觀道生物科技有限公司）；健康清潔級雌性DBA/1J 小鼠14 只（購自常州卡文斯實驗動物有限公司），7 ～8 周齡。

1.2 試劑與儀器

GSH（北京索萊寶科技有限公司）；牛Ⅱ型膠原（Chondrex 公司，貨號：2002-2）；弗氏完全佐劑（含卡介苗，CFA，Chondrex 公司）；弗氏不完全佐劑（不含卡介苗，IFA，Chondrex 公司）；1640 培養(yǎng)基（SH30265.01，美國Hyclone）；低糖DMEM 培養(yǎng)基（SH30021.01B，美國Hyclone）；胎牛血清（FBS，10100147，美國Gibco）；青- 鏈霉素溶液（15140，美國Gibco）；內(nèi)脂素ELISA 試劑盒（eBioscience 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara Bio Inc.）；熒光定量PCR 儀（ABI7500）。

1.3 膠原誘導關(guān)節(jié)炎（CIA）模型制備

將14 只雌性DBA/1J 小鼠隨機分為CIA+PBS 組、CIA+GSH 組。將牛Ⅱ型膠原與CFA 等體積混合乳化制成混懸乳劑，在無菌條件下以每只0.1 mg 的劑量在小鼠尾根部皮下注射，首免當日記為1 d。在21 d將牛Ⅱ型膠原與IFA 等體積混合乳化，再次注射于小鼠尾根部皮下，劑量同前。CIA+GSH 組自第1 d 至第50 d 通過灌胃給予500 mg/kg GSH，CIA+PBS 組同時每日給予等量PBS 灌胃處理。所有小鼠均正常飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）環(huán)境。

1.4 小鼠骨髓來源單核巨噬細胞（Bonemarrowderivedmacrophages，BMDM）分離培養(yǎng)

首免50 d 后處死兩組小鼠，取出后肢股骨及脛骨，剝離骨表面肌肉和軟組織，去除股骨和脛骨骨骺端，將骨髓從骨髓腔中沖出，制成細胞懸液。以1640 完全培養(yǎng)基（1640 培養(yǎng)基+10% FBS+1% 青-鏈霉素溶液+10% L929 細胞培養(yǎng)上清）重懸細胞后種于6 孔板中。細胞貼壁后直至其長滿，每3 d 換液1 次，此時的貼壁細胞為BMDM。

1.5 轉(zhuǎn)錄組學測序

將BMDM 細胞送往廣州基迪奧生物科技有限公司進行轉(zhuǎn)錄組學測序，提取總RNA，并質(zhì)檢合格，建立文庫。獲得原始測序短序列，經(jīng)過濾得到短序列Clean Reads 為有效數(shù)據(jù)。采用DESeq2 軟件進行差異表達分析（P＜0.05），篩選出兩組間差異表達基因（Differentially expressed genes，DEGs），進行基因本體（Gene ontology，GO）功能顯著性富集分析。

1.6 MH7A 細胞分組

將MH7A 細胞分為PBS 組、GSH 組（GSH 100 μg/mL）、LPS（100 ng/mL）組、GSH+LPS 組，處理24 h 后收集細胞以及細胞上清。

1.7 收集MH7A 細胞，按照Trizol 試劑的說明書從中提取總RNA

測定RNA 濃度后每個樣本取1 μg 進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系和試驗方法參照說明書。根據(jù)SYBR說明書進行后續(xù)的實時定量PCR（qPCR）檢測內(nèi)脂素、瘦素、脂聯(lián)素。內(nèi)脂素上、下游引物序列分別為5’-CGACTCCTACAAGGTTACTCACTATAAAC-3’和 5’-CTTCTCAAGAATGTAGTTCCATCCC-3’，瘦 素 上、 下 游 引 物 序 列 分 別 為5’-TGGTTTCATTTCTACTGTGACTGATG-3’ 和5’-TCCTAAGCAATTGCAGAAGATAAG-3’， 脂 聯(lián)素上、下游引物序列分別為5’-CCCCAACATGC-3’和5’-TACACCTGGAGCCAGACTTGG-3’。得到CT值，以GAPDH 為內(nèi)參，用2-ΔΔCt 計算分析mRNA相對表達量。

1.8 ELISA 檢測細胞上清中內(nèi)脂素的表達情況

根據(jù)eBioscience 公司生產(chǎn)的ELISA 檢測試劑盒說明書檢測細胞上清內(nèi)脂素的表達情況。

2 結(jié)果

2.1 GSH 干預對LPS 誘導的MH7A 成纖維滑膜細胞中內(nèi)脂素、瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素mRNA 表達的影響

我們采用RT-PCR 檢測細胞內(nèi)脂素、瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素mRNA 表達，結(jié)果顯示與LPS 組相比，LPS+GSH 組細胞中內(nèi)脂素、瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素mRNA 水平均顯著下降（P＜0.05）。見圖1。

圖1 GSH 干預對LPS 誘導的MH7A 成纖維滑膜細胞中內(nèi)脂素、瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素mRNA 表達的影響

2.2 GSH 干預對MH7A 成纖維滑膜細胞上清內(nèi)脂素蛋白表達的影響

與LPS 組相比，LPS+GSH 組的細胞上清內(nèi)脂素蛋白水平顯著降低。見圖2。

圖2 GSH 干預對MH7A 成纖維滑膜細胞上清內(nèi)脂素蛋白表達水平的影響

2.3 GSH 干預對CIA 鼠BMDM 內(nèi)脂素mRNA表達的影響

GSH 干預對CIA 鼠BMDM 內(nèi)脂素mRNA 表達的影響見表1。

表1 CIA+GSH vs CIA+PBS 差異基因

3 討論

在過去的幾年中，有研究表明代謝因素特別是脂肪組織和脂肪細胞產(chǎn)生的大量脂肪因子，參與了RA的炎癥過程。脂肪因子相互作用，部分相互誘導，形成脂肪因子網(wǎng)絡(luò)，對滑膜炎癥以及軟骨、骨侵蝕起到一定的促進作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，相比于正常對照組，LPS 刺激MH7A 細胞后多種脂肪因子表達升高，如內(nèi)脂素、瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素，這與既往的研究結(jié)果相一致。給予GSH 干預后可顯著下調(diào)脂肪因子的表達。GSH 能夠改變脂肪因子表達的原因可能是基于其生物學特性。GSH 是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的一種三肽，含有巰基（-SH），它是甘油醛磷酸脫氫酶的輔基，又是乙二醛酶及丙糖脫氫酶的輔酶，參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)及糖代謝。GSH 廣泛分布于機體各器官內(nèi)，它是多種酶的輔酶，能激活多種酶，影響糖、脂肪、蛋白質(zhì)的代謝，為維持細胞的生理功能提供能量[9]。本研究中我們進一步研究了GSH 干預對內(nèi)脂素表達的影響。內(nèi)脂素是一種新型的脂肪因子，是炎癥和代謝過程的關(guān)鍵調(diào)控因子[4]。它又被稱為NAMPT，是細胞質(zhì)中NAD+ 前體的催化物，也是哺乳動物特異性NAD+ 挽救途徑中的限速酶。內(nèi)脂素的催化活性促使煙酰胺（NA）在細胞質(zhì)中合成煙酰胺單核苷酸（NMN）。NMN 隨后被轉(zhuǎn)運到線粒體，通過NMN 腺苷轉(zhuǎn)移酶（NMA）轉(zhuǎn)化為NAD+。NAD+及其磷酸化形式NADP 被認為是其作為普遍信號傳導和能量分子的生命必需品。內(nèi)脂素對NAD+ 的調(diào)控意味著任何NAD+ 依賴的基本過程，如細胞氧化還原電位、氧化應(yīng)激、聚合酶、環(huán)化酶和蛋白表達、細胞黏附或衰老都可以通過內(nèi)脂素調(diào)控。

有一項薈萃分析研究[10]和幾項獨立研究[11-18]表明RA 患者血清以及外周血中單個核細胞可表達更高的內(nèi)脂素，內(nèi)脂素基礎(chǔ)水平與抗環(huán)瓜氨酸肽抗體和RA 放射學進展呈正相關(guān)。此外，在初治RA 患者中還觀察到血清內(nèi)脂素水平與疾病活動性相關(guān)。有學者在RA 動物模型中研究了內(nèi)脂素抑制劑FK866 的作用，發(fā)現(xiàn)通過藥理抑制消耗內(nèi)脂素可以降低RA 的嚴重程度和炎癥因子的分泌[19]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，LPS 組的MH7A 細胞中內(nèi)脂素mRNA 水平以及細胞上清內(nèi)脂素蛋白水平均升高，而通過GSH干預可明顯下調(diào)細胞中內(nèi)脂素mRNA 以及細胞上清的內(nèi)脂素蛋白水平。NAD（P）+/NAD（P）H 和GSH/GSSG 是人體重要氧化還原對，炎癥激活期間產(chǎn)生的ROS 可誘導細胞中的DNA 損傷，導致NAD+ 池的消耗，NAD+ 維持糖酵解通量和炎癥功能需要通過激活NAMPT 進行補救[20]。而我們給予GSH 干預，提高了細胞的抗氧化能力，降低了ROS 水平，從而下調(diào)了NAMPT 的表達。我們在CIA 大鼠模型中的實驗結(jié)果也驗證了經(jīng)GSH 干預，巨噬細胞中的內(nèi)脂素明顯下降。結(jié)合我們此前的研究結(jié)果——GSH 可下調(diào)MH7A細胞中白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMMP-3）等的表達，我們推測GSH 可能部分通過降低內(nèi)脂素的表達從而調(diào)控炎癥。但其機制需要進一步研究，深入探討GSH參與RA 發(fā)生的詳細機制，有望為新型靶點藥物的研發(fā)提供新視角。