林路成，徐志偉，張建澤，單玉棟，肖峰，徐浩，李芩萍，易蒲紅，汪琨*，朱廷恒,2*

1(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)2(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 有機(jī)循環(huán)研究院(蘇州)，江蘇 蘇州，215000)

2-苯乙醇(2-phenylethanol，2-PE)是一種芳香族化合物，廣泛用于食品和化妝品行業(yè)。2-PE主要通過化學(xué)合成生產(chǎn)，但此法會產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物。利用微生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行天然2-PE的生產(chǎn)受到了廣泛關(guān)注[1]。其中，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是最主要的生產(chǎn)菌株。釀酒酵母通過莽草酸途徑(從頭合成)和艾氏途徑合成2-PE[2]。最近研究表明通過強(qiáng)化釀酒酵母莽草酸途徑構(gòu)建的工程菌株JM26產(chǎn)2-PE達(dá)643 mg/L[3]。然而，從頭途徑合成2-PE產(chǎn)量低，要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，仍然面臨著代謝工程方面的巨大挑戰(zhàn)[4]。當(dāng)L-苯丙氨酸(L-Phe)是培養(yǎng)基中唯一的氮源時(shí)，2-PE主要通過艾氏途徑合成。L-Phe由芳香族氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶Aro9催化生成苯丙酮酸，然后通過苯丙酮酸脫羧酶Aro10脫羧為苯乙醛，再由醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)還原為2-PE[5]，2-PE的工業(yè)生產(chǎn)主要依賴于該途徑。

為了提高釀酒酵母的2-PE產(chǎn)量，可用誘變育種、基因組改組、基因工程和基因編輯等方法[2,6]。這些方法在菌株改良的初始階段有一定效果，尤其是在產(chǎn)量較低的菌株中。釀酒酵母S288C中過量表達(dá)轉(zhuǎn)氨酶ARO8和苯丙酮酸脫羧酶ARO10后，2-PE產(chǎn)量達(dá)到2.61 g/L[7]。多個(gè)相關(guān)基因組裝構(gòu)建的釀酒酵母菌株YS58在5 L發(fā)酵罐中的2-PE產(chǎn)量達(dá)到6.3 g/L[8]。我們前期對釀酒酵母CWY132菌株進(jìn)行了研究，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，2-PE產(chǎn)量達(dá)到3.52 g/L[9]，發(fā)酵罐小試其產(chǎn)量達(dá)4.1 g/L[10]。以糖蜜為碳源，進(jìn)一步利用液-液兩相的分批補(bǔ)料發(fā)酵及工藝進(jìn)行轉(zhuǎn)化，2-PE產(chǎn)量最高達(dá)到9.03 g/L[11]。

當(dāng)產(chǎn)量達(dá)到一定水平時(shí)，2-PE對酵母細(xì)胞的毒性便成了限制產(chǎn)量的瓶頸。此外，釀酒酵母在轉(zhuǎn)化2-PE的過程中會產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物乙醇，從而與2-PE產(chǎn)生協(xié)同抑制效應(yīng)[12]。通過原位產(chǎn)物回收技術(shù)，2-PE的產(chǎn)量從2.28 g/L增加到5.14 g/L[13]。然而，去除回收殘留有機(jī)溶劑存在困難，限制了其應(yīng)用[2]。因此，提高菌株對2-PE的耐受性是進(jìn)一步提高產(chǎn)量的潛在途徑。釀酒酵母菌株的耐受性是由多基因控制的復(fù)雜綜合性狀，通過隨機(jī)誘變或基因工程提高菌株耐受性的策略相對來說效率較低。因此，有必要將傳統(tǒng)方法和基因工程方法相結(jié)合來改良菌株。

我國釀酒業(yè)高度發(fā)達(dá)，酵母菌株的多樣性非常豐富，是重要的資源寶庫。例如，在制備茅臺酒時(shí)，釀酒酵母在高溫、高酸和高乙醇濃度等多種應(yīng)激因素的環(huán)境中生長。在制曲過程中，溫度達(dá)60 ℃，pH值在2.0左右，乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)82%以上[14]。生長在這種特殊環(huán)境中的微生物區(qū)系具有獨(dú)特的物理和化學(xué)特征，可以從中篩選出耐受性更好的菌株。例如，篩選出的耐熱脅迫釀酒酵母菌株可耐受2.5 g/L的2-PE，顯著高于不耐熱菌株(1 g/L)，相應(yīng)地，2-PE產(chǎn)量達(dá)4.5 g/L[15]。

在獲得具有不同優(yōu)良性狀的多個(gè)酵母菌株后，有必要將這些性狀聚合到一個(gè)酵母菌株中。原生質(zhì)體融合顯示出高效的潛力，可以在不需要了解具體機(jī)制的情況下實(shí)現(xiàn)。該方法已用于改善釀酒酵母的乙醇生產(chǎn)性能，融合菌株同時(shí)獲得雙親的發(fā)酵性能和乙醇耐受性[16]。釀酒酵母和巴斯德酵母菌的融合菌株SP2-18的乙醇產(chǎn)量為74.65 g/L，而親本的乙醇產(chǎn)量分別為33.12和65.44 g/L[17]。釀酒酵母和乙醇假絲酵母的融合菌株R6在生產(chǎn)高品質(zhì)低醇蘋果酒方面具有巨大潛力[18]。這些研究表明，原生質(zhì)體融合是釀酒酵母菌株改良的有效策略。

CRISPR/Cas9技術(shù)已成功應(yīng)用于釀酒酵母的基因操作，DI-CRISPR(Delta整合的CRISPR)可以實(shí)現(xiàn)外源基因的高拷貝整合[19]。研究表明釀酒酵母cdc25(Ras家族鳥嘌呤核苷酸交換因子)的點(diǎn)突變菌株(W1416C)可以在39 ℃高溫下有效地進(jìn)行乙醇發(fā)酵，產(chǎn)量為6 g/L[20]。但是cdc25突變對2-PE產(chǎn)量是否有促進(jìn)作用尚不明確。在本研究中，我們篩選出3株耐受性好、2-PE產(chǎn)量高的釀酒酵母菌株，經(jīng)原生質(zhì)體融合后，進(jìn)一步利用DI-CRISPR對融合菌株進(jìn)行研究，探索cdc25及艾氏途徑關(guān)鍵酶基因?qū)?-PE產(chǎn)量的影響。構(gòu)建策略見電子增強(qiáng)出版附件1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031898)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基和試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母CWY132、釀酒酵母NGER，諾睿特生物公司；LSC-1(CICC 33068)、LSC-2(CICC 1005)和LSC-3(CICC 32304)，中國工業(yè)微生物保藏中心；S.C-1分離于浙江紹興黃酒釀造樣品。其他各菌株及來源見電子增強(qiáng)出版附件2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031898)。

1.1.2 試劑及其配制方法

NaH2PO4· 2H2O、山梨醇、β-巰基乙醇、EDTA-2 Na、酵母基因組DNA提取試劑盒、蝸牛酶，上海生工生物工程有限公司；崩潰酶，美國Sigma-Aldrich公司；cDNA轉(zhuǎn)錄試劑盒、Power SYBR?green PCR Master Mix試劑，美國Thermo Fisher Scientific公司。

0.2 mol/L PB溶液：87.7 mL 0.2 mol/L NaH2PO4· 2H2O和12.3 mL 0.2 mol/L Na2HPO4·2H2O，pH 6.0。

PBS溶液：50 mL 0.2 mol/L PB溶液和450 mL 1 mol/L山梨醇溶液，pH 6.0。

細(xì)胞壁裂解預(yù)處理液：取0.2 mL β-巰基乙醇和2.233 g EDTA-2Na，溶解于PBS中，定容至100 mL，0.22 μm過濾器過濾。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基用于菌株活化和分離。YPDS培養(yǎng)基(原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基)：YPD中添加182.17 g/L山梨醇。

2-PE發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 30，MgSO40.5，K3PO45，酵母提取物 1.5，L-Phe 5。

1.2 酵母菌株的分離與鑒定

樣品進(jìn)行稀釋后涂布在YPD平板上于30 ℃培養(yǎng)48 h，通過菌落形態(tài)和顯微觀察選擇酵母菌，分離純化后進(jìn)行分子鑒定。酵母基因組DNA用試劑盒提取。ITS(Internal Transcribed Spacer)的全序列用引物對Seq-F(5′-CGCCAGGTTTTCACAGAC-3′)/Seq-R(5′-GAGCGATACATTTCACAGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將ITS序列與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性分析，用MEGA7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

1.3 2-PE生長曲線及耐高溫性的測定

用光密度法(OD600)測定各菌株的生長曲線。用梯度稀釋滴板實(shí)驗(yàn)分析2-PE的耐受性，將酵母細(xì)胞濃度調(diào)整為107個(gè)細(xì)胞/mL，取5 μL稀釋液滴在含有2-PE的YPD平板上培養(yǎng)。

1.4 原生質(zhì)體制備、融合、再生

通過離心收集新鮮培養(yǎng)的酵母細(xì)胞，在PBS溶液中與4 mL酶液混合，酶液由70 mg/mL蝸牛酶和2 mg/mL崩潰酶組成，30 ℃、60 r/min下酶解2 h。利用雙親滅活的方法進(jìn)行細(xì)胞融合和選擇，使滅活效率≥95%。離心收集原生質(zhì)體，PBS洗滌并懸浮，一親本的懸浮液置于25 W紫外線燈下照射，涂布于YPDS平板，在30 ℃培養(yǎng)，另一親本在60 ℃水浴中處理。處理后的雙親原生質(zhì)體濃度調(diào)整為107/mL，各取0.5 mL混合并離心后懸浮在1 mL 40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 聚乙二醇6000，30 ℃避光培養(yǎng)25 min。離心收集原生質(zhì)體，PBS稀釋后涂布于YPDS板在30 ℃培養(yǎng)觀察，等待融合子出現(xiàn)。

1.5 融合子鑒定

細(xì)胞DNA含量按照公式(1)計(jì)算[18]：

(1)

式中：Ki，稀釋因子；E，1個(gè)紫外吸收單位代表DNA質(zhì)量濃度等于50 μg/mL。

1.6 使用DI-CRISPR構(gòu)建艾氏途徑和cdc25突變體中的基因過度表達(dá)

融合菌株RH2-16為宿主，將艾氏途徑中關(guān)鍵酶基因ARO8、ARO10和ADH2分別由組成性啟動(dòng)子磷酸甘油酸激酶驅(qū)動(dòng)表達(dá)，整合在釀酒酵母基因組的delta位點(diǎn)。將這3個(gè)基因組合，獲得7種類型菌株：↑ARO8，↑ARO10，↑ADH2，↑ARO8+↑ARO10，↑ARO8+↑ADH2，↑ARO10+↑ADH2和↑ARO8+↑ARO10+↑ADH2(↑表示超表達(dá))。DI-CRISPR基因編輯參考文獻(xiàn)[20]進(jìn)行。通過LiAc介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化酵母，利用構(gòu)建特異性引物(正向引物位于目標(biāo)基因的開放閱讀框內(nèi)，反向引物位于delta位點(diǎn))對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了PCR鑒定。通過PCR引入cdc25基因的點(diǎn)突變，并如上所述構(gòu)建突變株。引物見電子版增強(qiáng)出版附件3(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031898)。

1.7 qRT-PCR分析

使用cDNA轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，以1 μg總RNA為模板合成cDNA。以ACT1基因作為內(nèi)參，進(jìn)行qRT-PCR，在7500 Real-Time PCR系統(tǒng)使用Power SYBR?green PCR Master Mix試劑進(jìn)行擴(kuò)增。引物見電子版增強(qiáng)出版附件3(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031898)。

1.8 2-PE發(fā)酵生產(chǎn)及效價(jià)測定

對數(shù)生長期的酵母細(xì)胞以10%(體積分?jǐn)?shù))的接種量添加到含有5 g/LL-Phe的50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min發(fā)酵36 h。發(fā)酵液離心后取上清液用氣相色譜測定2-PE的濃度。向樣品中加入200 μL內(nèi)標(biāo)溶液(甲基異丁基甲醇1 g/L水溶液)，并混合500 μL乙酸乙酯。取上層有機(jī)相測量(島津GC 2014)。獨(dú)立進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理至少3個(gè)重復(fù)。

1.9 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，使用GraphPad作圖及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母菌分離鑒定

共篩選獲得25株酵母菌株(電子版增強(qiáng)出版附件2)。通過菌落形態(tài)分析、顯微觀察和分子鑒定，鑒定出19株釀酒酵母、2株Wickerhamomycesanomalus、2株P(guān)ichiapastoris、1株Torulasporadelbrueckii和1株Candidaanglica。根據(jù)ITS序列分析，工業(yè)菌株CWY132與從源于四川的樣品中分離的SC001、SC003和SC009之間相似性高，與GenBank中的釀酒酵母JYC2558菌株遺傳關(guān)系接近。來自CICC的LSC-1和來自甘肅的SC008顯示出高度同源性，而從浙江衢州分離的S.C-1與紹興分離的S.C-2遺傳上并不相近，親緣關(guān)系見系統(tǒng)發(fā)育樹(電子版增強(qiáng)出版附件4，https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031898)。

2.2 分離菌株的性狀測定

以工業(yè)菌株CWY132為參考，對分離的酵母菌株從2-PE產(chǎn)量、2-PE耐受性及高溫耐受性進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果表明，不同菌株的2-PE產(chǎn)量差異顯著。釀酒酵母的2-PE合成能力高于其他酵母菌。有6株酵母的2-PE產(chǎn)量在1～2 g/L，4株低于1 g/L。5株釀酒酵母(LSC-1、SC002、SC003、SC004和SC005)的2-PE產(chǎn)量穩(wěn)定在3.4 g/L以上，高于工業(yè)菌株CWY132(電子版增強(qiáng)出版附件5，https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031898)，表明釀酒酵母在2-PE的合成中具有天然優(yōu)勢。上述5株2-PE產(chǎn)量較高的釀酒酵母生長速率顯著高于CWY132，其中LSC-1生長速率最高，其2-PE產(chǎn)量也高。2-PE耐受性測定發(fā)現(xiàn)在2.80 g/L時(shí)，NGER、S.C-1和LSC-1的生長明顯優(yōu)于CWY132。在3.60 g/L時(shí)，NGER生長最好(圖1-a)。高溫耐受性測定發(fā)現(xiàn)，在40 ℃時(shí)，CWY132的生長受到顯著抑制，而其他3株仍能生長。在41 ℃培養(yǎng)48 h后，只有S.C-1生長(圖1-b)，表明S.C-1能夠抵抗高溫脅迫。綜上，以LSC-1、NGER和S.C-1這3株菌作為原生質(zhì)體融合的親本菌株。

a-不同濃度2-PE脅迫；b-高溫脅迫圖1 釀酒酵母菌株在2-PE和高溫脅迫下的耐受性測定Fig.1 Tolerance test of S.cerevisiae strains under stress of 2-PE and high temperature

2.3 第一輪原生質(zhì)體融合獲得耐受性增強(qiáng)的融合子

以NGER和S.C-1為親本進(jìn)行第一輪原生質(zhì)體融合，共獲得20個(gè)融合子，其中RH1-4與NGER生長性能相近，但在2-PE質(zhì)量濃度為3.60 g/L時(shí)，耐受性提高(圖2-a)。在40 ℃下生長性能比較發(fā)現(xiàn)，RH1-4與S.C-1耐熱性相近，表明其從親本中同時(shí)獲得了高溫和2-PE耐受性(圖2-b)。RH1-4的2-PE產(chǎn)量為2.11 g/L，比親本分別增加了11%和24%(圖2-c)。

a-在3.6 g/L 2-PE脅迫下生長；b-在40 ℃下生長；c-2-PE產(chǎn)量圖2 第一輪原生質(zhì)體融合子篩選Fig.2 Screening of strains with 2-PE tolerance from the first round of protoplast fusants注：*表示差異顯著性(P<0.05)(下同)

2.4 第二輪原生質(zhì)體融合獲得2-PE高產(chǎn)融合子

將RH1-4和LSC-1作為親本進(jìn)行第二輪原生質(zhì)體融合，共獲得約100個(gè)融合菌株，根據(jù)高溫耐受性分為A至C級。A：接近LSC-1水平；B：LSC-1和RH1-4之間；C：接近RH1-4的水平(圖3-a)。C級融合子中只有幾株的2-PE產(chǎn)量接近RH1-4(2.11 g/L)，其余都低于RH1-4，接近第一輪親本SC-1的產(chǎn)量1.67 g/L。B級融合子的耐受性沒有達(dá)到RH1-4的預(yù)期水平，但它們的產(chǎn)量相對較高。其中一株融合子RH2-16的2-PE為4.05 g/L，比親本LSC-1增加18.8%。另一株RH2-26的產(chǎn)量達(dá)3.96 g/L，增加了16.5%(圖3-b)。

a-40 ℃脅迫下；b-2-PE產(chǎn)量測定圖3 在原生質(zhì)體融合的第二輪中篩選2-PE產(chǎn)量 和耐受性增加的融合子Fig.3 Screening of fusants with increased 2-PE titre and tolerance in the second round of protoplast fusion

2.5 融合子的遺傳穩(wěn)定性和2-PE產(chǎn)量測定

細(xì)胞DNA含量測定結(jié)果(每107個(gè)細(xì)胞中)：親本NGER、SC-1和LSC-1的分別為0.71、0.67和1.08 μg；融合子RH1-4和RH2-16的分別為1.05和1.49 μg，符合雜合子的特征。融合子連續(xù)傳代后檢測2-PE和乙醇產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)各菌株連續(xù)培養(yǎng)10代、20代、30代后2-PE產(chǎn)量基本穩(wěn)定(電子版增強(qiáng)出版附件6，https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031898)，說明融合子遺傳穩(wěn)定性良好。RH2-16的最高產(chǎn)量為4.31 g/L，5代的平均產(chǎn)量為4.04 g/L。親本和融合子菌株的2-PE產(chǎn)量、耐性等性狀的綜合比較見電子版增強(qiáng)出版附件7(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031898)。此外發(fā)現(xiàn)，在最適生長溫度(30 ℃)下2-PE產(chǎn)量最高，即使是耐熱菌株(電子版增強(qiáng)出版附件8)，有的高產(chǎn)2-PE菌株也具有較好的乙醇生產(chǎn)能力(電子版增強(qiáng)出版附件6和附件8)。

2.6 cdc25突變株表型測定及基因表達(dá)分析

cdc25W1416C和cdc25N1393T的2個(gè)點(diǎn)突變分別被引入融合子菌株RH2-16。結(jié)果表明，cdc25W1416C在40 ℃、105CFU/mL時(shí)生長較好，而野生型幾乎不能生長(圖4-a)。cdc25W1416C在3.0 g/L的2-PE平板上生長優(yōu)于野生型(圖4-b)，表明該突變株提高了綜合耐受性。cdc25N1393T未發(fā)現(xiàn)上述表型。

qRT-PCR技術(shù)分析了RH2-16、cdc25W1416C、CWY132、NGER和S.C-1菌株的耐熱相關(guān)基因(hsp12、hsp104)、乙醇脫氫酶基因(adh2)和艾氏途徑分支途徑酶基因(ald3)的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，與RH2-16相比，RH2-16(cdc25W1416C)中hsp104轉(zhuǎn)錄水平增加了5倍，S.C-1中hsp12增加了近9倍(圖4-c)。cdc25W1416C的2-PE產(chǎn)量增加8%(圖4-d)。說明cdc25W1416C點(diǎn)突變可有效提高耐熱性，增加2-PE產(chǎn)量。

a-40 ℃脅迫；b-2-PE脅迫；c-基因轉(zhuǎn)錄水平差異分析；d-2-PE產(chǎn)量測定圖4 cdc25W1416C突變株的表型鑒定Fig.4 Phenotype identification of cdc25W1416C mutant strains

2.7 艾氏途徑相關(guān)基因過表達(dá)對2-PE合成的影響

選擇芳香族氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ARO8)、苯丙酮酸脫羧酶(ARO10)和醇脫氫酶(ADH2)基因，構(gòu)建了7株過表達(dá)單基因或組合的菌株，分別記為↑ADH2，↑ARO8，↑ARO10，↑ARO8+↑ARO10，↑ARO8+↑ADH2，↑ARO10+↑ADH2和↑ARO8+↑ARO10+↑ADH2(圖5-a)。測定2-PE產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，RH2-16為3.92 g/L，RH2-16 ↑ADH2和RH2-16↑ARO8+↑ARO10分別為3.91和3.88 g/L。其他菌株產(chǎn)量下降，其中RH2-16↑ARO10為3.49 g/L，降低了12%(圖5-b)。結(jié)果表明，該策略不能有效提高菌株RH2-16的2-PE產(chǎn)量。

3 結(jié)論與討論

微生物合成2-PE等天然代謝物的能力，菌株之間的差異很大。篩選優(yōu)良的菌株并采取有效的改良措施，是工業(yè)化生產(chǎn)開發(fā)的途徑[21]。我國酵母菌株資源豐富，分離獲得綜合性狀優(yōu)良的菌株用于2-PE生產(chǎn)的潛能很大，本文研究結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。

a-特異性引物PCR鑒定；b-2-PE產(chǎn)量測定圖5 過表達(dá)艾氏途徑基因各菌株的分子鑒定和2-PE產(chǎn)量Fig.5 Molecular characterization of strains overexpressing Ehrlich pathway genes and determination of 2-PE titre

原生質(zhì)體融合可以繞過有性繁殖的障礙，通過重組基因組DNA的大片段，獲得具有親本遺傳特征的穩(wěn)定“雜交”細(xì)胞。此外，在細(xì)胞融合過程中，可以有效地從親本基因組或突變的隨機(jī)組合中獲得新的正向遺傳變異。釀酒酵母菌株LSC-1、NGER和SC-1經(jīng)兩輪原生質(zhì)體融合后，優(yōu)良性狀已成功整合到融合子菌株中，其2-PE產(chǎn)量顯著高于工業(yè)菌株CWY132，產(chǎn)量提高主要?dú)w因于其耐受性的增強(qiáng)。研究表明，耐熱性是其他脅迫耐受性的良好指標(biāo)，耐熱菌株可以幫助減少2-PE的毒性作用[22]。耐高溫的菌株對氧化和滲透脅迫也有更強(qiáng)的抵抗力[23]。耐熱菌株Ye9-612在30～40 ℃下具有恒定的生長速率，但非耐熱菌株Ye9-596(同一親本的后代)則受到嚴(yán)重影響[15]，本文研究結(jié)果與這些發(fā)現(xiàn)一致。

盡管一些研究表明，在艾氏途徑中超表達(dá)與2-PE合成相關(guān)的基因可以提高產(chǎn)量[2,5-6]，但在本研究中，用相同的策略未能提高融合子RH2-16的2-PE產(chǎn)量?？赡苁荝H2-16的2-PE產(chǎn)量相對較高，進(jìn)一步提高對酵母細(xì)胞產(chǎn)生更強(qiáng)的毒性。此結(jié)果與之前報(bào)道的類似，即4.0 g/L 2-PE可以完全抑制所試酵母細(xì)胞的生長[21]。

綜上，從自然資源中篩選優(yōu)良性狀的菌株做親本，通過原生質(zhì)體融合是一種有效的酵母育種方法。與需要突變文庫構(gòu)建和遞歸融合的基因組改組相比，該法更簡單、高效。對具有良好抗逆性的酵母菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，有助于理解多重耐受機(jī)制[24]。RH2-16可以作為生產(chǎn)2-PE的工業(yè)菌株，也可以作為分析2-PE合成機(jī)理或用于育種的優(yōu)良候選菌株。