鐘 琳, 潘宇飛, 董立巍, 肖 峰, 曹瑞平, 顏紅柱△

1上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院病理科,上海 200137 2海軍軍醫(yī)大學國家肝癌科學中心,上海 201112

膽管癌是一種具有高度異質性的膽道系統(tǒng)惡性腫瘤,起病隱匿,早期診斷困難,可選擇藥物少,放化療易產生耐藥,預后較差,其全球范圍內發(fā)病率和死亡率均逐漸上升[1-3]。膽管癌在我國高發(fā),且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢,已成為威脅我國人民身體健康的重要因素[4]。因此,臨床上迫切需要新的膽管癌治療藥物,改善膽管癌治療現狀。研究發(fā)現,人10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)在膽管癌中存在較高比例的缺失(約40%)[5],關于PTEN蛋白的缺失與膽管癌發(fā)生、進展及預后相關性的研究較少,值得探討。

雷公藤紅素是中草藥雷公藤的主要成分之一,對多種類型的人類腫瘤,如卵巢癌[6]、宮頸癌[7]、骨髓瘤[8]、神經膠質瘤[9]等,均有治療效果,其抗癌機制可能包括以下方面:①誘導細胞凋亡和自噬,②細胞周期阻滯,③抗轉移和抗血管生成,④抗炎,⑤抗氧化[10-11]。雷公藤紅素可以靶向多種信號通路和分子,如活性氧(ROS)/JNK、Akt/mTOR[12-13]、AMPK[14]、NF-κB[15]、STAT3/JAK2[16]、HSP90[17]、ERα[18]、VEGFR[19]、STAT3[20]、促炎性細胞因子[21]、粘附因子[22]等。

有趣的是,PTEN與雷公藤紅素的多個作用靶點之間存在關聯。已有研究報道,PTEN的缺失能夠激活AMPK[23]、NF-κB[24],并誘導VEGFR表達[25]。敲低PTEN表達可誘導促炎細胞因子,如IL-6、CXCL8、CCL2和CCL5的產生[26]。阻斷PTEN可拮抗雷公藤紅素對膽管癌細胞中PI3K/Akt信號通路的抑制[12]。而膽管癌中存在高頻的PTEN缺失突變。由此,我們考慮雷公藤紅素治療膽管癌(尤其是PTEN缺失型)是否具有可行性。本研究分析了不同PTEN表達水平的膽管癌患者的預后差異,并觀察PTEN差異表達的膽管癌細胞系對雷公藤紅素敏感性的差異,探討PTEN表達與膽管癌細胞對雷公藤紅素敏感性的關系。

1 材料與方法

1.1 患者資料及臨床研究方法

本研究納入2015年1月至2017年12月期間,海軍軍醫(yī)大學附屬東方肝膽外科醫(yī)院收治的膽管細胞癌患者65例,對所有手術切除組織均進行組織病理學檢查,由3位經驗豐富的病理學專家分別獨立進行檢查,并獲得共識。本研究獲得海軍軍醫(yī)大學東方肝膽外科醫(yī)院倫理委員會的批準,研究納入的所有膽管細胞癌患者均在術前簽署了知情同意書。其中,男性43例(66.2%),女性22例(33.8%),男女比例為1.95∶1,發(fā)病年齡為34～76歲,中位發(fā)病年齡為55歲,平均年齡為53歲。隨訪75人,失訪10人。所有患者出院后均依據本院標準隨訪流程進行定期隨訪:術后前2年內每3月隨訪一次,術后2年以后每3～6個月隨訪一次。

1.2 膽管癌細胞系來源

人膽管癌細胞系RBE、HCCC-9810購自中國科學院上海細胞庫;TFK1由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院鄒聲泉教授惠贈。

1.3 主要試劑及材料

雷公藤紅素(Celastrol)(Selleck公司);CellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay Kit(Promega公司);RPMI 1640培養(yǎng)液、抗生素(慶大霉素、鏈霉素、青霉素)(上海源培生物科技公司);0.5% Typsin-EDTA(Gibco公司);PierceTMBCA蛋白檢測試劑盒(Thermo Pierce公司);PTEN抗體(Cell Signaling Technology公司)、β-actin抗體(Abclonal公司)。對照腺病毒(NC)、PTEN過表達腺病毒(Ad-PTEN)由漢恒生物科技有限公司提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 免疫組化染色及評分 所有組織標本經4%中性甲醛固定,石蠟包埋,常規(guī)切片、脫蠟,檸檬酸緩沖液微波抗原修復,一抗室溫下培養(yǎng)1 h,二抗室溫下孵育30 min,通過DAB染色,蘇木精復染,無水乙醇脫水,中性樹膠密封觀察。結果判定PTEN陽性部位為細胞質,判讀使用染色強度與陽性細胞百分比二級計分法。染色強度:無著色計0分,淡黃色計1分,黃色或深黃色計2分,黃褐色或棕褐色計3分。陽性細胞所占百分比:無陽性細胞計0分,陽性細胞1%～計1分,26%～計2分,51%～計3分,>75%計4分。最終評分為兩者乘積,得分≤3分判讀為低表達/缺失,>3分判讀為高表達。

1.4.2 細胞培養(yǎng) 用含10%血清及青霉素、鏈霉素、慶大霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞,置于37℃、5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.4.3 Western blot檢測 Western blot檢測膽管癌細胞系HCCC-9810、TFK1、RBE中PTEN表達情況。RIPA裂解液裂解細胞,提取蛋白,100℃變性后,SDS-PAGE蛋白電泳分離蛋白,濕轉法將蛋白從SDS-PAGE分離膠上轉移至NC膜,5% BSA室溫封閉1 h,加入抗PTEN和抗β-actin一抗(稀釋度均為1∶1000)室溫孵育2～3 h,1 × TBST清洗NC膜,熒光二抗室溫避光孵育1 h,1 × TBST清洗NC膜,最后用熒光掃描儀(Odyssey,LI-COR公司)對蛋白條帶進行半定量分析。

1.4.4 CellTiter細胞活力檢測 按1×104個/孔的數目,將細胞接種至96孔白色底透板,每個處理組至少設置3個復孔。待細胞貼壁后予以雷公藤紅素處理,放回37℃、5% CO2恒溫孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將CellTiter試劑在室溫下融化后和無血清培養(yǎng)液按照1∶3的比例配制混合液,按100 μL/孔加入各孔培養(yǎng)細胞中,37℃孵育15 min,用多功能酶標儀測量各孔在620 nm波長下的吸光度值,計算藥物對不同細胞的IC50值。

1.4.5 腺病毒感染 Enhanced Infection Solution試劑溶解腺病毒(購自吉凱基因公司)。將細胞接種至細胞培養(yǎng)皿/孔板,待細胞貼壁后加入適量的已稀釋至適宜濃度的腺病毒(載體:pENTER-His-Flag-PTEN;滴度:1 × 10E10 VP/mL;MOI:3～5)。感染36～48 h后進行后續(xù)實驗。

1.4.6 原代人膽管癌細胞(patient-derived tumor cells,PDCs)分離與培養(yǎng) 獲取手術切除的原代膽管癌腫瘤組織并置于原代組織原液中。在無菌條件下機械分離組織,接著在37°C下用膠原酶Ⅰ(10 mg/mL;Sigma-Aldrich公司)和胰蛋白酶(0.10%;Sigma-Aldrich公司)孵育60 min;經100 mm無菌過濾器過濾;用低滲透紅細胞溶解緩沖液(eBioscience公司)消除紅細胞;將新鮮分離的PDCs在基質涂層培養(yǎng)板中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)液:在RPMI 1640培養(yǎng)液中添加2 mmol/L谷氨酰胺(Invitrogen公司)、20%胎牛血清(FBS,Gibco公司)、1 μmol/L地塞米松(Sigma-Aldrich公司)、人表皮生長因子(40 ng/mL,PeproTech公司)、人成纖維細胞生長因子(FGF,20 ng/mL,PeproTech公司)、人胰島素(5μg/mL,Sigma-Aldrich公司)、青霉素(100 U/mL,Gibco公司)和鏈霉素(100 μg/mL,Gibco公司)。通過換液去除懸浮生長的細胞,通過傳代去除不具有高度增殖能力的細胞。

1.5 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 25.0以及GraphPad 8.0對數據進行統(tǒng)計分析,通過Kaplan-Meier生存曲線分析膽管癌患者的生存期與PTEN表達水平的關系,利用Log-rank法比較PTEN低表達和高表達組患者的生存率差異,以P< 0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 膽管癌組織中PTEN的表達與患者預后相關

免疫組織化學檢測65例膽管癌組織樣本,其中PTEN高表達32例(32/65),占49%,低/缺失表達33例(33/65),占51%。進一步分析PTEN表達與膽管癌患者預后的關系,發(fā)現PTEN缺失/低表達組患者的總體生存期(OS)與無病生存期(DFS)均顯著低于PTEN高表達組(P< 0.01)(圖1)。

2.2 PTEN差異表達的膽管癌細胞對雷公藤紅素的敏感性不同

2.2.1 PTEN在不同膽管癌細胞系中差異表達 Western blot法檢測3種膽管癌細胞系HCCC-9810、TFK1、RBE中PTEN蛋白表達情況,發(fā)現膽管癌細胞系HCCC-9810中PTEN表達缺失,而RBE細胞中PTEN高表達(圖2)。

2.2.2 不同的膽管癌細胞系對雷公藤紅素敏感性不同 利用CellTiter試劑檢測不同膽管癌細胞系對雷公藤紅素的敏感性,發(fā)現膽管癌細胞系RBE IC50值最高,為(1.922 ± 0.719)μmol/L;其次是TFK1細胞系,為(0.637 ± 0.066)μmol/L;HCCC-9810細胞系IC50值最低,為(0.584 ± 0.052)μmol/L(圖3A)。進一步在光鏡下觀察不同膽管癌細胞系經雷公藤紅素(2 μmol/L)處理5 h后的形態(tài)變化,與上述結果一致,HCCC-9810細胞系對雷公藤紅素最敏感,而RBE細胞系最不敏感(圖3B)。

2.2.3 過表達PTEN降低HCCC-9810細胞對雷公藤紅素敏感性 利用腺病毒Ad-PTEN在HCCC-9810細胞中過表達PTEN,利用CellTiter試劑檢測細胞對雷公藤紅素的敏感性,發(fā)現Ad-PTEN組HCCC-9810細胞對雷公藤紅素的敏感性減弱(圖4A)。光鏡下觀察對照組與Ad-PTEN組HCCC-9810細胞經雷公藤紅素(2 μmol/L)處理5 h后的形態(tài)變化(圖4B),與圖4A的結果一致,說明過表達PTEN降低了HCCC-9810細胞系對雷公藤紅素的敏感性。

2.2.4 PTEN缺失的原代人膽管癌細胞對雷公藤紅素敏感 我們分離培養(yǎng)原代人膽管癌細胞(PDCs),通過Western blot檢測PTEN表達情況,繼而檢測PTEN表達/PTEN缺失的PDCs經雷公藤紅素處理后的細胞活力,發(fā)現PTEN缺失的PDCs對雷公藤紅素較為敏感(圖5)。

3 討論

PTEN又名人10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因,是PI3K/AKT/mTOR信號通路的主要負調節(jié)分子[27],能夠調控細胞增殖、生長、生存和代謝等細胞過程[28-30]。有文獻報道,在多種人類腫瘤中存在PTEN突變,如結直腸癌[31]、膠質母細胞瘤[32]、乳腺癌[33]、前列腺癌[34]。另有研究發(fā)現膽管癌臨床組織樣本中存在高頻的PTEN突變[5]。本研究發(fā)現,在膽管癌組織樣本中PTEN存在一定比例的缺失/低表達,與文獻報道一致,且該組患者預后較差,但其具體機制不詳,推測PTEN可能通過PI3K/Akt/mTOR信號通路影響腫瘤惡性進程,進而影響膽管癌患者預后。

雷公藤,系指衛(wèi)矛科植物雷公藤干燥根的木質部,歸肝、腎經,性苦、辛,有大毒;功能祛風除濕,殺蟲止癢,活血通絡,消腫止痛,解毒殺蟲;臨床用于治療風濕、類風濕性關節(jié)炎等多種自身免疫性疾病。雷公藤紅素是中草藥雷公藤的主要成分之一,藥理學研究發(fā)現雷公藤紅素具有抗炎、免疫抑制、抑制細胞增殖、促進細胞凋亡等多種功能。雷公藤紅素對肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、白血病等多種癌癥具有抗腫瘤作用[35-39]。研究發(fā)現,雷公藤紅素可以通過多種途徑誘導凋亡進而殺傷腫瘤細胞[35-37]。

本研究中,我們發(fā)現PTEN差異表達的膽管癌細胞系對雷公藤紅素的敏感性不同,PTEN野生型膽管癌細胞系RBE對雷公藤紅素不敏感,PTEN缺失型膽管癌細胞系HCCC-9810對雷公藤紅素較敏感,提示雷公藤紅素應用于治療PTEN缺失/低表達膽管癌患者具有一定可行性。但PTEN能否調控膽管癌細胞對雷公藤紅素的敏感性,是否通過調控PI3K/Akt/mTOR信號通路影響雷公藤紅素對膽管癌的殺傷作用,其具體機制仍待更進一步深入研究。