呂成鵬，倪 華，李 龍，劉彥普，賀龍龍

（1.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院 陜西省顱頜面精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 陜西 西安 710004；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院組織工程研發(fā)中心 陜西 西安 710032；3.廣東省深圳市南山區(qū)蛇口人民醫(yī)院口腔科 廣東 深圳 518066；4.空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科 陜西 西安 710032）

頜面部軟組織缺損的美學(xué)修復(fù)是臨床工作中經(jīng)常面臨的問(wèn)題[1-2]。目前，缺損的修復(fù)手段主要包括假體的植入、透明質(zhì)酸充填和自體脂肪移植等，但這些方法都有一定的局限性。假體植入和透明質(zhì)酸充填由于其可能存在的術(shù)后并發(fā)癥給病人帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)[3]，而自體脂肪由于其分布廣泛、手術(shù)操作便捷及無(wú)排斥反應(yīng)和倫理問(wèn)題越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于頜面軟組織缺損修復(fù)，但脂肪移植后不可控的吸收問(wèn)題為脂肪移植帶來(lái)困擾[4]。人工誘導(dǎo)脂肪再生（即組織工程化脂肪）技術(shù)的出現(xiàn)為軟組織缺損的修復(fù)提供了新的思路，組織工程化脂肪可通過(guò)提供種子細(xì)胞、血運(yùn)條件及再生微環(huán)境實(shí)現(xiàn)脂肪組織的新生。組織工程脂肪被認(rèn)為是目前最有前景的治療軟組織缺損的方法[5]。本研究通過(guò)將構(gòu)建的可注射組織工程化脂肪移植于裸鼠皮下不同部位，探討不同移植部位對(duì)可注射組織工程化脂肪生存率的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑：高糖D M E M（G i b c o），胎牛血清（G i b c o），I 型膠原酶（S i g m a），β-甘油磷酸鈉（S i g m a），3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（I B M X）（Peprotech），吲哚美辛（Peprotech），茜素紅（Peprotech）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6月齡新西蘭大白兔3只，體重2.5～3 kg，6周齡雌性裸鼠6只，移植后裸鼠分為兩組，裸鼠背部皮下組和裸鼠腹股溝皮下組（同體對(duì)照，每組6個(gè)位置）。由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供和飼養(yǎng)。

1.3 ADSCs的分離和培養(yǎng)：取新西蘭兔雙側(cè)腹股溝及頸背部的皮下脂肪，剪碎并清理切取的脂肪組織，用DMEM高糖配制1%I型膠原酶37℃消化1 h；1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入DMEM培養(yǎng)基（含雙抗，10%胎牛血清，292 mg/L的谷氨酰胺，50 mg/L的Vita min C）重懸浮；接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，5%CO2，37℃飽和濕度培養(yǎng)，3 d后換液，后隔日換液；5～7 d后按照1∶2比例傳代，第二代細(xì)胞以1∶3傳代。

1.4 ADSCs的成脂、成骨多向分化能力檢測(cè)

1.4.1 成脂分化能力檢測(cè)：取第3代的ADSCs細(xì)胞，1×105個(gè)/cm2接種于1.2 cm×1.2 cm的蓋玻片上，細(xì)胞密度達(dá)80%后加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，3 d換液1次，7 d后用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS洗3遍，60%異丙醇淋洗。浸入油紅〇染液10 min，60%異丙醇分色至背景無(wú)色，雙蒸水洗1遍，蘇木精復(fù)染，晾干，甘油明膠封片，光鏡下檢查。

1.4.2 成骨分化能力檢測(cè)：取第3代的ADSCs細(xì)胞，1×105個(gè)/cm2接種于1.2cm×1.2 cm的蓋玻片上，細(xì)胞密度達(dá)80%以后加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3 d換1次液，4周后用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS洗3遍，加1%茜素紅溶液，37℃染色30 min，雙蒸水洗去多余的染料，晾干，甘油明膠封片，光鏡下檢查。

1.5 富含血小板血漿（PRP）的制備：20 ml無(wú)菌注射器抽取抗凝劑枸櫞酸鈉2 ml，于新西蘭大白兔耳中動(dòng)脈抽取18 ml動(dòng)脈血，1 500 rpm離心20 min，使PRP/PPP和紅細(xì)胞分開(kāi)，超凈臺(tái)內(nèi)吸取全部上清液、白膜層及以下2 mm的紅細(xì)胞層，置于抗凝管中，再次以2 000 rpm離心10 min，棄掉部分上清液，剩余液體即為PRP；按照10∶1比例加入激活劑（10%CaCl2+凝血酶），20 s即凝固，將PRP凝膠剪碎平均分成6份，置于4℃冰箱中備用。

1.6 脂肪移植物的制備及移植方法；兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1 ml/kg），取頸背部脂肪清理并修剪，將脂肪組織剪成直徑為1 mm的顆粒。每個(gè)樣本加入1×106個(gè)第三代脂肪基質(zhì)干細(xì)胞。1 ml的針管18號(hào)白色針頭吸取脂肪移植物，在裸鼠背部及裸鼠腹股溝皮下利用針頭潛行分離，注射構(gòu)建的脂肪復(fù)合物，背部皮下組及腹股溝皮下組各6個(gè)標(biāo)本，每個(gè)點(diǎn)注射0.3 ml脂肪復(fù)合體（ADSCs+PRP+脂肪顆粒）。

1.6 B超測(cè)量移植物體積方法：測(cè)量由2位固定的醫(yī)生執(zhí)行以減少系統(tǒng)誤差，測(cè)量介質(zhì)為水。測(cè)量指標(biāo)為移植物的長(zhǎng)、寬和高，通過(guò)計(jì)算公式：1/2×a×b×c（a長(zhǎng)、b寬、c高）來(lái)計(jì)算體積[6]，對(duì)第1、2、4、6周進(jìn)行測(cè)量。存活率=各時(shí)間點(diǎn)測(cè)量脂肪體積/0.3×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：統(tǒng)計(jì)分析運(yùn)用SPSS 26.0軟件，對(duì)不同移植部位的脂肪存活率進(jìn)行分析。分析方法：運(yùn)用重復(fù)測(cè)量的方差分析來(lái)評(píng)價(jià)背部移植組與腹股溝移植組移植物體積隨時(shí)間變化的差異。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs的體外培養(yǎng)及多向誘導(dǎo)能力檢測(cè)：對(duì)新西蘭兔切去脂肪組織進(jìn)行原代培養(yǎng)。8 h細(xì)胞貼壁，24 h貼壁完成，72 h更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)細(xì)胞呈多角形、短梭形（圖1A），傳代后漸漸成為均質(zhì)的長(zhǎng)梭形細(xì)胞。取第3代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行成脂肪、成骨誘導(dǎo)。加入成脂誘導(dǎo)液后，細(xì)胞逐漸變?yōu)槎嘟切危? d后細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)小脂滴形成，4 d后脂滴逐漸變大（圖1B）。油紅〇染色見(jiàn)紅染的脂滴（圖1C）。加入成骨誘導(dǎo)液3 d后，細(xì)胞變成短梭形，4周后茜素紅染色陽(yáng)性（圖1D）。

圖1 脂肪基質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）的成脂、成骨誘導(dǎo)

2.2 不同移植部位的可注射組織工程化脂肪存活率：大體肉眼觀察，兩組移植裸鼠均存活，脂肪移植物健康，無(wú)感染及排斥反應(yīng)發(fā)生。隨時(shí)間變化，裸鼠腹股溝及背部脂肪移植物體積逐漸變小。第6周時(shí)，腹股溝移植組脂肪體積明顯大于背部移植組（圖2）。

圖2 兩組第1、2、4、6周大體觀察

B超對(duì)兩組移植物不同時(shí)間點(diǎn)體積進(jìn)行測(cè)量（圖3），并計(jì)算存活率。腹股溝組與背部組存活率隨時(shí)間的推移逐漸降低（表1），第2～4周降幅最大，第6周時(shí)腹股溝組的存活率明顯高于背部組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。運(yùn)用重復(fù)測(cè)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組的存活率有顯著差異（P=0.033），腹股溝組存活率高于背部組（見(jiàn)表1）。

表1 兩組第1、2、4、6周移植脂肪存活率比較 （±s，%）

表1 兩組第1、2、4、6周移植脂肪存活率比較 （±s，%）

注：*表示腹股溝組與背部組的重復(fù)測(cè)量分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（n=6，P＜0.05）,#表示兩組第6周比較，P＜0.05。

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圖3 兩組第1、2、4、6周B超測(cè)量脂肪移植物體積變化情況

3 討論

創(chuàng)傷、感染、腫瘤、先天畸形等各種因素可以導(dǎo)致頜面部軟組織大面積缺損，自體組織移植是目前頜面軟組織修復(fù)重建的主要手段，包括皮瓣移植、皮膚擴(kuò)張、脂肪移植等技術(shù)[7]。其中，脂肪移植因其具有操作簡(jiǎn)便、取材方便、來(lái)源豐富、組織相容性好等特點(diǎn)被廣泛運(yùn)用于臨床。隨著對(duì)脂肪移植研究的不斷深入，在移植手術(shù)中對(duì)于脂肪的獲取、處理、移植后處理等環(huán)節(jié)也得到不斷的更新和優(yōu)化[8]。目前，脂肪移植不僅用于軟組織的修復(fù)重建，在美容整形領(lǐng)域也有廣泛運(yùn)用[9]。脂肪移植不僅可以單獨(dú)應(yīng)用，也可以與皮瓣移植結(jié)合使用，術(shù)后的效果比傳統(tǒng)皮瓣移植更加自然、患者滿(mǎn)意度高。而脂肪移植技術(shù)在應(yīng)用過(guò)程中也存在移植脂肪吸收率高等難題，其中移植脂肪組織的血供重建是影響治療效果的關(guān)鍵因素[10]。

脂肪基質(zhì)干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）是組織工程中常用的種子細(xì)胞。其具有多項(xiàng)分化作用，在合適的條件下ADSCs能夠被誘導(dǎo)成為成脂細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞；另外，移植的ADSCs能通過(guò)旁分泌作用促進(jìn)組織建立新生血管、調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)來(lái)刺激宿主來(lái)源干細(xì)胞成脂[11-12]。富含血小板血漿（PRP）能夠緩慢釋放各種生長(zhǎng)因子，可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞再生。PRP與脂肪顆粒聯(lián)合注射后，可以增大脂肪顆粒周?chē)?xì)血管密度，提高脂肪移植的生存率[13]。本課題組[14]通過(guò)脂肪基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合PRP運(yùn)用于脂肪移植中，能夠顯著提高移植脂肪的存活率。

唐軍[15]等對(duì)Wistar雌性大鼠背部皮下和股二頭肌內(nèi)進(jìn)行組織工程脂肪移植，發(fā)現(xiàn)背部皮下組脂肪存活率優(yōu)于股二頭肌組，認(rèn)為背部皮下為良好的移植位點(diǎn)。本研究通過(guò)將組織工程脂肪復(fù)合物移植于裸鼠背部皮下與腹股溝皮下，觀察移植物體積變化，從而判斷不同部位對(duì)于脂肪移植后生存率的影響。通過(guò)重復(fù)測(cè)量的方差分析，腹股溝皮下組移植后體積大于背部皮下組，體積變化差異P=0.033＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第1、2、4周時(shí)，組間對(duì)比P＞0.05,組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第6周時(shí)，組間對(duì)比P＜0.05,腹股溝皮下組體積大于背部皮下組，體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腹股溝皮下脂肪移植能夠減少脂肪移植后的吸收。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能與裸鼠腹股溝皮下血供良好、機(jī)械張力小等因素有關(guān)，其細(xì)胞與分子學(xué)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

總之，組織工程化脂肪生存率有耐于良好的成脂微環(huán)境，血運(yùn)供應(yīng)和機(jī)械張力都應(yīng)該是動(dòng)物模型建立需要考慮的問(wèn)題。本研究發(fā)現(xiàn)可注射組織工程化脂肪的裸鼠腹股溝皮下移植組存活率大于背部皮下移植，為組織工程脂肪移植受區(qū)的選擇提供一些參考。