謝 穩(wěn)，謝雙龍，余 娜，林治華

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 重慶 400054；2.重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心藥學(xué)部， 重慶 400036)

0 引言

結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由感染結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)所導(dǎo)致的世界性傳染病之一，多發(fā)病于肺部，也可感染其他器官和組織，具有高發(fā)病率和高死亡率。根據(jù)世界衛(wèi)生組織WHO出具的全球結(jié)核病報告2020年版的數(shù)據(jù)，在2019年全球約有1 000萬人感染結(jié)核，140萬人死于結(jié)核(其中有20萬死亡患者為HIV陽性)[1]。目前，WHO推薦的藥物敏感性結(jié)核病的治療方案為四藥聯(lián)合，即患者使用抗結(jié)核一線藥物異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇強(qiáng)化治療2個月后，再用異煙肼、利福平繼續(xù)規(guī)范治療4個月[2]。但隨著多藥耐藥和廣泛耐藥結(jié)核病的增多，以及HIV患者感染結(jié)核病例更加普遍，尋求新的化學(xué)治療手段成為了抗結(jié)核病研究的重點(diǎn)。

磷酸甲基赤蘚糖醇(methylerythritolphosphate,MEP)途徑是結(jié)核分枝桿菌用于生物合成異戊烯基焦磷酸和其異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸的重要環(huán)節(jié)，后兩者是異戊二烯的通用五碳前體。異戊二烯在細(xì)菌細(xì)胞壁成分的生物合成中起著關(guān)鍵作用，因此，對結(jié)核分枝桿菌和一些其他致病細(xì)菌的生存至關(guān)重要[3]。在人類體內(nèi)，磷酸甲基赤蘚糖醇途徑則完全不存在，取而代之的是由甲羥戊酸途徑合成人體所需的異戊二烯，因此，磷酸甲基赤蘚糖醇途徑體現(xiàn)出的系統(tǒng)選擇性以及對細(xì)菌生存的重要性，使參與其中的代謝酶成為新型抗結(jié)核藥物開發(fā)的潛在靶標(biāo)[4]。1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)是磷酸甲基赤蘚糖醇途徑中的第二個酶，催化第二個限速反應(yīng)，在氧化還原輔助因子NADPH的協(xié)助和二價金屬陽離子的存在下，催化1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸鹽(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate,DXP)形成磷酸甲基赤蘚糖醇[5]。膦胺霉素(Fosmidomycin)為從薰衣草鏈霉菌屬中分離出的天然產(chǎn)物[6]，對結(jié)核分枝桿菌1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(mtDXR)表現(xiàn)出強(qiáng)大的體外抑制活性，IC50值為80 nM，能取代DXP和DXR、NADPH、Mn2+形成四元共晶結(jié)構(gòu)，從而抑制催化反應(yīng)進(jìn)程[7]。然而，因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁成分中富含霉菌酸，高極性的膦胺霉素?zé)o法穿透其脂質(zhì)細(xì)胞壁，從而無法產(chǎn)生整體細(xì)菌抑制活性[8]。因此，研究者們對膦胺霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了大量改造嘗試，包括但不限于合成磷酸酯前藥、修飾異羥肟酸基團(tuán)以及主鏈改造等，合成了一系列膦胺霉素衍生物，以期提高其疏水性能和整體抑菌活性[9-12]。

本文在前人研究的基礎(chǔ)上，收集了35個已證實(shí)對mtDXR有體外抑制活性的膦胺霉素衍生物，用比較分子場分析方法(comparative molecular field analysis,CoMFA)和比較分子相似性指數(shù)分析方法(comparative molecular similarity indices analysis,CoMSIA)，建立了可靠的3D-QSAR模型，剖析其立體場、靜電場和氫鍵受體場的三維等勢圖，再結(jié)合分子對接得到的小分子配體和蛋白靶點(diǎn)的作用模式，設(shè)計出14個新型的膦胺霉素類小分子化合物，并確定了有望作為先導(dǎo)化合物展開進(jìn)一步研究的新型小分子27m，為全新mtDXR抑制劑的開發(fā)提供了理論參考。

1 研究方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本文研究的35個膦胺霉素衍生物均來源于文獻(xiàn)[13-15]，在其中隨機(jī)挑選7個化合物作為測試集(前面標(biāo)有符號“*”)，剩下的28個化合物作為訓(xùn)練集。訓(xùn)練集用于建立3D-QSAR模型，而測試集用于驗(yàn)證基于訓(xùn)練集數(shù)據(jù)所建模型的預(yù)測能力。原文獻(xiàn)中用IC50值表示化合物，對mtDXR的體外抑制活性，為了更好地輸入和計算研究數(shù)據(jù)，本文中換算成其負(fù)對數(shù)(-log IC50)作為因變量生物活性的單位，即pIC50值，如表1所示。膦胺霉素衍生物的分子結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 膦胺霉素衍生物的分子結(jié)構(gòu)示意圖

表1 膦胺霉素衍生物的實(shí)測活性與3D-QSAR模型預(yù)測活性值

續(xù)表(表1)

續(xù)表(表1)

1.2 分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化和疊合

本文的35個膦胺霉素衍生物的三維分子結(jié)構(gòu)均在軟件SYBYL-X 2.1(來源：重慶理工大學(xué))上搭建，加氫、命名，先用遺傳算法GA conformational search篩選化合物分子的低能構(gòu)象，然后給每個化合物分子賦予Tripos力場和Gasteiger-Huckel電場，利用Powell方法對化合物分子進(jìn)行能量優(yōu)化，最大迭代次數(shù)設(shè)置為 2 000，終點(diǎn)梯度設(shè)置為0.005 kcal/mol，其余參數(shù)為默認(rèn)值。以展現(xiàn)出最高抑制活性的化合物27號作為疊合模板，將結(jié)構(gòu)優(yōu)化后的化合物構(gòu)象基于公共骨架進(jìn)行分子疊合，27號化合物的結(jié)構(gòu)見圖2(加粗部分為此次疊合的公共骨架)。基于公共骨架的分子疊合結(jié)果詳見圖3。

圖2 化合物27的分子結(jié)構(gòu)示意圖

圖3 基于公共骨架的分子疊合示意圖

1.3 3D-QSAR模型的建立

在SYBYL-X 2.1的QSAR模塊，運(yùn)用經(jīng)典的CoMFA和CoMSIA方法構(gòu)建疊合化合物的3D-QSAR模型。比較分子場分析法(CoMFA)是Cramer等于1988年創(chuàng)建的三維定量構(gòu)效關(guān)系研究方法[16]，該方法認(rèn)為，在分子水平上，藥物分子周圍立體場和靜電場與受體之間的非共價鍵相互作用是其生物活性的主要來源，將疊合好的分子放置于一個三維網(wǎng)格中，使用一個sp3雜化、帶+1價電荷的碳原子為探針，計算格點(diǎn)上探針與藥物分子的相互作用能，以確定各種分子場的空間分布[17]。而比較分子相似性指數(shù)分析法(CoMSIA)于1994年由Klebe等提出[18]，該方法與CoMFA方法最大的區(qū)別是在立體場和靜電場以外，又定義了疏水場、氫鍵受體和氫鍵供體場這3種分子場，且分子場的計算采用了與距離相關(guān)的高斯函數(shù)，有效避免了CoMFA方法中由于采用Coulomb和Lennard-Jones勢函數(shù)所引起的缺陷，且不再需要定義能量截斷值。因作為自變量的分子場數(shù)值數(shù)目遠(yuǎn)大于作為因變量的生物活性數(shù)值，故采用偏最小二乘法(partial least squares,PLS)進(jìn)行回歸分析。首先使用留一法(leave-one-out,LOO)進(jìn)行交互檢驗(yàn)，得到最佳主成分值n和交互檢驗(yàn)系數(shù)q2，普遍認(rèn)為q2>0.5時，模型才有預(yù)測能力；然后再以得出的最佳主成分值進(jìn)行非交互檢驗(yàn)分析，得到相關(guān)系數(shù)r2，標(biāo)準(zhǔn)誤差SEE和F檢驗(yàn)值，可靠的F檢驗(yàn)值理論上應(yīng)大于100(F>100)；再者應(yīng)用建好的3D-QSAR模型對測試集和訓(xùn)練集的化合物進(jìn)行活性預(yù)測，分析化合物的實(shí)測活性值與模型預(yù)測活性值之間的相關(guān)性；最后利用三維等勢圖(contour maps)顯示QSAR方程，研究化合物公共骨架結(jié)構(gòu)上的基團(tuán)取代與整體生物活性之間的關(guān)系，從而在此基礎(chǔ)上進(jìn)行膦胺霉素衍生物分子結(jié)構(gòu)的優(yōu)化和改造，以設(shè)計得到預(yù)測活性更高的新型化合物。

1.4 分子對接分析

分子對接主要用于展示小分子配體和蛋白受體之間的相互作用，計算并預(yù)測其結(jié)合模式和親和力，繼而進(jìn)行作用機(jī)理解釋或先導(dǎo)化合物虛擬篩選，是基于靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計的一種重要方法[19]。本文研究的靶點(diǎn)蛋白mtDXR的晶體結(jié)構(gòu)下載于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB(www.rcsb.org，code：2Y1D)，使用SYBYL-X 2.1的蛋白準(zhǔn)備模塊，先對靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行計算分析，再在分析結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行加氫、加電荷、修復(fù)側(cè)鏈等處理，移去原配體小分子以便形成對接活性口袋，只保留A鏈氨基酸殘基，移去所有水分子，修改His248的質(zhì)子化狀態(tài)，以便質(zhì)子化的氮能朝向小分子抑制劑，其余參數(shù)保留為默認(rèn)值[15]。使用Surflex-Dock Geom模式將膦胺霉素類小分子化合物對接到處理后的靶點(diǎn)蛋白的活性口袋中，分析小分子配體與活性位點(diǎn)關(guān)鍵氨基酸殘基的非鍵作用，與3D-QSAR模型的結(jié)果互相驗(yàn)證，共同指導(dǎo)化合物分子結(jié)構(gòu)的改造。

2 結(jié)果與討論

2.1 3D-QSAR建模結(jié)果

以訓(xùn)練集28個膦胺霉素衍生物構(gòu)建的CoMFA和CoMSIA模型的最佳統(tǒng)計學(xué)結(jié)果如表2所示。使用CoMSIA方法建模的過程中，可考慮各種不同分子場的組合以得到最佳模型，最后列出按照q2值降序排列條件下的前5名分子場組合的統(tǒng)計結(jié)果，見表3。立體場和靜電場組合(S+E)得到的CoMFA模型，其最佳主成分值n=7，交互檢驗(yàn)系數(shù)q2=0.601，大于0.5，代表此模型有較好的穩(wěn)定性與預(yù)測能力，此外，較大的相關(guān)系數(shù)r2(0.979)和F值(131.383)以及偏小的標(biāo)準(zhǔn)誤差SEE(0.159)，也說明此模型有較強(qiáng)的擬合能力和統(tǒng)計學(xué)意義。就各種分子場組合的q2、F值和標(biāo)準(zhǔn)誤差綜合考慮，CoMSIA模型的最佳分子場組合為立體場、靜電場和氫鍵受體場(S+E+A)，其中立體場和靜電場的貢獻(xiàn)值分別為0.372%和0.564%，說明小分子抑制劑的活性主要與其中基團(tuán)的立體效應(yīng)和電荷分布相關(guān)，這與CoMFA模型的結(jié)果基本一致。最佳CoMSIA模型的PLS計算結(jié)果(見表2)，也預(yù)示其有較好的預(yù)測能力。

為了對以上CoMFA和CoMSIA模型的預(yù)測能力進(jìn)行驗(yàn)證，用模型先后預(yù)測了28個訓(xùn)練集化合物和7個測試集化合物的活性值(pIC50)，然后用實(shí)測活性值與預(yù)測活性值(見表1)進(jìn)行線性回歸分析，從圖4可以看出，絕大部分的化合物的活性數(shù)據(jù)都分布在趨勢線附近，顯示了預(yù)測活性值和實(shí)測活性值有著較高的擬合度，兩大模型也都具有良好的預(yù)測能力。

表2 CoMFA和CoMSIA模型的最佳統(tǒng)計結(jié)果

表3 按照q2值降序排列的前5名分子場組合下的CoMSIA模型統(tǒng)計結(jié)果

圖4 訓(xùn)練集和測試集的預(yù)測活性值與實(shí)測活性值之間的相關(guān)性曲線

2.2 三維等勢圖結(jié)果及分析

CoMFA和CoMSIA模型的三維等勢圖以實(shí)測活性最高的27號分子為模板來展示。從統(tǒng)計結(jié)果可以看到，在CoMFA模型中，以立體場(0.602%)的貢獻(xiàn)值為主，在CoMSIA模型中，以立體場(0.372%)和靜電場(0.564%)的貢獻(xiàn)值為主，而在后續(xù)的分子改造實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)氫鍵受體在相關(guān)位置的引入也對提高預(yù)測活性有影響，因此，以此4個分子力場的三維等勢圖為基礎(chǔ)來分析化合物分子結(jié)構(gòu)上可進(jìn)行修飾和基團(tuán)改造的區(qū)域，如圖5所示。

圖5(a)是CoMFA模型立體場的三維等勢圖，綠色色塊表示在此部位應(yīng)加入大體積基團(tuán)，而黃色色塊表示此處的取代基團(tuán)體積越小越有利。異羥肟酸部分的取代苯環(huán)的間位和對位有大面積的綠色色塊，說明在此兩處以大體積基團(tuán)取代可以增加化合物活性，而鄰位的黃色色塊則說明小體積基團(tuán)取代或不取代可以增加化合物活性，如化合物27(pIC50=6.854)和28(pIC50=5.921)的活性就大于化合物26(pIC50=4.886)。Cα部位的二氯苯環(huán)取代基上也有大面積的綠色色塊，說明在此處增加立體位阻以較大體積的基團(tuán)取代能增強(qiáng)化合物活性，如化合物16(pIC50=5.620)的活性就大于化合物12(pIC50=5.387)。

圖5 27號模板分子的CoMFA和CoMSIA三維等勢圖

圖5(b)是CoMSIA模型立體場的三維等勢圖，可以發(fā)現(xiàn)其分布與CoMFA模型基本一致，異羥肟酸部分的取代苯環(huán)的對位有綠色色塊，以大體積基團(tuán)取代可以增加化合物的活性；鄰位有黃色色塊，無基團(tuán)或小基團(tuán)取代可以得到更好的活性；Cα部位二氯苯環(huán)取代基上的大面積綠色色塊預(yù)示著在此增加立體位阻同樣能夠提高化合物的活性。圖5(c)是CoMSIA模型靜電場的三維等勢圖，紅色色塊表示在此處應(yīng)引入負(fù)電性基團(tuán)，而藍(lán)色色塊則表示此處增加正電性基團(tuán)對活性的提高更有利。從圖中可以看出，異羥肟酸部分的取代苯環(huán)上有大面積的紅色色塊，說明使用負(fù)電性基團(tuán)對此苯環(huán)進(jìn)行取代能有效地提高化合物活性，如-F和-CF3等。Cα部位的二氯苯環(huán)取代基下方存在大片紅色色塊，嘗試用電負(fù)性更大的基團(tuán)取代氯原子或許可提高活性。圖5(d)是CoMSIA模型氫鍵受體場的三維等勢圖，洋紅色色塊表示在此處增加氫鍵受體可提高化合物活性，而紅色色塊則表示應(yīng)在此處減少氫鍵受體的存在。從此圖上可以看到，Cα部位的二氯苯環(huán)取代基下存在大面積的洋紅色色塊，說明此處引入氫鍵受體能有效的提高化合物的活性，如含氧雜環(huán)取代的化合物10(pIC50=5.824)的活性大于萘取代的化合物11(pIC50=5.237)，有吡啶環(huán)取代的化合物17(pIC50=5.481)和15(pIC50=6.097)的活性大于僅用苯環(huán)取代的化合物12(pIC50=5.387)，因此后續(xù)的結(jié)構(gòu)改造也應(yīng)遵循此方向。

2.3 分子對接結(jié)果及分析

分子對接結(jié)果和結(jié)合模式分析以擁有最高抑制活性的27號化合物為模板進(jìn)行展示，可以看到，整個分子被蛋白活性口袋緊緊包裹，如圖6所示。異羥肟酸部分的羥基氧朝向Mn2+，方便與金屬離子形成緊密的配位作用，此特征相互作用在以往的研究里也有報道[20]，說明本研究使用的分子對接協(xié)議可靠性較高。另外，異羥肟酸部分的取代苯環(huán)探向結(jié)合口袋深處，對其間位和對位進(jìn)行大體積基團(tuán)取代能使小分子與蛋白活性部位結(jié)合得更加牢固，此結(jié)論與3D-QSAR的結(jié)果相吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證了所建模型的可靠性。

綠色區(qū)域?yàn)榈鞍讓涌诖?，灰色棍?7號化合物分子，紫色圓球?yàn)镸n2+

mtDXR蛋白活性部位與27號化合物分子的非鍵作用分別用三維圖(圖7)和二維圖(圖8)展示，以便更好地分析其相互作用。

紅色細(xì)棍為關(guān)鍵氨基酸殘基，灰色粗棍為27號化合物分子，綠色虛線表示氫鍵，灰色虛線表示金屬配位作用，淡紫色虛線表示疏水作用，淡綠色虛線表示非典型氫鍵作用

圖8 27號化合物與mtDXR蛋白相互作用二維展示圖

首先，27號化合物分子磷酸基上的羥基氧與氨基酸殘基SER177形成了1個強(qiáng)氫鍵，羰基氧與氨基酸殘基SER245形成了一個強(qiáng)氫鍵，距離分別為1.98 ?和1.89 ?。異羥肟酸部分的羥基氧與氨基酸殘基GLU153形成了一個距離為2.88 ?的強(qiáng)氫鍵，而三氮唑上的氮原子也與氨基酸殘基LYS128形成了一個距離為2.12 ?的強(qiáng)氫鍵。氫鍵的生成大大增加了化合物分子與受體結(jié)合的牢固性。其次，異羥肟酸部分的羥基氧與二價金屬離子錳形成了O-Mn鍵(1.88 ?)，此金屬螯合作用有助于配體分子與蛋白靶點(diǎn)的緊密結(jié)合。再次，疏水作用廣泛存在，氨基酸殘基MET267與異羥肟酸部分的取代苯環(huán)以及二氯苯環(huán)上的氯原子皆形成了較強(qiáng)的疏水相互作用，距離分別為5.47 ?、4.14 ?和5.18 ?。二氯苯環(huán)上的對位氯原子與氨基酸殘基PRO265形成了距離為4.86 ?的弱疏水相互作用，若嘗試在此處用一個疏水性較強(qiáng)的基團(tuán)取代，可能會增強(qiáng)與氨基酸殘基的疏水作用進(jìn)而增加整體化合物的活性，如-Br。三氮唑取代基也與氨基酸殘基LYS128以及ALA126形成了弱的疏水相互作用，距離分別為5.38 ?和4.74 ?。另外，二氯苯環(huán)上的對位氯原子附近有氨基酸殘基HIS248，并且形成了一個弱氫鍵(2.80 ?)，在此處增加氫鍵受體能加強(qiáng)氫鍵相互作用，從而提高整體化合物活性，而且由于組氨酸在生理條件下是正電荷氨基酸，因此，在苯環(huán)上用負(fù)電性基團(tuán)取代氯原子有利于化合物活性的增加，此結(jié)論與CoMSIA模型的氫鍵受體場和靜電場的分析結(jié)果相吻合。

2.4 全新膦胺霉素衍生物的設(shè)計及評價

結(jié)合3D-QSAR的三維等勢圖和分子對接結(jié)果，可以確定膦胺霉素類小分子化合物的結(jié)構(gòu)修飾區(qū)域，然后以原抑制活性最高的27號化合物分子為模板，進(jìn)行結(jié)構(gòu)的優(yōu)化和改造，以得到擁有更高預(yù)測活性的新化合物分子。通過對靜電場、立體場和氫鍵受體場的分析，以及分子對接顯示的配體與受體活性部位關(guān)鍵氨基酸殘基的相互作用模式，在保留膦胺霉素基本骨架的同時，異羥肟酸部分的取代苯環(huán)的間位和對位上應(yīng)該引入大體積且負(fù)電性的基團(tuán)，如-F、-CF3；二氯苯環(huán)處可引入疏水性更高的基團(tuán)取代氯原子，如-Br；二氯苯環(huán)處還可引入電負(fù)性較大的氫鍵受體取代氯原子，如-COR、-OAr等，同時也滿足了此處需要大體積基團(tuán)占位的需求。

根據(jù)此思路，本文設(shè)計出了14個全新的膦胺霉素類小分子化合物(圖9)，其結(jié)構(gòu)和預(yù)測活性如表4所示。利用已建立的CoMFA和CoMSIA模型分別預(yù)測這14個新化合物的活性，并且根據(jù)已有的分子對接協(xié)議對其進(jìn)行打分，然后和原最高抑制活性的27號化合物相比較，結(jié)果顯示：新化合物的對接得分和預(yù)測活性普遍較高，特別是化合物27m，同時擁有比27號化合物更高的對接得分和預(yù)測活性，說明上述的改造策略取得了初步成功，通過增強(qiáng)膦胺霉素類小分子化合物和mtDXR蛋白的非鍵作用，提高了配體受體的結(jié)合牢固性及化合物的整體抑制活性。化合物27m也可作為膦胺霉素類mtDXR抑制劑的先導(dǎo)化合物，進(jìn)行進(jìn)一步的評價和研究。

圖9 膦胺霉素衍生物的分子結(jié)構(gòu)示意圖

表4 新設(shè)計膦胺霉素衍生物的結(jié)構(gòu)和預(yù)測活性

3 結(jié)論

結(jié)核病作為一種威脅著人類健康的全球性傳染病，隨著細(xì)菌耐藥性的增加亟需新的治療策略。本研究以結(jié)核分枝桿菌1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(mtDXR)為抗菌靶點(diǎn)，收集了35個對其有抑制活性的膦胺霉素類小分子化合物，利用它們建立了3D-QSAR模型，分析了小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)和其生物活性之間的定量構(gòu)效關(guān)系，結(jié)合CoMFA和CoMSIA模型的立體場、靜電場和氫鍵受體場等勢圖，確定了膦胺霉素類小分子骨架上兩大部位基團(tuán)的改造策略，即異羥肟酸部分取代苯環(huán)的間位和對位上引入大體積且負(fù)電性的基團(tuán)，以及Cα部位的二氯苯環(huán)取代基處引入電負(fù)性較大的氫鍵受體。同時，利用已知的靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)以及分子對接技術(shù)，揭示了小分子抑制劑和靶點(diǎn)蛋白活性位點(diǎn)的結(jié)合模式，并分析了小分子抑制劑和關(guān)鍵氨基酸殘基之間的氫鍵作用、疏水作用以及金屬螯合作用等，從分子層面驗(yàn)證了3D-QSAR的基團(tuán)改造策略，并且提供了更深層次的指導(dǎo)和參考。最后，依據(jù)上述思路設(shè)計出了14個新型膦胺霉素類小分子化合物，對它們進(jìn)行了分子對接打分和活性預(yù)測，得到了擁有更高對接分?jǐn)?shù)和預(yù)測活性的膦胺霉素類小分子化合物27 m，可供作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行進(jìn)一步的研究，而本文的研究也為后續(xù)的mtDXR小分子抑制劑的合理設(shè)計提供了可靠的理論基礎(chǔ)。