尚小飛， 李秀惠

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合中心， 北京 100069； 2 北京市肝病研究所， 北京 100069

肝纖維化是由病毒性肝炎、酒精中毒、非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝炎和膽汁淤積性肝病等多種病因?qū)е碌穆愿闻K疾病的共同病理過程[1]，其實質(zhì)是由上述病因誘導(dǎo)肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞等過度分泌細(xì)胞因子、活性氧、趨化因子和生長因子，進(jìn)而刺激肝星狀細(xì)胞(HSC)，促進(jìn)其增殖、合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，使其積累形成纖維瘢痕，從而取代受損的正常組織，導(dǎo)致肝臟組織結(jié)構(gòu)異常改變，最終形成肝纖維化[2-5]。據(jù)統(tǒng)計，全球每年超過120萬人死于肝纖維化導(dǎo)致的終末期肝病[3-4]。

研究表明，肝纖維化是一個可逆的過程，早期接受有效的抗肝纖維化治療可防止或減緩其進(jìn)展為肝硬化甚至肝癌。目前，針對肝炎病毒等病因治療雖部分獲得抗肝纖維化療效，但還未見抗肝纖維化的西藥上市[1]。近年來，國內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)中藥有著多靶點的綜合作用，在抑制肝纖維化進(jìn)展和促進(jìn)肝纖維化逆轉(zhuǎn)方面有著獨特的優(yōu)勢和療效，如扶正化瘀膠囊、復(fù)方鱉甲軟肝片和安絡(luò)化纖丸等[1,6]。同時，從中藥中發(fā)現(xiàn)具有良好抗肝纖維化活性的天然產(chǎn)物也已成為藥物發(fā)現(xiàn)和新藥創(chuàng)制的重要途徑。

為更加明確中藥抗肝纖維化的實驗研究現(xiàn)狀，本文通過中藥抗肝纖維化實驗動物模型、中藥抗肝纖維化作用機理、從動物實驗到臨床試驗的中藥研究三方面系統(tǒng)闡述其實驗研究進(jìn)展，以期促進(jìn)抗肝纖維化中藥的研發(fā)。

1 中藥抗肝纖維化動物實驗?zāi)Ｐ?/h2>

實驗動物模型因為能夠制備出與人類疾病相似的發(fā)病機制或發(fā)病過程，具有可復(fù)制性、操作方便等特點，是研究藥物生物活性及其作用機理必不可少的工具[7]。常用的肝纖維化模型誘導(dǎo)方法有化學(xué)法(肝毒素誘導(dǎo)的肝纖維化模型)、遺傳修飾法、飲食法(非酒精性脂肪肝相關(guān)的肝纖維模型)、手術(shù)(膽道纖維化模型)和病毒感染等(表1)，其中化學(xué)法最為常用，病毒感染法不夠成熟且在中藥抗肝纖維化研究中未見應(yīng)用。

表1 肝毒素、非酒精性脂肪肝炎和膽道纖維化的肝纖維化模型誘導(dǎo)方法及特點[8]

1.1 肝毒素誘導(dǎo)的肝纖維化模型 肝毒性誘發(fā)的肝纖維化模型常用來模擬慢性病毒感染、酒精和代謝綜合征等導(dǎo)致的人類肝纖維化[5]。根據(jù)研究目的不同，CCl4、TAA、DMN/DEN、酒精等化學(xué)試劑(肝毒素)常被用作肝毒素誘導(dǎo)肝纖維化模型。

CCl4可造成嚙齒類動物的肝細(xì)胞壞死、Kupffer細(xì)胞活化，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)并激活HSC，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。由于其價格低廉、重復(fù)性高，能部分反映人類慢性肝病的病理變化和中藥治療時多靶標(biāo)、多通路的作用方式，是目前應(yīng)用最廣泛的肝纖維化造模方法[1]。本課題組前期就采用CCl4誘導(dǎo)肝纖維化模型，研究了軟肝顆粒的抗肝纖維化活性及作用機理[9]。

TAA、DMN/DEN均為肝毒性物質(zhì)，其通過激活細(xì)胞色素P450代謝，引起脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而破壞細(xì)胞通透性，導(dǎo)致肝小葉中心壞死和HSC活化，產(chǎn)生肝纖維化。目前，TAA誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型的實驗方法較為標(biāo)準(zhǔn)，即腹腔注射150 mg·kg-1·次-1，3次/周，誘導(dǎo)周期為8～12周。Yi等[10]利用TAA造模系統(tǒng)闡述了小檗堿通過誘導(dǎo)亞鐵氧化還原活性減輕肝纖維化的作用機理。在此基礎(chǔ)上，Ding等[11]已建立了DMN/DEN誘導(dǎo)大鼠肝炎-肝纖維化-肝癌模型。

過多的酒精攝入可導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生和富集，脂質(zhì)過氧化和膠原合成增加，引起酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)而產(chǎn)生肝纖維化病變。因此，酒精常被用于模擬酒精中毒引起的肝纖維化，但由于酒精造成的酒精性肝病與人類嚴(yán)重酒精性肝病存在較大差異，單獨使用酒精造模較少。為此，很多學(xué)者[5]都是將酒精與CCl4或TAA連用誘導(dǎo)肝纖維化模型，開展中藥抗肝纖維化活性及其機理的研究。

1.2 非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相關(guān)的肝纖維化模型 肥胖和肥胖相關(guān)疾病，如糖尿病和NASH，在全球范圍內(nèi)的流行率和發(fā)病率逐年上升。在美國，約有6000萬～8000萬人有非酒精性脂肪肝，其中約20%的患者將進(jìn)展為NASH[12]。研究表明，NASH的病理變化伴隨著肝纖維化、肝硬化以及肝衰竭和肝癌的產(chǎn)生。為更好的模擬人類NASH病理特征、發(fā)現(xiàn)具有良好抗NASH的中藥及其活性成分，HFHCD、MCD常用來誘導(dǎo)NASH相關(guān)的肝纖維化模型。

HFHCD誘導(dǎo)模型：該模型主要通過食用高脂高膽固醇飲食來模擬由于人類不良生活習(xí)慣導(dǎo)致的NASH及肝纖維化，其具有與人類NASH相似的表型特征，適用于高脂類肝纖維化的病理機制和藥物篩選。Liu等[13]研究顯示健脾清肝飲能顯著緩解高脂飲食導(dǎo)致的非酒精性脂肪肝，減輕肝纖維化。但此類方式需要較長的造模時間，缺乏肥胖和胰島素抵抗。

MCD誘導(dǎo)模型：MCD常用來誘導(dǎo)NASH相關(guān)的肝纖維化模型。喂食MCD飼料8周后小鼠會出現(xiàn)脂肪性肝炎，繼續(xù)喂養(yǎng)更長時間則可以導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。但此模型與HFHCD不同，缺乏一些人類患者的主要病理特征，需要和基因修飾小鼠結(jié)合才能更完美的模擬肝纖維化特征[6]。

目前，遺傳修飾的小鼠也常用來誘導(dǎo)肝纖維化模型。如foz/foz、db/db和ob/ob小鼠模型，其中，foz/foz小鼠具有一個突變的Alms1基因，采用高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng)會出現(xiàn)脂肪限制，使得膽固醇水平升高，導(dǎo)致脂肪炎癥、肝細(xì)胞損傷，繼而向更嚴(yán)重的纖維化發(fā)展；而db/db小鼠是瘦素受體點突變導(dǎo)致瘦素信號通路障礙，高脂肪喂養(yǎng)則導(dǎo)致明顯的肥胖和脂肪性病變，這類模型能夠部分模仿人類的代謝綜合征及肝纖維化。但單獨的遺傳修飾不會自發(fā)形成NASH和肝纖維化，均依賴于高脂飲食和基因修飾的相互作用[5]。

1.3 膽道纖維化模型 膽汁淤積性肝病是由不同程度的膽汁分泌受損引起的，與本病相關(guān)的組織病理學(xué)改變包括門靜脈周圍炎癥、膽管增生和膽汁性肝纖維化。為了研究膽汁淤積性肝病的進(jìn)展和發(fā)現(xiàn)新的藥物，目前已建立了許多成熟的膽道纖維化模型，其中，BDL是最常見的模型[8]。Liu等[14]成功建立了BDL誘導(dǎo)的肝纖維化模型，并揭示了六味五靈片抗肝纖維化活性。但此類模型的誘導(dǎo)技術(shù)難度較大，實驗動物病死率較高。同時，通過DDC飲食、CDE和ANIT飲食可以誘導(dǎo)膽道纖維化和導(dǎo)管反應(yīng)。人類MDR3的小鼠同源Mdr2等基因的缺失，也可導(dǎo)致自發(fā)性膽道纖維化[8]。

迄今為止，上述實驗動物模型僅能部分模擬人類肝纖維化病理特征，多個模型的交叉或聯(lián)合誘導(dǎo)已成為必不可少的研究途徑。

2 中藥抗肝纖維化作用機理研究

2.1 中藥抗肝纖維化作用的主要信號通路

中藥發(fā)揮抗肝纖維化活性主要通過以下方式：(1)抑制HSC增殖活化，促進(jìn)活化的HSC凋亡；(2)減少肝細(xì)胞損傷，降低炎癥因子水平，減輕肝臟炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)；(3)抑制ECM的合成、降解，降低肝組織膠原纖維水平；(4)降低肝竇阻力，抑制肝竇毛細(xì)血管化，調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答等多種方式[5,15]，具有“多成分-多靶點-多途徑”的作用方式，其抗肝纖維化作用涉及多個信號通路[16-17]。

2.1.1 轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)介導(dǎo)的信號通路 作為誘導(dǎo)纖維化反應(yīng)的基本細(xì)胞因子，TGFβ介導(dǎo)的信號通路是誘導(dǎo)HSC活化和纖維化的最重要途徑之一?；罨腡GFβ結(jié)合并激活TGFβⅡ型受體，隨后TGFαⅠ型受體被激活進(jìn)而磷酸化Smad2/3轉(zhuǎn)錄因子。磷酸化的Smad2/3和Smad4二倍體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并與靶基因中的Smad結(jié)合元件結(jié)合，以啟動細(xì)胞核膠原基因轉(zhuǎn)錄中的HSC活化及Ⅰ型和Ⅲ型膠原的生成，從而導(dǎo)致ECM沉積和肝纖維化[18-19]。TGFβ1/Smad2/3信號通路被認(rèn)為是較為經(jīng)典的中藥抗肝纖維化作用通路。

Liu等[14]研究發(fā)現(xiàn)六味五靈片通過調(diào)節(jié)NF-κB依賴的炎癥反應(yīng)、抑制HSC激活和TGFβ/Smad介導(dǎo)的I型膠原合成，進(jìn)而減輕BDL誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化。2020年，Chen等[20]研究顯示，百合烏藥湯可調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-2/9/12 (MMP-2/9/12)的表達(dá)進(jìn)而減少ECM產(chǎn)生，抑制TGFβ1/Smad2/3信號通路及肝臟炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷和纖維化，并呈現(xiàn)劑量依賴性。茵陳蒿湯可顯著調(diào)節(jié)TGFβ1/Smad/ERK信號通路，進(jìn)而抑制HSC激活及肝臟氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化[21]。另外，安絡(luò)化纖丸也能通過抑制TGFβ1/Smads信號通路，進(jìn)而增強MMP-13表達(dá)、抑制MMP-2和TIMP-1/2表達(dá)，發(fā)揮其抗纖維化作用[22]。

除中藥復(fù)方外，很多中藥提取物或活性化合物也可通過抑制TGFβ/Smad信號通路緩解肝毒素誘導(dǎo)的肝纖維化，如酸漿苦味D[23]、女貞苷[24]、貫葉連翹水提取物[25]和鉤腺大戟二萜類化合物[26]等。同時，其還可作用于TGFβ介導(dǎo)的非經(jīng)典信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)[27]、哺乳動物雷帕霉素靶點(mTOR)、PI3K/Akt[28]、JAK1/STAT3等。以上經(jīng)典及非經(jīng)典的信號通路均有助于HSC活化和巨噬細(xì)胞活化及極化。

2.1.2 血小板衍生生長因子(PDGF)介導(dǎo)的信號通路 PDGF是促進(jìn)HSC分裂和增殖的關(guān)鍵生長因子，其受體(PDGFR)在HSC膜上表達(dá)并通過自分泌機制刺激HSC活化。PDGFR的激活可以引起Ras/Raf、 PI3K/Akt、STAT等信號通路的級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)促纖維化基因COL1A1、TIMP和MMP表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡[15]。

研究[29]表明，扶正化瘀抗纖方高劑量組可顯著降低肝纖維化大鼠肝組織中TGFβ1和PDGF表達(dá)，減輕肝損傷及纖維化程度。強肝膠囊可能通過下調(diào)TGFβ1/Smads信號通路和PDGF-BB表達(dá)，從而抑制HSC激活和增殖，顯著緩解CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化[30]。而李劍波[31]對延胡素提取物抗肝纖維化活性的研究表明，其能顯著改善肝纖維化大鼠肝組織的病理狀態(tài)，隨治療時間延長，匯管區(qū)受損肝細(xì)胞胞漿和包膜上有PDGF-BB和TGFβ1表達(dá)明顯減弱，提示其抗肝纖維化作用可能是通過激活PDGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)。臨床試驗[32]表明，丹紅軟肝顆粒治療6個月后可顯著降低患者肝纖維化指標(biāo)，改善肝功能，研究者認(rèn)為其可能通過抑制PDGF的分泌來抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。同時，二氫青蒿素等單體化合物也可通過調(diào)節(jié)PDGF-βR/ERK等信號通路發(fā)揮其作用[33]。

2.1.3 Wnt/β-Catenin信號通路 當(dāng)肝臟受到損傷，Wnt/β-Catenin信號通路會被激活從而導(dǎo)致HSC非正常分化進(jìn)而誘導(dǎo)肝纖維化[15]。研究[34]發(fā)現(xiàn)，舒肝和絡(luò)醒脾方能夠顯著降低CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠肝臟組織中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)而認(rèn)為Wnt/β-Catenin通路可能為其抗肝纖維化的信號途徑。膈下逐瘀湯可顯著降低肝纖維化大鼠血清ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平(P<0.01)，肝組織Wnt-1、β-catenin、p-GSK-3β/GSK-3β 蛋白表達(dá)降低，其機制可能與抑制Wnt/β-catenin通路活化相關(guān)[35]。北京中醫(yī)藥大學(xué)周怡馳[36]研究表明，柴芪益肝方能顯著減輕CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號通路，通過調(diào)節(jié)TGFβ/Smad、Wnt3a/β-catenin等信號通路抑制HSC的活化，減少ECM合成。水飛薊賓膠囊可抑制慢性HBV感染者的肝纖維化，減輕氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)，阻斷HBV DNA復(fù)制，促進(jìn)肝功能恢復(fù)，其機制也可能與調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)[37]。

2.1.4 Hedgehog及其他信號通路 Hedgehog信號通路在胚胎發(fā)育中起著重要作用，當(dāng)肝臟受損時，肝細(xì)胞產(chǎn)生并釋放Sonic Hedgehog并向鄰近細(xì)胞提供旁分泌纖維化信號，以增加HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的機會，持續(xù)刺激Hedgehog信號通路導(dǎo)致大量肌成纖維細(xì)胞聚集促進(jìn)肝纖維化的形成。因此，Hedgehog信號通路異常激活的抑制是治療肝纖維化的重要途徑之一。研究發(fā)現(xiàn)，多個中藥及其活性化合物通過抑制此信號通路發(fā)揮抗纖維化作用，比如鎖陽[38]、梔子黃素[39]等。另外，NF-κB信號通路、YAP信號通路和ACE-AngII-AT1R信號通路等也與中藥抗肝纖維化活性有關(guān)[15]。

2.2 中藥抗肝纖維化與細(xì)胞凋亡、焦亡 受損肝細(xì)胞、炎性細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞之間的互作導(dǎo)致了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，其中，受損肝細(xì)胞的凋亡觸發(fā)了這一系列病理事件，而活化的HSC則導(dǎo)致了ECM等的沉積和肝纖維化的產(chǎn)生[5]。因此，抑制肝細(xì)胞凋亡的同時誘導(dǎo)激活的HSC凋亡成為中藥抗肝纖維化的主要方式。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是誘導(dǎo)HSC凋亡的主要途徑之一[40]，而其凋亡離不開多種信號通路介導(dǎo)的調(diào)節(jié)，以及可溶性生長因子和細(xì)胞因子、纖維基質(zhì)成分和死亡受體等刺激。研究[41]表明，茵陳蒿湯可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路，抑制酒精性肝纖維化大鼠HSC增殖，促進(jìn)HSC凋亡，進(jìn)而緩解大鼠的酒精性肝纖維化。益氣活血方通過下調(diào)凋亡相關(guān)基因FasL、Fas、Caspase-3、Bax及其蛋白表達(dá)、上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制肝細(xì)胞凋亡發(fā)揮其抗炎抗肝纖維化作用[42]。大黃蟄蟲丸通過抑制肝細(xì)胞凋亡來改善大鼠肝纖維化程度[43]。

山芝麻酸甲酯等活性單體化合物也被證明可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮其抗肝纖維化活性。其中，山芝麻酸甲酯通過顯著上調(diào)JNK表達(dá)、抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路進(jìn)而導(dǎo)致其凋亡，發(fā)揮其抗肝纖維化作用[44]；咖啡因則通過上調(diào)IER1-ɑ表達(dá)進(jìn)而激活HSC自噬和凋亡[45]；薯蕷皂苷通過調(diào)節(jié)TGFβ1/Smad、Wnt/β聯(lián)蛋白、促分裂原活化的蛋白激酶以及線粒體信號通路誘導(dǎo)HSC凋亡，發(fā)揮抑制肝纖維化作用[46]；丹參酮Ⅱa通過誘導(dǎo)DNA斷裂、S期阻滯，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白A、E和依賴性激酶，從而促進(jìn)HSC凋亡，逆轉(zhuǎn)或阻滯肝纖維化發(fā)展[47]。

細(xì)胞焦亡是一種新型的促炎程序性細(xì)胞死亡，由細(xì)胞內(nèi)炎癥小體以及gasdermin蛋白家族成員GSDMD介導(dǎo)發(fā)生，包括經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑，依賴于Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11介導(dǎo)，其中以NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的依賴于Caspase-1經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑研究最為深入。研究[48]表明，細(xì)胞發(fā)生焦亡后可釋放大量的促炎癥細(xì)胞因子，促進(jìn)靜止型HSC向活化型HSC改變，促進(jìn)肝纖維化發(fā)展，在肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。但與此同時，抑制細(xì)胞焦亡時可能會下調(diào)自身免疫力，增加感染風(fēng)險和不良反應(yīng)。因此，需要精準(zhǔn)、適度地調(diào)控細(xì)胞焦亡，以達(dá)到緩解肝臟炎癥和纖維化的目的。

謝澤宇等[49]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，合歡皮-白蒺藜藥含藥血清能夠降低HSC-LX2的增殖率以及活性氧、IL-18和IL-1β含量(P<0.05)，抑制NLRP3、Caspase-1、α-SMA及GSDMD蛋白和基因的表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞焦亡，參與其抗肝纖維化作用。三葉香茶菜通過下調(diào)NLRP3/Caspase-1/GSDMD信號通路的活化，進(jìn)而減少肝組織慢性炎癥損傷，發(fā)揮其抗肝纖維化作用[50]。而柴胡皂苷D等能減少免疫性肝纖維化大鼠血清中炎性因子釋放、減輕肝臟細(xì)胞損傷，下調(diào)NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、TLR4和Myd88蛋白水平，抑制p65磷酸化，通過調(diào)控TLR4/NF-κB和NLRP3炎癥小體信號通路發(fā)揮抗纖維化作用[51]。

2.3 中藥抗肝纖維化與自噬 自噬是一種降解細(xì)胞內(nèi)長壽蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器維持細(xì)胞內(nèi)平衡的代謝過程，對于保護(hù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞器的更新具有重要作用[52]。研究表明，自噬的激活主要通過靶向抑制mTOR來實現(xiàn)。在肝細(xì)胞中，自噬主要作為一種保護(hù)機制，自噬的減少會促進(jìn)肝細(xì)胞炎癥，而在HSC中，自噬可刺激其活化及增殖?？紤]到抑制自噬能減少HBV或HCV復(fù)制，自噬的調(diào)節(jié)是控制或預(yù)防肝纖維化進(jìn)展的重要策略之一[53]。

鑒于自噬是把雙刃劍，中藥通過抑制或激活自噬均可能達(dá)到抗肝纖維化的作用。研究[54]顯示，扶正化瘀方及其活性成分丹酚酸B可通過抑制自噬緩解CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。王寶玉[55]研究顯示，其自擬益氣健脾方和扶正化瘀復(fù)方可通過減少自噬相關(guān)基因Atg7合成和LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，進(jìn)而減少自噬體形成及其與溶酶體的結(jié)合，抑制HSC激活，減少ECM沉積，以達(dá)到抗肝纖維化效果。Zhang等[56]研究顯示，片仔癀通過抑制HSC自噬發(fā)揮其抗肝纖維化作用。本課題組對軟肝顆?？垢卫w維化作用機制研究顯示，其能通過抑制PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬途徑緩解肝纖維化大鼠的炎癥反應(yīng)，減輕肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)并促進(jìn)活化的HSC凋亡[9]。人參皂苷Rh2[57]、槲皮素、異鼠李素等中藥活性單體通過抑制TGFβ1/Smads信號通路和激活PI3K/Akt信號通路抑制HSC自噬，減少其活化，從而達(dá)到抗肝纖維化效果；小檗堿[58]可通過調(diào)控NF-κB信號通路來抑制HSC活化，下調(diào)自噬相關(guān)基因Atg5來抑制HSC自噬。

而姜黃素通過調(diào)節(jié)AMPK/PI3K/AKT/mTOR信號通路提高肝細(xì)胞自噬水平，減少肝臟中活化HSC的數(shù)量，阻斷促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激等，進(jìn)而抑制纖維化[59]。千層紙素A[60]、莪術(shù)醇等也可激活自噬發(fā)揮其抗肝纖維化作用。這可能是當(dāng)肝纖維化開始出現(xiàn)時，HSC會發(fā)生自噬，而藥物則可誘發(fā)HSC過度自噬，促進(jìn)其凋亡，從而抑制肝纖維化。

2.4 中藥抗肝纖維化與腸道菌群 由于“肝-腸軸”的存在，肝臟內(nèi)異常的代謝反應(yīng)可以造成腸道微生態(tài)破壞，紊亂的腸道功能也可加速肝纖維化進(jìn)展[61]。因此，通過對腸道菌群的研究進(jìn)而探究肝纖維化的發(fā)生發(fā)展機制，對于揭示中藥抗肝纖維化作用機理具有一定意義。

研究表明，軟肝沖劑[62]、肝爽顆粒[63]等多個中藥制劑及熊果酸[64]均可干預(yù)肝纖維化實驗動物的腸道菌群的豐富度和多樣性，表現(xiàn)為α多樣性明顯升高，β多樣性顯示明顯組間差異，微生物群物種組成明顯改變，門水平表現(xiàn)為擬桿菌門增多和變形桿菌門減少，屬水平表現(xiàn)為阿克曼氏菌屬、螺旋菌屬、擬桿菌屬等減少和乳桿菌屬、副桿菌屬等增多。

徐俊等[65]采用臨床回顧性研究方法，探討了抗纖軟肝顆粒對慢性乙型肝炎肝纖維化患者肝硬度值及腸道菌群的影響。結(jié)果表明，與對照組患者相比，治療組(抗纖軟肝顆粒+恩替卡韋)對患者腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用，OTU數(shù)量明顯增加，Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)顯著增高(P<0.05); 且患者在門水平上擬桿菌門豐度升高，變形菌門、梭桿菌門豐度顯著降低(P<0.05); 而在屬水平上，雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、毛螺菌屬豐度明顯升高，埃希菌屬、韋榮球菌屬、梭桿菌屬豐度顯著降低。

2.5 中藥抗肝纖維化作用機理研究主要技術(shù)方法 近幾年，伴隨著實驗技術(shù)的日益革新，各種先進(jìn)的研究理念、方法和平臺被用于中藥抗肝纖維化作用機理研究，許多新的作用機理和靶標(biāo)被揭示[67-68]。其中，組學(xué)(包括蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)、代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)等)的廣泛應(yīng)用使研究者能從總體層面了解中藥多靶標(biāo)、多通路的抗肝纖維化作用機理，但如何將以上組學(xué)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析？如何從海量組學(xué)數(shù)據(jù)中提取理想的實驗數(shù)據(jù)并加以驗證成為阻礙其應(yīng)用的關(guān)鍵問題。近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥作用機理的研究中呈幾何數(shù)的應(yīng)用，其能夠基于系統(tǒng)生物學(xué)方法利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)開展中藥及其活性成分抗肝纖維化等作用機理的預(yù)測，對于中藥“多成分-多靶點-多途徑”的作用特點研究具有一定作用，且避免了大量的動物和細(xì)胞實驗；但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究是基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)，研究越多的化合物被引用的也越多，反之則一樣，使得不同中藥、不同實驗的研究結(jié)果較為趨同，如多個研究結(jié)果均揭示了槲皮素、山奈酚等是其活性成分并擁有不同的生物活性，很難得出創(chuàng)新性的論點和論據(jù)。相比于復(fù)雜的中藥成分及作用機理，活性單體的靶標(biāo)及作用機制研究手段較為豐富，如化學(xué)蛋白組學(xué)、表面等離子共振技術(shù)、基于CRISPR-Cas9的基因編輯技術(shù)等。

3 從動物實驗到臨床試驗

雖然我國肝纖維化患者的主要病因是病毒性肝炎，但迄今為止，尚無成熟的病毒感染的動物模型，針對病毒引起肝纖維化環(huán)節(jié)的實驗研究也較少。同時，由于傳統(tǒng)的纖維化單細(xì)胞培養(yǎng)或兩三個細(xì)胞的共培養(yǎng)模型不能再現(xiàn)多細(xì)胞和多向性人類纖維化的演變，加之動物自愈較人類明顯，很多動物模型肝纖維化僅能部分反映人類肝纖維化的病理特征。因此，通過初步的動物和細(xì)胞實驗并不能完全闡明中藥抗肝纖維化活性，揭示其多成分、多靶標(biāo)、多通路的抗肝纖維化作用方式。目前，新型3D體外模型包括多種實質(zhì)細(xì)胞和非實質(zhì)細(xì)胞類型以及纖維化驅(qū)動纖維化ECM本身越來越成熟，對于完善肝纖維化的病理生理學(xué)、細(xì)胞和動物模型等具有重要作用，有望促進(jìn)抗肝纖維化中藥的研發(fā)。

當(dāng)前，很多中藥及其活性成分在臨床前研究中均表現(xiàn)出較好的活性，但在臨床試驗及其后續(xù)開發(fā)中其抗肝纖維化結(jié)果往往不盡如人意，這可能受多種影響。第一，很多藥物的臨床前研究是在單一動物或細(xì)胞模型上進(jìn)行，并不能完全模擬人體肝纖維化病理特征，其藥物活性還需進(jìn)一步研究和確證；第二，目前臨床上仍缺乏特效抗肝纖維化藥物，致使在動物、細(xì)胞和臨床試驗中均無對照藥物(除針對病因的治療藥物)，使得中藥抗肝纖維化研究缺乏統(tǒng)一和明確的療效標(biāo)準(zhǔn)；第三，肝纖維化病程長，臨床觀察常存在脫落率高、依從性差等問題，故研究質(zhì)量難以控制；而且，如果在臨床實驗中完全照搬西醫(yī)隨機對照實驗規(guī)范，缺乏對中醫(yī)病機和患者證候?qū)W特點認(rèn)識，不能準(zhǔn)確反應(yīng)中藥對肝纖維化的治療特點。

為此，在臨床前研究中，亟需加強對中藥及其主要活性成分的體內(nèi)代謝特征及分布研究，采用多個肝纖維化模型(動物和細(xì)胞)交叉驗證了解其活性和作用機制。在臨床實驗中，中醫(yī)認(rèn)為肝纖維化的基本病機為虛瘀互結(jié)阻絡(luò)，受病因、患者體質(zhì)、疾病階段等不同因素影響，又有肝膽濕熱、肝郁脾虛、肝腎陰虛等不同證候表現(xiàn)。如扶正化瘀主要針對肝腎不足、瘀血內(nèi)阻證患者；而肝爽顆粒主要針對肝郁脾虛夾濕熱血瘀證。因此，中成藥抗纖治療的基礎(chǔ)是辨證論治，而中醫(yī)證型應(yīng)作為臨床研究設(shè)計的主要標(biāo)準(zhǔn)之一，中醫(yī)證候亦應(yīng)作為評估臨床療效的結(jié)局指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上開展設(shè)計嚴(yán)謹(jǐn)、多中心、大樣本、高質(zhì)量的隨機對照試驗或真實世界研究，才能準(zhǔn)確了解中藥抗肝纖維化的臨床療效。

4 結(jié)論

肝纖維化是慢性肝病發(fā)展成肝癌三部曲中的必經(jīng)之路，中藥在抑制肝纖維化進(jìn)展和促進(jìn)肝纖維化逆轉(zhuǎn)方面有著獨特的優(yōu)勢和療效，發(fā)揮著重要的作用。目前，中藥抗肝纖維化的實驗研究取得了較大的研究進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)許多具有良好抗肝纖維化作用的中藥復(fù)方和單味藥及其有效成分，并從細(xì)胞、分子水平等方面揭示了其潛在的作用機制。但中藥抗肝纖維化的理論創(chuàng)新仍然不足，符合中醫(yī)“證”本質(zhì)的動物模型和中藥實驗方法仍然缺乏，如何縮短從動物實驗到臨床試驗?zāi)酥林兴幧鲜械臅r間問題等仍需不斷努力。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：尚小飛參與起草文章，組織語言，整理參考文獻(xiàn)等；李秀惠提出文章思路，并對文章進(jìn)行修改。