陳秋岑, 孫治中, , 吳偉, , 黃龐寧, 吳輝,

心血管疾病是全球致死率最高的疾病, 隨著我國人口老齡化加劇, 生活方式的改變, 我國心血管疾病的發(fā)生率逐年升高, 心血管疾病的最主要病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化[1］。動(dòng)脈粥樣硬化是一種主要發(fā)生在中大動(dòng)脈的慢性炎癥, 在內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)浸潤、平滑肌增殖遷移等因素的共同作用下形成粥樣斑塊, 斑塊的不斷進(jìn)展增大導(dǎo)致的動(dòng)脈管腔狹窄或由于斑塊不穩(wěn)定破裂引起的動(dòng)脈血流中斷, 是心血管疾病的主要原因。目前針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療主要是使用他汀類的藥物降脂穩(wěn)斑, 以及抗血栓治療。中醫(yī)藥治療動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的心血管疾病具有良好的療效良好且毒副作用更小, 在臨床應(yīng)用日益廣泛。清熱活血方是廣東省名中醫(yī)吳偉教授, 在陳可冀院士創(chuàng)立的冠心病2號(hào)方（川芎、赤芍、降香、紅花、丹參）的基礎(chǔ)上, 結(jié)合嶺南地區(qū)氣候濕熱, 心血管病人病機(jī)多為熱毒血瘀的基礎(chǔ)上加上黃芩、毛冬青所創(chuàng)。研究表明清熱活血方對(duì)于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的多種分型具有良好的臨床效果[2-3］。相較于傳統(tǒng)基礎(chǔ)研究, 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這種“多成分-多靶點(diǎn)”的研究模式更適合于探究中醫(yī)藥治療疾病機(jī)制。本研究于2020年12月至2021年2月擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法, 探究清熱活血方治療動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 清熱活血方成分及靶點(diǎn)搜集在BAT-MAN數(shù)據(jù)庫的中藥模塊對(duì)清熱活血方中7味中藥分別進(jìn)行檢索, 獲取中藥的活性成分。并使用網(wǎng)站內(nèi)置分子匹配系統(tǒng), 設(shè)置（P＜0.05, score＞20）作為匹配篩選條件, 獲取活性成分對(duì)應(yīng)的預(yù)測(cè)靶點(diǎn), 并使用Excel2019進(jìn)行匯總整理。

1.2 粥樣硬化靶點(diǎn)搜集并篩選核心節(jié)點(diǎn)使用“atherosclerosis”作為檢索詞, 在Gencards數(shù)據(jù)庫中查找與動(dòng)脈粥硬化相關(guān)的靶點(diǎn), 并使用Excel進(jìn)行整理, 作為動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 藥物疾病共同靶點(diǎn)及核心節(jié)點(diǎn)的篩選使用Excel數(shù)據(jù)分析中重復(fù)值標(biāo)記功能, 將清熱活血方的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)靶點(diǎn)在去除重復(fù)值后取交集進(jìn)行標(biāo)記, 即得到清熱活血方治療動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)靶點(diǎn)。將這些靶點(diǎn)導(dǎo)入string數(shù)據(jù)庫, 選擇物種為“人”, 獲取這些靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系, 并以Excel的格式導(dǎo)出。使用Cytoscape 6.1軟件打開, 得到靶點(diǎn)之間相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò), 然后使用軟件內(nèi)置數(shù)據(jù)分析功能, 計(jì)算出網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)值, 使用連接度（degree）的2倍中位數(shù)作為條件, 選擇出大于2倍中位數(shù)的點(diǎn)作為核心節(jié)點(diǎn)。并構(gòu)建核心節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖使用核心靶點(diǎn)在清熱活血方成分靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)Excel中反向找出對(duì)應(yīng)的成分, 將對(duì)應(yīng)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 6.1, 構(gòu)建清熱活血方治療動(dòng)脈粥樣硬化的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖, 并計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中活性成分的拓?fù)鋮?shù), 依據(jù)degree值選取主要的活性成分。

1.5 基因本體論（GO）與京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）富集分析使用DAVID網(wǎng)站對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析, 將原始分析數(shù)據(jù)導(dǎo)出。依據(jù)Omicshare要求的格式分別對(duì)GO分析的結(jié)果和KEGG的結(jié)果進(jìn)行整理。使用富集圈圖對(duì)GO富集結(jié)果進(jìn)一步分析并繪制富集圈圖。使用高級(jí)氣泡圖對(duì)KEGG富集結(jié)果進(jìn)一步分析繪制高級(jí)氣泡圖。

1.6 分子對(duì)接選degree值排名前五的核心靶點(diǎn)與degree排名前10的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。首先在PDB數(shù)據(jù)庫中查詢靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)并保存。運(yùn)用Auto Dock Vina對(duì)活性成分和靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接, 逐一記錄結(jié)合能。使用Grahpad對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行處理分析繪制熱圖, 并選取出結(jié)合能最高的兩組進(jìn)行分子對(duì)接三維結(jié)構(gòu)展示。

2 結(jié)果

2.1 清熱活血方成分靶點(diǎn)的搜集經(jīng)過檢索清熱活血方7味中藥的活性成分結(jié)果如下：黃芩17個(gè), 毛冬青2個(gè), 川芎78個(gè), 丹參37個(gè), 紅花20個(gè), 赤芍3個(gè), 降香2個(gè)匯總排除重復(fù)值后, 共得到149個(gè)活性成分。對(duì)149個(gè)活性成分的靶點(diǎn)進(jìn)行搜集匯總, 排除重復(fù)值得到1 241個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

2.2 藥物疾病共同靶點(diǎn)及核心節(jié)點(diǎn)的篩選通過Genecards共檢索到與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的靶點(diǎn)4 683個(gè), 通過Excel與清熱活血方的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)取交集, 共得到614個(gè)清熱活血方治療動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的靶點(diǎn)。通過String數(shù)據(jù)庫獲取614個(gè)靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系, 然后導(dǎo)入Cytoscape 6.1進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析, 以大于degree值的2倍中位數(shù)篩選出116個(gè)核心靶點(diǎn), 依據(jù)degree值的大小設(shè)置靶點(diǎn)的面積和顏色, degree值越大點(diǎn)的面積越大顏色越深, 見圖1。主要的靶點(diǎn)包括蛋白激酶B1（Akt1）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、載脂蛋白E1（APOE1）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）。

圖1 清熱活血方治療動(dòng)脈粥樣硬化核心靶點(diǎn)蛋白作用關(guān)系圖

2.3 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖將116個(gè)核心點(diǎn)對(duì)應(yīng)的活性成分找出, 共得到107個(gè)對(duì)應(yīng)的活性成分, 將對(duì)應(yīng)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 6.1進(jìn)行成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。并選出degree值排名前十的成分列舉出二維結(jié)構(gòu), 與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系比較密切的活性成分是丹參酮Ⅱ、丹參醌B、γ-谷甾醇、丹參酚醌、咖啡酸二甲醚、黃芩苷、香葉烯、川芎內(nèi)酯、共軛亞油酸、鐵銹醇, 見圖2。

圖2 清熱活血方治療動(dòng)脈粥樣硬化連接度（degree）值排名前十個(gè)成分

2.4 GO富集分析依據(jù)DAVID對(duì)116個(gè)核心節(jié)點(diǎn)的GO富集結(jié)果, 根據(jù)富集基因數(shù)目作為篩選條件, 并排除無特異性的基本生物代謝過程, 選取前20條通路。其中BP包含7條：平滑肌細(xì)胞增殖的積極調(diào)節(jié)、趨化因子生物合成過程的積極調(diào)控、內(nèi)皮細(xì)胞增殖的積極調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、一氧化氮合酶活性的積極調(diào)節(jié)、脂肪細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)節(jié)、內(nèi)皮細(xì)胞遷移的積極調(diào)節(jié)；CC包含6條：蛋白質(zhì)復(fù)合物、溶酶體、細(xì)胞表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、內(nèi)吞囊泡腔、乳糜微粒；MF包含7條：細(xì)胞因子活性、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性、核因子κB（NF-κB）結(jié)合、載脂蛋白A-I受體結(jié)合、脂蛋白顆粒結(jié)合、載脂蛋白結(jié)合、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)體活性。見表1。整理格式后使用Omicshare繪制富集圈圖, 見圖3。

表1 GO富集分析通路名稱

圖3 清熱活血方治療動(dòng)脈粥樣硬化基因本體論（GO）富集分析圈圖

2.5 KEGG富集分析對(duì)核心節(jié)點(diǎn)的KEGG富集分析結(jié)果顯示共有117條通路, 經(jīng)過排除疾病、感染等無關(guān)通路后, 篩選后的通路共11條, 并使用Omicshare進(jìn)行高級(jí)氣泡圖繪制, 見圖4。清熱活血方治療動(dòng)脈粥樣硬化的主要通路為：TNF信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路、調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中的脂肪分解、PPAR信號(hào)通路。

圖4 清熱活血方治療動(dòng)脈粥樣硬化京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）富集高級(jí)氣泡圖

2.6 分子對(duì)接對(duì)degree值前5個(gè)核心靶點(diǎn)與degree值前10的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接, 來驗(yàn)證結(jié)論的可信度, 結(jié)果顯示, 超過-5 kcal/mol結(jié)合能的對(duì)接組合有35組, 表明整體結(jié)合情況良好, 見圖5。結(jié)果可信度較高, 其中結(jié)合能最高的是丹參酮Ⅱ和TGFβ1（-9.1 kcal/mol）與黃芩苷和TNF（-9.3 kcal/mol）, 見圖6。

圖5 清熱活血方治療動(dòng)脈粥樣硬化連接度（degree）值前5個(gè)核心靶點(diǎn)與degree值前10的活性成分的分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果

圖6 清熱活血方治療動(dòng)脈粥樣硬化結(jié)合能最高的兩組對(duì)接信息：6A為丹參酮Ⅱ和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）；6B為黃芩苷和腫瘤壞死因子（TNF）

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病發(fā)病的主要病理基礎(chǔ), 是現(xiàn)代臨床高發(fā)病、常見病。在中醫(yī)理論中并沒有確切對(duì)應(yīng)的病名, 近年來結(jié)合斑塊形成的病理發(fā)展過程, 中醫(yī)學(xué)者提出“脈癰”這一名詞來對(duì)應(yīng)動(dòng)脈粥樣硬化[4］, 主張動(dòng)脈粥樣硬化也是由于痰濁氣血瘀滯, 最終聚而化熱, 熱瘀肉腐而在脈上形成類似癰瘡的斑塊。吳偉教授依據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為, 由于嶺南地區(qū)多濕多熱的氣候特點(diǎn), 現(xiàn)代人飲食多肥甘厚味, 嶺南地區(qū)動(dòng)脈粥樣硬化的主要病因病機(jī)是熱毒血瘀, 基于冠心病的二號(hào)方加減出清熱活血方。方中黃芩、毛冬青清熱解毒, 丹參、川芎、紅花、降香行氣活血止痛, 赤芍清熱涼血, 全方共奏清熱解毒, 行氣活血之效。

基于成分分析結(jié)果, 清熱活血方治療動(dòng)脈粥樣硬化的主要成分是丹參酮Ⅱ、黃芩苷、川芎內(nèi)酯、亞油酸等。丹參酮Ⅱ作為丹參的主要提取物, 近年來, 其在動(dòng)脈粥樣硬化方面的有效性也不斷被證實(shí), 孫維梁等[5］通過26周的對(duì)照實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可以有效改善高脂飼養(yǎng)Apo E-/-小鼠的頸動(dòng)脈斑塊的進(jìn)展。研究表明丹參酮Ⅱ可以減低血漿纖維蛋白原及C反應(yīng)蛋白水平, 能保護(hù)血管內(nèi)皮, 減少內(nèi)皮的氧化應(yīng)激反應(yīng), 可以下調(diào)MAPK與NF-κB等炎癥通路表達(dá)[6-7］。黃芩苷對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用, 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芩苷可以有效降低NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性, 抑制血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（VE-cadherin）及其他κB表達(dá), 從而實(shí)現(xiàn)抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[8］；辛來運(yùn)等指出黃芩苷的保護(hù)機(jī)制還包括抑制巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞, 抑制平滑肌遷移, 同時(shí), 黃芩苷在纖溶系統(tǒng)調(diào)節(jié)方面也有積極作用[9］。川芎內(nèi)酯可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)、減少氧化應(yīng)激, 此外川芎內(nèi)酯還可以通過抑制TNF表達(dá)來發(fā)揮抗炎效應(yīng)[10］。共軛亞油酸可以改善體內(nèi)脂質(zhì)代謝水平, 降低膽固醇, 減少斑塊形成[11］。

核心靶點(diǎn)中主要有Akt、TNF、APOE1、IL6、TGFβ1、NOS等。TGF-β1是重要的免疫調(diào)節(jié)因子之一, 可以抑制炎癥反應(yīng), 來抑制粥樣硬化的發(fā)生[12］。Akt的激活會(huì)參與內(nèi)皮細(xì)胞的破壞、炎癥反應(yīng)[13］。TNF是一種重要的炎性因子, 研究表明TNF可以損傷內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)炎癥細(xì)胞的聚集、激活炎癥細(xì)胞釋放更多細(xì)胞因子, 在動(dòng)脈粥樣硬化炎癥過程中發(fā)揮著重要作用[14-16］。APOE1是高密度脂蛋白的主要成員占比超過70%, 是將低密度脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟的主要載體, 對(duì)于抑制斑塊的形成起著十分關(guān)鍵的作用[17］。IL-6是一種多種炎癥細(xì)胞均可以分泌的細(xì)胞因子, IL-6除可以加劇斑塊局部的炎癥之外, 還有研究表明IL-6可以誘導(dǎo)平滑肌的增生與遷移, 并且可以促進(jìn)金屬蛋白酶的釋放導(dǎo)致斑塊轉(zhuǎn)變?yōu)椴环€(wěn)定斑塊[18］。NOS磷酸化后會(huì)產(chǎn)生NO, NO是體內(nèi)最強(qiáng)的血管擴(kuò)張劑, 同時(shí)NO可以抑制炎癥反應(yīng), 并能抑制平滑肌增生[19］。

前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過丹參多酚酸鹽干預(yù)治療動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠, 發(fā)現(xiàn)藥物治療組大鼠的TNFα、IL-6、P-selectin水平均下降, 信號(hào)通路TLR4、MyD88以及NF-κB的表達(dá)均減少, 同時(shí)還提出藥物的劑量可能與NF-κB的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)[20］。證實(shí)了丹參提取物可以明顯降低高脂大鼠TNF以及IL-6表達(dá)水平, 抑制炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定粥樣斑塊, 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病的有效治療。實(shí)驗(yàn)所使用的藥物, 與清熱活血湯的主要藥物成分丹參相一致, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果中TNF-α、IL-6同時(shí)也是清熱活血湯的主要作用靶點(diǎn)之一, 證實(shí)清熱活血湯在抗動(dòng)脈粥樣硬化方面的作用是真實(shí)有效的。

GO富集的結(jié)果中BP分析主要集中在內(nèi)皮細(xì)胞的增生與保護(hù), 抑制炎癥反應(yīng)與平滑肌增生, 同時(shí)調(diào)節(jié)了脂質(zhì)代謝過程；CC分析主要集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)蛋白合成的調(diào)節(jié), 溶酶體的合成等于細(xì)胞凋亡及κB合成相關(guān)的方面；MF分析的結(jié)果集中在脂質(zhì)代謝, NO的生成等。KEGG富集分析的通路包括炎癥相關(guān)通路、內(nèi)皮生成通路及脂質(zhì)代謝相關(guān)通路。其中Toll樣信號(hào)受體通路中的TRL4是激活NF-κB通路的重要因子, NF-κB是多種炎癥的激活因子[21］, 能激活TNF等相關(guān)通路, 引起內(nèi)皮功能破壞、炎癥細(xì)胞聚集加劇炎癥反應(yīng), 此外TRL4本身也能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)變[22］。TNF可以激活Jak-STAT 引發(fā)炎癥反應(yīng), 可以破壞內(nèi)皮功能, 引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[23-24］。MAPK通路是一種炎癥通路, 參與多個(gè)炎癥過程的發(fā)生, 還可以激活平滑肌細(xì)胞的增殖, 加劇動(dòng)脈粥樣硬化[25］。VEGF是血管生成的主要通路, 促進(jìn)內(nèi)皮的增殖修復(fù)。PPAR通路是促進(jìn)白色脂肪向棕色脂肪轉(zhuǎn)變的通路, 促進(jìn)脂肪的燃燒代謝, 從而檢索斑塊中脂肪積聚[26］。

綜上所述, 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的多成分-多靶點(diǎn)分析結(jié)果顯示, 清熱活血方抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖以及改善脂質(zhì)代謝與運(yùn)輸?shù)确矫娴墓餐饔?；結(jié)合清熱活血湯的現(xiàn)代臨床試驗(yàn)結(jié)果, 充分證明了清熱活血湯對(duì)治療動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的科學(xué)性和有效性。最后, 分子對(duì)接的結(jié)果提示, 本研究的結(jié)果可信度較好, 為今后開展相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)可以提供一定參考依據(jù)。