沙云菲, 熊駿威, 翟鈺霖, 王寶雷, 鐘志華, 費 婷, 李篤信*, 吳 達(dá)

(1. 上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心, 上海 200082; 2. 蘇州匯通色譜分離純化有限公司, 江蘇 蘇州 215123)

二維液相色譜(2D-LC)因其較高的峰容量,在復(fù)雜樣品的分析和鑒定中發(fā)揮了重要作用,商品化的分析型2D-LC儀器在天然產(chǎn)物、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)以及環(huán)境等領(lǐng)域獲得了日益廣泛的應(yīng)用[1,2]。對于復(fù)雜天然產(chǎn)物的分離純化,由于設(shè)備構(gòu)成復(fù)雜、樣品溶解度、兩維溶劑兼容性等問題的存在,制備型2D-LC發(fā)展緩慢[3]。

基于多位選擇閥和樣品環(huán)的接口是2D-LC的主要接口形式,Qiu等[4-6]構(gòu)建了多種制備型2D-LC系統(tǒng),包括反相、反相色譜(RPLC×RPLC)和正相、反相色譜(NPLC×RPLC)等組合模式;朱靖博等[7]以兩位八通閥和捕集柱陣列為接口構(gòu)建了反相-反相2D-LC系統(tǒng),用以純化木質(zhì)素;Zhang等[8]構(gòu)建了以兩位十通閥和定量環(huán)為接口的制備2D-LC系統(tǒng),以質(zhì)譜信號為導(dǎo)向進(jìn)行藥物雜質(zhì)的純化;Rezadoost等[9]構(gòu)建了兩位六通閥和樣品環(huán)的中心切割2D-LC系統(tǒng)用于純化紫杉醇;Marlot等[10]對由液液色譜(逆流色譜)構(gòu)建的制備2D-LC技術(shù)進(jìn)行了綜述,其中多位選擇閥是主要的接口類型。

常規(guī)制備型2D-LC由于切換閥和系統(tǒng)設(shè)計,多以實驗室規(guī)模純化少量物質(zhì)以進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和藥效活性評價為目標(biāo),較難以同樣的系統(tǒng)設(shè)計放大到工業(yè)化規(guī)模[11-13]。因此,本文構(gòu)建以四位切換閥和捕集柱陣列為接口,通過創(chuàng)新設(shè)計的系統(tǒng)切換流路,實現(xiàn)多組分的在線二維制備。該系統(tǒng)具有易于放大到生產(chǎn)規(guī)模的優(yōu)點。

煙草是中國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,在煙草的種植和生產(chǎn)加工過程中,產(chǎn)生了大批煙葉廢棄物。一方面,煙葉廢棄物的傳統(tǒng)處理方式對環(huán)境造成了一定的壓力和污染;另一方面,煙葉中已知含有300多種化合物[14],其中的生物堿、糖類、氨基酸、有機(jī)酸等是重要的醫(yī)藥、食品原料。因此,本文以煙葉為樣品,對所構(gòu)建的制備型2D-LC系統(tǒng)進(jìn)行驗證,為煙葉中藥效活性物質(zhì)的高效生產(chǎn)奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器

制備型2D-LC系統(tǒng)為自主研發(fā)設(shè)備,由3臺HT7050A制備型恒流泵、HT7050A紫外可見光檢測器、HT7050A收集器(帶有10×30試管架)和2支分離柱C18(460 mm×15 mm i.d., 50 μm)構(gòu)成分離系統(tǒng),由多個切換閥和4支捕集柱構(gòu)成2D-LC系統(tǒng)接口,通過自主開發(fā)的ht2D-Prep色譜工作站控制儀器在線自動運行。裝填了C18、WAX和LH-20填料的捕集柱(50 mm×30 mm i.d., 50 μm)、各系統(tǒng)模塊及色譜柱均由蘇州匯通色譜分離純化有限公司提供。分析型液相色譜為Waters 2695液相色譜儀。

1.2 試劑

無水乙醇(分析純,永華化學(xué)股份有限公司);甲酸、三氟乙酸(TFA)、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨(均為分析純,上海蒂凱姆實業(yè)有限公司);煙草粉末(上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心)。

1.3 色譜條件

第一維液相色譜(1D-LC) 分離柱C18(460 mm×15 mm i.d., 50 μm);流動相:A為50 mmol/L磷酸銨溶液(pH 6.5), B為乙醇;檢測波長:UV 210 nm;柱溫:室溫;梯度洗脫程序:0～5 min,5%B;5～40 min, 5%B～55%B;40～41 min,55%B;41～50 min,55%B～100%B;50～70 min,100%B;流速10 mL/min;稀釋液:0.1% TFA水溶液,流速20 mL/min。

第二維液相色譜(2D-LC) 分離柱C18(460 mm×15 mm i.d., 50 μm);流動相:A為0.1%甲酸水溶液,B為乙醇;檢測波長:UV 210 nm;柱溫:室溫;梯度洗脫程序:0～5 min,5%B;5～40 min, 5%B～55%B;40～50 min,55%B～100%;50～70 min,100%B;流速10 mL/min。

分析型色譜 C18柱(250 mm×4.6 mm i.d., 5 μm);流速1 mL/min;流動相(煙堿、綠原酸和蘆丁): A為0.1% TFA水溶液(pH 6.5), B為乙醇;梯度洗脫程序: 0～5 min,5%B；5～25 min, 5%B～55%B；25～35 min,55%B～100%；35～45 min,100%B;洗脫梯度(茄尼醇): 0～5 min,90%B～100%B;5～15 min,100%B。

1.4 樣品處理方法

取20 g煙草粉末于燒瓶中,加入200 mL甲醇-水(90∶10, v/v)溶液,超聲提取2 h后經(jīng)定性濾紙過濾殘渣,旋蒸濃縮至約50 mL,供2D-LC分離純化。

2 結(jié)果與討論

2.1 二維制備液相色譜系統(tǒng)的構(gòu)建

煙草中含有較多化學(xué)成分,以煙堿、蘆丁、綠原酸和茄尼醇的含量較高[15]。在2D-LC系統(tǒng)的構(gòu)建過程中,根據(jù)樣品性質(zhì),選擇合適的色譜分離模式,并考慮同步純化多個組分的技術(shù)特征,開發(fā)了基于捕集柱陣列的2D-LC系統(tǒng),包括兩個流動相泵、1個進(jìn)樣泵、1個稀釋泵、多個兩位四通閥、兩個混合器、捕集柱陣列、色譜檢測器、第一維制備柱(C1)、第二維制備柱(C2)和其他連接管線組成,系統(tǒng)配置見圖1,原型機(jī)實物圖如圖1c所示。

運行1D-LC時,流路方向如圖1a所示,泵A和泵B輸送流動相經(jīng)混合器混合后,經(jīng)閥A到達(dá)閥C;樣品由進(jìn)樣泵輸送到閥C,由流動相輸送至分離柱1;樣品經(jīng)C1分離后,洗脫液經(jīng)過閥B到達(dá)混合器2,與稀釋泵中的溶劑混合后,經(jīng)過閥A到達(dá)捕集柱陣列;通過切換捕集柱陣列中的閥,選擇性地將洗脫液導(dǎo)向捕集柱1～4,即分成4個餾分;餾分流經(jīng)捕集柱,其中的目標(biāo)組分被捕獲,溶劑經(jīng)過閥B到達(dá)餾分收集器,并切換至廢液。

運行2D-LC時,流路方向如圖1b所示,以捕集柱為上樣柱,通過切換捕集柱陣列的四通閥選擇組分進(jìn)行第二維分離。泵A和泵B輸送流動相在混合器1混合后,經(jīng)閥A到達(dá)捕集柱陣列;切換捕集柱陣列閥,選擇捕集柱1為上樣柱;流動相輸送捕集柱1中的樣品,經(jīng)閥B、閥A、閥C到達(dá)C2;捕集柱1中的組分,在分離柱2上分離后,其洗脫液經(jīng)檢測器和閥B到達(dá)餾分收集器;餾分收集器根據(jù)紫外檢測器信號設(shè)定的閾值,自動收集餾分。

圖1 2D-LC系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)圖

為了實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn),系統(tǒng)可靠性至關(guān)重要。研制過程中使用了結(jié)構(gòu)相對簡單的兩位四通閥替代多位閥,各管路連接簡單,維護(hù)方便;同時,該系統(tǒng)所有液路都有出口,即使出現(xiàn)切換錯誤也不會導(dǎo)致液路封閉引起局部的超高壓、泄露等安全生產(chǎn)危險。

2.2 2D-LC分離條件考察

在進(jìn)行在線2D-LC制備級樣品純化之前,考察各維色譜條件以及載樣量是進(jìn)行純化工藝開發(fā)的重要步驟。首先,考察了二維系統(tǒng)中第一維色譜柱的載樣量,如圖2所示。煙草提取物樣品在上樣量為1 g和5 g時,一維色譜圖呈現(xiàn)出過載現(xiàn)象(圖2a～c),上樣量為10 g時出現(xiàn)嚴(yán)重過載現(xiàn)象(圖2d),經(jīng)延長梯度時間至70 min,優(yōu)化了各組分的分離,煙葉提取物的色譜峰在整個梯度時間內(nèi)較為均勻,屬于可接受的制備色譜過載行為(圖3a)。

圖2 不同載樣量及流動相梯度條件下煙草提取物的一維分離色譜圖

圖3 一維液相色譜純化煙葉提取物及餾分分析色譜圖

其次,考察了采用不同類型填料的捕集柱對4種煙葉成分的捕集效果。由于一維餾分中含有有機(jī)試劑,導(dǎo)致餾分中的目標(biāo)組分在捕集柱上無保留或保留較弱,如表1所示。在餾分不稀釋的狀態(tài)下,捕集柱填料為C18時,對綠原酸、蘆丁和茄尼醇的捕集效率僅為32.70%、38.30%和61.77%;餾分經(jīng)水稀釋5倍后,再上樣到捕集柱上,則捕集效率顯著提高,分別為56.37%、88.30%和96.13%;餾分經(jīng)0.1%TFA水溶液稀釋,C18填料對蘆丁和茄尼醇的吸附效率較好;煙堿在不稀釋條件下,使用C18填料的捕集效率最高。因此,捕集柱1、2、4以C18為填料,捕集煙堿組分時不進(jìn)行稀釋,捕集蘆丁和茄尼醇時,使用0.1%TFA水溶液稀釋;對于綠原酸組分,以WAX為填料時的捕集效率高,但難以洗脫下來;使用LH-20填料時,在不稀釋的條件下,捕集效率達(dá)到了76.10%,因此,對于綠原酸的捕獲,捕集柱填料采用LH-20。

最后,考察了4個目標(biāo)成分的峰分布情況,以確定適宜的捕集柱捕獲條件。將第一維分離餾分根據(jù)出峰情況手動分成7段(見圖31D-LC),經(jīng)分析型LC分析,其色譜圖如圖3-F1～F7所示,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性鑒定,確定了餾分1(F1)含有煙堿、餾分3(F3)含有綠原酸、餾分4(F4)含有煙堿、餾分5(F5)含有蘆丁、餾分7(F7)含有茄尼醇。F4中的煙堿含量遠(yuǎn)低于F1組分,因此,舍棄此組分,在線2D-LC制備采用4根捕集柱分別捕獲4個組分,其中2號捕集柱填料為LH-20,用以捕獲綠原酸,其余3根捕集柱填料為C18,分別捕獲煙堿、蘆丁和茄尼醇。

2.3 在線制備2D-LC法分離煙葉成分

制備2D-LC系統(tǒng)中配備了4支捕集柱,在線運行一維液相色譜時,按照目標(biāo)組分出峰時間區(qū)間切換閥,使4根捕集柱分別捕獲含有4個目標(biāo)組分的餾分(見圖41D-LC),并存儲在其中。待第一維運行完成,切換閥模塊,依圖1b所示流路運行,4支捕集柱捕獲的餾分(組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)依次進(jìn)入第二維進(jìn)行分離。第二維色譜柱上分離的組分,由餾分收集器收集,采用1.3節(jié)分析型色譜進(jìn)行純度分析,結(jié)果見圖4和表2,共有5個組分相對純度較高(>80%),其中包括一個未知成分。此外,該2D-LC系統(tǒng)還收集到多個其他組分,但純度較低。在未來有需求時,可以進(jìn)一步優(yōu)化二維制備色譜各維的色譜條件,實現(xiàn)更多高純組分的純化以及結(jié)構(gòu)鑒定。

圖4 在線制備2D-LC系統(tǒng)純化煙葉中的活性成分

表2 煙草分離組分的色譜保留時間和純度

通過分離煙葉中的4個主要活性成分,驗證了系統(tǒng)簡單可靠,且各模塊控制及在線監(jiān)測系統(tǒng)運行正常。經(jīng)過第二維分離后,獲得的煙堿、綠原酸、蘆丁的純度均大于95%,而茄尼醇的純度大于80%(與市售對照品純度相當(dāng))。以上結(jié)果驗證了該在線2D-LC系統(tǒng)可以有效地實現(xiàn)目標(biāo)組分的純化。

3 結(jié)論

本文構(gòu)建了基于捕集柱陣列的在線制備型2D-LC系統(tǒng),以制備液相色譜模塊為分離系統(tǒng),以稀釋泵、切換閥和捕集柱陣列為接口,成功地應(yīng)用于分離煙草樣品中的煙堿、綠原酸、蘆丁、茄尼醇等化合物。通過一次上樣獲得了4個純度較高的組分,實現(xiàn)了煙葉中活性成分的同步分離純化。

該系統(tǒng)采用四通閥代替了常規(guī)制備2D-LC中的多位選擇閥,并進(jìn)行了創(chuàng)新的接口設(shè)計,結(jié)合捕集柱陣列模式,能靈活地選擇性分離煙草中的目標(biāo)化合物,實現(xiàn)多個高純化合物的規(guī)?；a(chǎn)。同時,采用了中壓色譜系統(tǒng),以50 μm粒徑填料為分離介質(zhì),系統(tǒng)壓力低,對設(shè)備的要求大大降低,更易實現(xiàn)自動化操作和放大到制備規(guī)模,在煙草的快速分離制備和工業(yè)化生產(chǎn)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。此外,該系統(tǒng)的概念設(shè)計和運行模式也可以應(yīng)用到其他天然產(chǎn)物的分離純化中,實現(xiàn)復(fù)雜成分的高效純化。