杜昕昕, 王寅鵬, 肖 偉, 朱靖博,*

(1. 大連工業(yè)大學食品學院, 遼寧 大連 116034; 2. 中藥制藥過程新技術國家重點實驗室, 江蘇 連云港 222001)

五味子是木蘭科五味子屬(Schisandrachinensis(Turcz.)Baill)的成熟干燥果實,在《神農(nóng)本草經(jīng)》中最初被記錄,具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效[1]。作為中藥或保健食品原料,五味子的主要有效成分是木脂素類化合物[2],其含量分析對于以五味子為原料的中藥及保健食品的質(zhì)量分析具有重要意義。

提取、凈化等樣品前處理過程是植物樣本中化學成分分析的關鍵過程?！吨袊幍洹?2020版)規(guī)定,五味子中木脂素的分析采用溶劑多次提取的方法[3],傳統(tǒng)的索氏提取[4]、熱回流[5]、超聲輔助提取[6]等方法已被用于五味子成分分析的前處理,其存在的主要問題是:制備時間較長、消耗大量有機溶劑及清洗、過濾、濃縮和轉(zhuǎn)移等實驗步驟繁雜,既不符合綠色化學理念,也會因為繁雜的步驟引入不必要的誤差。近年來,植物基源樣本分析前處理研究重點在于如何減少有機溶劑消耗、消除額外成分對色譜分析的影響、省略樣品轉(zhuǎn)移和預濃縮步驟以及提高萃取效率等。Barker等[7]于1989年提出的基質(zhì)固相分散萃取法(MSPD)是一種簡單且廉價的樣品前處理方法,其基本原理和過程是將樣品與固體吸附劑以一定比例直接混合后機械研磨,形成的樣品與吸附劑混合均一的固相介質(zhì)置于固相萃取管內(nèi),以合適的溶劑洗脫,選擇性分離出一種或幾種化合物后定容,完成集植物細胞破碎、萃取、分餾和純化于一體的樣品前處理過程。

迄今為止,MSPD已被用于化妝品[8]、食品成分分析[9]、農(nóng)獸藥殘留檢測[10]、中藥及其制劑[11]、草藥中精油[12]等的應用中。另外,對五味子中木脂素類化合物的測定分析也有報道,Zhang等[13]于2016年首次采用MSPD技術從五味子中提取分析了5種具有二苯并環(huán)辛二烯型骨架的木脂素類化合物。Song等[14]采用中性氧化鋁為介質(zhì)的MSPD-HPLC實現(xiàn)了五味子中6種木脂素的快速分析。

MSPD應用于諸如中藥等復雜體系分析的前處理,吸附劑及合適的洗脫條件選擇是關鍵,吸附劑參與樣品的破碎過程,并將分析對象吸附到固相載體上,而有效的洗脫可以確保獲得準確的分析結果。常用的吸附劑包括正相吸附劑(如硅膠、氧化鋁、佛羅里硅土)、反相吸附劑(以C18為基質(zhì))和無吸附性吸附劑(如海沙等)[15],這些吸附劑通常表現(xiàn)出較低的選擇性。1990年,Alpert提出了親水相互作用色譜法(HILIC)[16],作為反相色譜法的補充方法,HILIC可以有效保留植物中存在的如糖苷、糖肽、酚類、有機酸等極性化合物[17],而對弱極性化合物的保留較小,應該可以被用于植物中弱極性木脂素類化合物的富集與凈化。

本文采用MSPD結合HPLC分析研究建立五味子中5種木脂素類化合物的分析方法。考察包括正相色譜、反相色譜及親水相互作用色譜等3個類型的12種吸附劑對五味子中木脂素得率的影響,選擇合適的萃取材料和萃取條件。將建立的方法與超聲輔助提取和熱回流提取前處理方法相比較,驗證該方法與經(jīng)典分析方法及其預期目的適應性。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

AC Chrom S6000型高效液相色譜分析儀(北京華譜新創(chuàng)科技有限公司), 12 mL固相萃取柱(湖北蘇林科技有限公司), 600Y型高速多功能粉碎機(永康市鉑歐五金制品有限公司), DHG-3A型電熱恒溫鼓風干燥箱(鞏義市予華儀器有限責任公司), KQ-500B型超聲波清洗器(鞏義市英裕高科儀器廠)。

五味子甲素(schisandrol A,純度99.5%)、五味子乙素(schisandrol B,純度99.1%)購自中國食品藥品檢定研究所。五味子醇甲(deoxyschizandrin)、五味子醇乙(schizandrin B)、五味子丙素(schizandrin C)標準物質(zhì)由本實驗室從五味子萃取物中分離純化,并通過1H-NMR、13C-NMR和HPLC-MS進行了鑒定,純度均在98%以上。硅膠、C18、C18-ME、C18-G1、C18-HC、Diol、XAmide、Xion均購自北京華譜新創(chuàng)科技有限公司;酸性氧化鋁、堿性氧化鋁、中性氧化鋁購自上海陸都化學試劑廠;色譜級甲醇、乙腈購自天津康科德科技有限公司;分析級甲醇、乙腈、甲酸、丙酮購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

本文17批五味子樣品經(jīng)鑒定均為木蘭科五味子屬的成熟干燥果實(北五味子),于2021年10～12月購自中國不同地區(qū)。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素標準品適量,于甲醇中溶解,配制成質(zhì)量濃度分別為1.34、1.10、1.00、0.98和1.02 mg/mL的混合標準溶液,于4 ℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆?。根?jù)需要,混合標準工作液由混合標準溶液經(jīng)甲醇溶液逐級稀釋至適當濃度。

1.3 樣品預處理

五味子藥材于65 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干12 h。用高速多功能粉碎機進行粉碎,過40目標準試驗篩,儲存在-4 ℃冰箱備用。

1.4 樣品前處理

1.4.1MSPD

稱取五味子粉末0.25 g,與吸附劑Xion 0.75 g混合,室溫條件下充分研磨3～5 min。將研磨后的樣品轉(zhuǎn)移至12 mL固相萃取柱空管中,萃取柱上、下兩端放置篩板,充分壓實;加入15 mL甲醇,使用注射器加壓洗脫,收集洗脫液于25 mL容量瓶中,并用甲醇定容至刻度。0.22 μm濾膜過濾后進行HPLC分析。

1.4.2超聲輔助提取法

稱取五味子粉末0.25 g,轉(zhuǎn)移至試管中,然后加入15 mL甲醇溶液稱重,在功率200 W的條件下超聲提取1 h后將樣品冷卻至室溫,再次稱重,并用甲醇補足減少的重量。隨后,將樣品混合物過濾。0.22 μm濾膜過濾后進行HPLC分析。

1.4.3熱回流法

將0.25 g五味子粉末與15 mL甲醇混合于錐形燒瓶中,準確稱量,通過熱回流法提取1 h,隨后冷卻至室溫,再次稱量,并用甲醇補足損失的重量,樣品提取物混合均勻后,收集濾液,將所得溶液過0.22 μm濾膜,用于HPLC分析。

1.5 色譜條件

色譜柱:Bomex FINDSIL C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流動相A:乙腈,流動相B: 0.1%(v/v)甲酸水溶液;柱溫:30 ℃;流速:1 mL/min;進樣量:20 μL;檢測波長:250 nm。梯度洗脫程序:0～10 min, 10%A～50%A; 10～60 min, 50%A～100%A?；贛SPD-HPLC分析五味子樣品的色譜圖(見圖1)。

圖1 基質(zhì)固相分散法萃取木脂素類化合物的高效液相色譜圖

2 結果與討論

2.1 吸附劑的選擇

吸附劑的類型及吸附機理決定其選擇性，以及樣品與吸附劑之間能否產(chǎn)生高吸附能力。本文考察了正相色譜填料(硅膠、佛羅里硅土、酸性氧化鋁、中性氧化鋁、堿性氧化鋁)、HILIC填料(Xion、XAmide、Diol)及反相色譜填料(C18-HC、C18-G1、C18、C18-ME)等在內(nèi)的12種吸附劑對五味子木脂素類化合物得率的影響(見圖2)。以上12種吸附劑對目標分析物具有相似的得率。反相吸附劑對五味子甲素和五味子乙素表現(xiàn)出較低的得率,這可能是因為C18材料的非極性和疏水性吸附機理,而五味子甲素和乙素的極性相對于五味子醇甲和五味子醇乙較弱,使目標分析物的洗脫更難,導致其得率較低[18]。如圖2數(shù)據(jù)所示,相比而言HILIC型填料對五味子木脂素類化合物的得率較高。其中Xion的得率略高于其他正相、反相吸附劑,這與其采用獨特的兩性離子鍵合技術、對弱極性化合物的保留較弱的特性密切相關[19],適合極性相對較弱的五味子木脂素類化合物富集。

圖2 不同吸附劑對目標分析物得率的影響(n=3)

2.2 吸附劑質(zhì)量的選擇

吸附劑與樣品的質(zhì)量比會影響樣品與吸附劑的接觸面積和吸附效率。本文以0.25 g五味子粉末為固定值,通過改變吸附劑的質(zhì)量對五味子木脂素類化合物得率進行評估(見圖3)。當Xion的質(zhì)量從0.125 g上升到0.75 g時,各目標化合物的得率最高。這可能是因為合適的比例會增加樣品和吸附劑之間的接觸面積,并使樣品完全吸附于Xion,使得吸附劑與樣品產(chǎn)生更強的分子相互作用[20],從而提高目標分析物的得率。當樣品與Xion的質(zhì)量在0.75 g～1.25 g范圍內(nèi)時,得率呈下降趨勢。這可能是由于隨著吸附劑量的增大,所選的15 mL溶劑并未使目標分析物從MSPD柱中完全洗脫,從而使得率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。因此,本實驗選擇吸附劑的質(zhì)量為0.75 g。

圖3 吸附劑質(zhì)量對目標分析物得率的影響(n=3)

2.3 洗脫劑的選擇

洗脫劑對MSPD過程中目標分析物的有效洗脫有顯著影響。以Xion填料作為吸附劑,首先以甲醇、乙醇、丙酮、乙腈為洗脫劑對五味子木脂素類化合物得率進行評估,結果見圖4。4種溶劑對五味子木脂素類化合物均具有良好的洗脫,相比而言,乙腈對五味子乙素有較高的得率,而甲醇對于五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素的得率更高,因此選擇甲醇作為洗脫劑進行下一步試驗。

圖4 不同洗脫劑對目標分析物得率的影響(n=3)

接下來研究了在相同洗脫體積(15 mL)下,不同體積分數(shù)的甲醇水溶液作為洗脫劑對五味子中木脂素類化合物得率的影響(見圖5)。20%甲醇水溶液作為洗脫劑時,未檢出五味子乙素和五味子丙素,40%甲醇水溶液作為洗脫劑時,未檢測出五味子丙素,隨著甲醇水溶液的體積分數(shù)由20%增加到80%,木脂素的得率也逐漸增加;而100%甲醇溶液與80%甲醇水溶液作為洗脫劑時得率變化不顯著。實驗過程中發(fā)現(xiàn),洗脫劑中水的存在會導致溶劑的黏度變大,洗脫時間也相應增加[21],洗脫劑不易通過固相萃取柱。當洗脫劑中甲醇含量保持在較高水平時,得率顯著增強且洗脫時間縮短,因此,選擇100%甲醇溶液作為洗脫劑。

圖5 甲醇體積分數(shù)對目標分析物得率的影響(n=3)

2.4 洗脫劑體積的選擇

不同洗脫劑體積對目標化合物具有不同的洗脫效果。分別考察了5、10、15、20和25 mL甲醇對五味子木脂素類化合物得率的影響(見圖6)。當洗脫劑體積為15 mL時得率達到最高,而洗脫劑用量由15增加到25 mL時,得率再無明顯提高。實驗選擇洗脫劑體積為15 mL。

圖6 洗脫劑的體積對目標分析物得率的影響(n=3)

2.5 方法學驗證

2.5.1線性關系、檢出限和定量限

按1.2節(jié)方法配制混合標準工作液,并分別進行測定。以各分析物峰面積Y作為縱坐標,質(zhì)量濃度X(mg/mL)作為橫坐標,繪制5種木脂素類化合物的標準曲線,以信噪比(S/N)=3和S/N=10分別計算分析方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。5種木脂素類化合物在各自的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關系(相關系數(shù)R2≥0.999 9), LOD與LOQ分別介于0.008 9～0.029 4 μg/mL和0.026 7～0.088 2 μg/mL之間(見表1)。

表1 5種木脂素類化合物的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限

2.5.2精密度和穩(wěn)定性

按照1.4.1節(jié)方法制備供試品,連續(xù)3 d分別對樣品進樣6次,測定該方法的日內(nèi)精密度和日間精密度。結果表明,5種木脂素類化合物的日內(nèi)精密度在0.41%～0.95%之間,日間精密度在2.4%～3.6%之間。

將供試品溶液置于室溫下,分別在制備后的0、2、4、6、12、24 h后進樣測定,結果顯示5種木脂素類化合物峰面積的RSD分別為0.21%、0.16%、0.42%、4.2%、0.78%,表明五味子供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.3回收率

稱取已知含量的五味子樣品0.25 g,按照1.4.1節(jié)方法對樣品進行處理后,進行HPLC測定,記錄各分析物的峰面積,根據(jù)木脂素類化合物在本實驗所測定的濃度,添加一定量(低、中、高水平)的混合標準溶液至實際樣品中,測得方法的回收率在92.2%～111.2%之間,結果見表2。

2.6 MSPD與經(jīng)典方法對比

本文方法與熱回流法和超聲輔助提取法相比較的結果見表3。使用相同的料液比條件進行樣品前處理時,MSPD中5種木脂素類化合物的得率高于經(jīng)典方法,并且MSPD具有萃取時間短、樣品量少、溶劑體積小等優(yōu)點。

表3 MSPD與經(jīng)典方法測定五味子木脂素類化合物得率的比較

2.7 不同產(chǎn)地五味子樣品含量測定

采用建立的方法分析了不同地區(qū)五味子中木脂素類化合物的含量,見表4。5種木脂素類化合物在17份樣品中均有存在,但不同地區(qū)的五味子中木脂素類化合物含量有明顯差異。來自黑龍江尚志的五味子,其五味子乙素含量高達7.57 mg/g,遼寧清原的五味子中五味子乙素含量僅為2.48 mg/g。這種顯著的差異可能與栽培地理來源、生長氣候條件、收獲期和貯藏有關。

3 結論

實驗將親水相互作用色譜填料Xion作為吸附劑應用于五味子中木脂素類化合物的微萃取,研究建立了一種簡單、高效的MSPD-HPLC方法萃取和測定五味子中5種木脂素類化合物。與經(jīng)典的方法相比,所提出的MSPD具有樣品用量少、有機溶劑消耗較低以及萃取時間短的優(yōu)點。同時,該方法也為其他植物或藥物制劑中木脂素類化合物的測定提供了參考。