楊飄飄, 黃 偉, 李麗霞, 劉 紅

(湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院, 湖北省藥品質(zhì)量檢測(cè)與控制工程技術(shù)研究中心, 湖北 武漢 430075)

氯倍他索乙酸酯是一種新型的糖皮質(zhì)激素,具有孕甾烷基本母核,同時(shí)含有1,4-二烯-3-20-二酮,與氯倍他索丙酸酯結(jié)構(gòu)相似(見(jiàn)圖1),僅17位側(cè)鏈上乙酸酯取代了丙酸酯,故藥理作用及不良反應(yīng)相似,具有抗炎、抗過(guò)敏、抗休克和免疫抑制等藥理作用[1,2],同時(shí)長(zhǎng)期使用,也易形成激素依賴性,甚至可能引發(fā)骨質(zhì)疏松、高血壓及糖尿病等不良反應(yīng)[3-5]。我國(guó)[6]以及韓國(guó)[7]、日本[8]、歐盟[9]、東盟[10]等國(guó)家和地區(qū)都將糖皮質(zhì)激素列為化妝品禁用原料。目前,化妝品中糖皮質(zhì)激素相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[6,11-14]、文獻(xiàn)[3-5,15-22]及相關(guān)通報(bào)[23]中暫未見(jiàn)氯倍他索乙酸酯的檢測(cè)方法相關(guān)報(bào)道。然而在日常工作中,發(fā)現(xiàn)了疑似添加新型糖皮質(zhì)激素氯倍他索乙酸酯的現(xiàn)象。因此開(kāi)發(fā)化妝品中氯倍他索乙酸酯定性定量檢測(cè)方法迫在眉睫。

圖1 氯倍他索乙酸酯的結(jié)構(gòu)

目前,化妝品中糖皮質(zhì)激素的檢測(cè)方法以液相色譜-高分辨質(zhì)譜法(LC-HRMS)[4,15,24]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[3,5,11-14,16-22,25-28]為主。液相色譜-高分辨質(zhì)譜法有高分辨率和高質(zhì)量精度的優(yōu)勢(shì),可快速識(shí)別、定量和鑒定化合物[29],但操作成本高、數(shù)據(jù)分析難度大,相關(guān)方法的標(biāo)準(zhǔn)化和推廣應(yīng)用還有一定難度[30];液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)具有特異性強(qiáng)、檢出限低等特點(diǎn),能夠快速、準(zhǔn)確測(cè)定化妝品中的糖皮質(zhì)激素[3-5,16-17,20-22,26-28],是復(fù)雜基質(zhì)中定性定量的首選標(biāo)準(zhǔn)方法。

本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS),針對(duì)化妝品基質(zhì)復(fù)雜的特點(diǎn),考察了4種前處理方法,并優(yōu)化提取溶劑及色譜、質(zhì)譜條件。同時(shí)針對(duì)化妝品中常見(jiàn)的5種基質(zhì)(膏霜乳、凝膠、泥、貼膜和液體(水)),建立了新型糖皮質(zhì)激素氯倍他索乙酸酯測(cè)定方法,為監(jiān)督執(zhí)法提供有力的技術(shù)支撐,保障廣大消費(fèi)者的用妝安全。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters Acquity UPLC/XEVOTMTQ-S液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司); Milli-Q超純水器(美國(guó)Millipore公司); Fotector Plus高通量全自動(dòng)固相萃取儀(中國(guó)?？苾x器有限公司); 45位N-EVAP氮吹儀(美國(guó)Organomation公司);臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Thermo Biofuge公司)。

甲醇和乙腈均為色譜純,購(gòu)自德國(guó)默克公司;乙酸(acetic acid)和甲酸(formic acid)均為色譜純,購(gòu)自上海Aladdin公司;氯化鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅和硫酸鎂均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;3 mL/60 mg Oasis?HLB固相萃取柱、3 mL/60 mg Oasis?PRiME固相萃取柱均購(gòu)自美國(guó)Waters公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

對(duì)照品氯倍他索乙酸酯由倍他米松合成得到。氯倍他索乙酸酯的分子式為C24H30ClFO5,相對(duì)分子質(zhì)量為452.18。氯倍他索乙酸酯用乙腈溶解稀釋配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備溶液,置于-20 ℃冷凍保存。使用時(shí)準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備溶液適量,用乙腈稀釋定容,配制成質(zhì)量濃度為200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液。

準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)中間液適量,用基質(zhì)空白提取液稀釋定容,配制成質(zhì)量濃度為1、2、4、10、20、40 μg/L的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品處理

1.3.1樣品前處理

稱取樣品0.2 g(精確至0.001 g),置于10 mL具塞比色管中,加入少量乙腈,渦旋分散均勻后,加入乙腈約8 mL,超聲提取30 min,靜置至室溫,用乙腈定容至刻度,以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min。取上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾,濾液作為供試品溶液備用(供試品溶液可根據(jù)實(shí)際濃度進(jìn)行適當(dāng)稀釋)。

1.3.2基質(zhì)空白提取液的制備

稱取空白試樣0.2 g(精確至0.001 g),置于10 mL具塞比色管中,按照1.3.1節(jié)操作處理,得到基質(zhì)空白提取液,用于配制系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Waters Cortecs C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 2.7 μm);流動(dòng)相A:水,流動(dòng)相B:乙腈;柱溫:35 ℃;流速:0.4 mL/min;進(jìn)樣量:2 μL。梯度洗脫程序:0～2 min, 40%B; 2～5 min, 40%B～95%B; 5～6.5 min, 95%B; 6.5～6.6 min, 95%B～40%B; 6.6～8 min, 40%B。

1.4.2質(zhì)譜條件

電噴霧正離子掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式,毛細(xì)管電壓:3.2 kV;脫溶劑氣流速:800 L/h;脫溶劑氣溫度:350 ℃;錐孔氣流速:150 L/h。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 氯倍他索乙酸酯的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-MS/MS條件優(yōu)化

2.1.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧離子源下,將100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源,分別采用正離子和負(fù)離子模式對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描。正離子模式的響應(yīng)遠(yuǎn)高于負(fù)離子模式,在正離子模式下,氯倍他索乙酸酯可產(chǎn)生[M+H]+、[M+H-H2O]+、[M+H-HF]+準(zhǔn)分子離子峰,[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰響應(yīng)最強(qiáng)且穩(wěn)定,故以[M+H]+離子(m/z=453.2)作為母離子并確定最佳的錐孔電壓。然后進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜優(yōu)化,選取響應(yīng)較強(qiáng)的碎片作為定量和定性離子,并優(yōu)化碰撞能量,經(jīng)優(yōu)化后得到的質(zhì)譜條件參數(shù)見(jiàn)表1。

2.1.2色譜條件的優(yōu)化

查閱標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn),分離糖皮質(zhì)激素的流動(dòng)相體系中有機(jī)相主要為乙腈,水相主要以甲酸水溶液、乙酸水溶液和水為主[3-5,31-35]。故選擇0.1%甲酸水-乙腈、0.1%乙酸水-乙腈、水-乙腈作為流動(dòng)相,考察被測(cè)物質(zhì)的峰形及響應(yīng)。結(jié)果顯示,在3種流動(dòng)相條件下,目標(biāo)物都能得到良好的峰形及色譜峰響應(yīng),在水-乙腈的流動(dòng)相體系條件下,色譜峰響應(yīng)最大,故選擇以水-乙腈作為流動(dòng)相條件。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1前處理方法的選擇

參考標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn),目前化妝品中糖皮質(zhì)激素類提取主要有①乙腈直接提取法[6]、②固相萃取法[3]、③PRiME通過(guò)式固相萃取法[17]及④QuEChERS法[4]等4種前處理方法,故以膏霜乳類為典型基質(zhì),采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液考察了目標(biāo)化合物在上述4種前處理方法下的提取效果,見(jiàn)圖2。采用空白基質(zhì)加標(biāo)樣品溶液中目標(biāo)化合物峰面積/基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物峰面積×100%的公式計(jì)算回收率。結(jié)果顯示,乙腈直接提取法及PRiME通過(guò)式固相萃取法都能得到較好的回收率且回收率相近,但是直接提取法步驟簡(jiǎn)單便捷,更節(jié)約人力及成本,故選擇乙腈直接提取法作為前處理方法。

圖2 目標(biāo)化合物在不同樣品前處理方法下的提取回收率(n=6)

2.2.2提取溶劑的選擇

以膏霜乳類為典型基質(zhì),對(duì)乙腈直接提取法進(jìn)行優(yōu)化,分別考察了6種提取溶劑:①乙腈、②乙腈-水(70∶30, v/v)、③乙腈-水(50∶50, v/v)、④甲醇、⑤甲醇-水(70∶30, v/v)、⑥甲醇-水(50∶50, v/v)的提取效果,見(jiàn)圖3。

圖3 目標(biāo)化合物在不同提取溶劑條件下的提取回收率(n=6)

結(jié)果顯示,6種提取溶劑下,目標(biāo)化合物均能呈現(xiàn)較好的峰形,且回收率相差不大。為減小溶劑效應(yīng)的影響,選擇色譜條件中的流動(dòng)相乙腈為提取溶劑,且乙腈作為提取溶劑時(shí),樣品溶液更澄清更易過(guò)濾,更適合高通量篩查。

2.2.3超聲時(shí)間的選擇

以膏霜乳類為典型基質(zhì),對(duì)超聲提取的時(shí)間進(jìn)行考察,采用2.2.1節(jié)方法計(jì)算回收率,分別考察了在10、20和30 min 3種超聲提取時(shí)間下的提取效果,見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示,超聲時(shí)間越長(zhǎng),提取效果越好,為保證能得到更好的回收率,選擇30 min作為超聲提取時(shí)間。

圖4 目標(biāo)化合物在不同超聲時(shí)間下的提取回收率(n=6)

2.2.4基質(zhì)效應(yīng)的考察

本研究采用ME=基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率×100%的計(jì)算方法對(duì)目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)[27]。若ME>100%,則為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),ME<100%,則為基質(zhì)抑制效應(yīng)。ME與100%的差值越大,則表明基質(zhì)效應(yīng)越明顯[28]。研究考察了膏霜乳類、凝膠類、泥類、貼膜類和液體(水)5種基質(zhì)類型的基質(zhì)效應(yīng),見(jiàn)表2。結(jié)果表明,除液體(水)外,其余基質(zhì)的ME值都低于80%,存在明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)。為了消除基質(zhì)的影響,保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,用基質(zhì)空白提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液配制得到系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量計(jì)算。

表2 在不同基質(zhì)類型下目標(biāo)化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限及基質(zhì)效應(yīng)

2.3 方法的線性關(guān)系與靈敏度

本研究針對(duì)膏霜乳、凝膠、泥、貼膜和液體(水)5種基質(zhì)進(jìn)行考察。采用基質(zhì)空白提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液配制系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,以被測(cè)化合物定量離子對(duì)的峰面積為縱坐標(biāo)(y),以被測(cè)物質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x, μg/L)繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,考察被測(cè)物的線性關(guān)系,結(jié)果見(jiàn)表2。5種基質(zhì),被測(cè)物質(zhì)在0.9～37 μg/L的線性范圍內(nèi)線性擬合良好,線性相關(guān)系數(shù)(R2)均超過(guò)0.99。

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

采用在膏霜乳類,凝膠類、泥類、貼膜類和液體類(水)5種基質(zhì)類型的空白樣品中添加定量限、2倍定量限、10倍定量限3個(gè)水平的被測(cè)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,記錄被測(cè)物質(zhì)的峰面積,代入基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算被測(cè)物質(zhì)加標(biāo)回收率和精密度(RSD,n=6),見(jiàn)表3。氯倍他索乙酸酯在5種基質(zhì)中的平均回收率范圍為83.2%～103.2%,精密度范圍為1.4%～5.6%。

2.5 方法的特異性

采用空白溶劑、標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.9 μg/L)、5種不同基質(zhì)空白樣品及空白樣品添加標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.9 μg/L)分別進(jìn)行測(cè)定。在MRM模式下同時(shí)監(jiān)測(cè)2個(gè)離子對(duì),通過(guò)保留時(shí)間及離子豐度比進(jìn)行定性,確保結(jié)果特異性。

氯倍他索乙酸酯的保留時(shí)間為4.67 min,空白溶劑及5種空白基質(zhì)在4.67 min處均沒(méi)有色譜峰?？梢?jiàn),空白溶劑及各類別空白基質(zhì)對(duì)被測(cè)目標(biāo)化合物無(wú)干擾,該方法特異性良好。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本法對(duì)32批不同基質(zhì)類型的樣品進(jìn)行篩查,共有5批樣品檢出氯倍他索乙酸酯,檢出量由小到大依次為:1.1、1.1、34.5、39.2和48.1 μg/g。上述5批樣品基質(zhì)類型為貼膜和凝膠,樣品來(lái)源于3個(gè)不同的生產(chǎn)企業(yè),抽樣地點(diǎn)來(lái)自于生產(chǎn)企業(yè)、網(wǎng)購(gòu)和小商店,見(jiàn)表4。這表明,目前化妝品市場(chǎng)上非法添加氯倍他索乙酸酯這種新型糖皮質(zhì)激素的現(xiàn)象已經(jīng)很普遍,并非個(gè)例。使用本方法可以準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)并測(cè)定此非法添加物,為化妝品監(jiān)管提供技術(shù)支撐。典型陽(yáng)性樣品及對(duì)照溶液中氯倍他索乙酸酯的色譜圖見(jiàn)圖5。

表4 陽(yáng)性樣品的樣品信息和含量

圖5 (a)典型陽(yáng)性樣品和(b)對(duì)照溶液中氯倍他索乙酸酯的色譜圖

3 結(jié)論

本研究建立了UPLC-MS/MS測(cè)定化妝品中氯倍他索乙酸酯的檢測(cè)方法。氯倍他索乙酸酯作為一種新型的糖皮質(zhì)激素,非法添加在化妝品中,亦會(huì)危害消費(fèi)者的健康。本文采用乙腈直接提取法對(duì)樣品進(jìn)行前處理,基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行準(zhǔn)確定量,方法簡(jiǎn)單高效,適用于化妝品中常見(jiàn)的膏霜乳、凝膠、泥、貼膜和液體(水)5種基質(zhì)類型化妝品中氯倍他索乙酸酯的高通量篩查以及準(zhǔn)確定性定量。該研究結(jié)果可為化妝品的日常監(jiān)管提供技術(shù)及數(shù)據(jù)支持。