袁靜靜,鄭宇釗,殷婷婕

(中國藥科大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 南京 210000)

幾乎基因組中的任何序列以及轉(zhuǎn)錄組中的每個(gè)編碼和非編碼RNA都有可能通過將外源核酸引入細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)以用于治療目的[1]。在過去的二十年中,已經(jīng)研究了基于基因的療法在治療或預(yù)防多種疾病方面的臨床應(yīng)用[2]。然而,由于核酸在體內(nèi)外穩(wěn)定性差,遞送效率低,極大限制了其成藥性。

基因治療的一個(gè)基本挑戰(zhàn)是開發(fā)安全有效的遞送載體,目前核酸藥物遞送載體可以分為病毒載體和非病毒載體。事實(shí)上,迄今為止進(jìn)行的基因治療臨床試驗(yàn)中,約70%使用了逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒(AAVs)等修飾病毒來遞送核酸藥物[3]。盡管它們大大推進(jìn)了基因治療領(lǐng)域,但病毒載體仍存在一些局限性,比如免疫原性、有限的核酸包裝和載體生產(chǎn)的困難。不同于病毒載體,非病毒納米載體易于制備,具有較低的免疫原性和致癌性[4]。這些制備的納米顆?？梢员Ｗo(hù)核酸免受核酸酶降解,增強(qiáng)核酸藥物的穩(wěn)定性,提高其遞送效率[5]。在這篇綜述中,我們詳細(xì)介紹了基于脂質(zhì)的納米顆粒、聚合物納米顆粒、無機(jī)納米顆粒、外泌體和核酸偶聯(lián)物等非病毒遞送系統(tǒng)的最新進(jìn)展。

1 基于脂質(zhì)的納米粒

基于脂質(zhì)的納米遞送系統(tǒng)是使用最廣泛的非病毒核酸遞送載體,包括脂質(zhì)體、固體脂質(zhì)納米粒和膠束[6]?；谥|(zhì)的納米顆粒具有制備簡單、生物相容性高和免疫原性低等優(yōu)點(diǎn),并且可以通過改變脂質(zhì)組成來實(shí)現(xiàn)納米結(jié)構(gòu)的多功能性[7]。目前,基于脂質(zhì)的非病毒核酸遞送系統(tǒng)已經(jīng)被應(yīng)用于多種疾病的治療。

脂質(zhì)體本質(zhì)上是由具有極性頭部和非極性尾部的磷脂雙層以及穩(wěn)定劑(如膽固醇)組成。由于其兩親性,可以自發(fā)地自組裝成囊泡[8]。由經(jīng)典陽離子脂質(zhì)組成的脂質(zhì)體,如DOTMA、DOTAP和DOPE,已被有效地用于遞送多種核酸藥物。脂質(zhì)體可用于封裝大小從幾個(gè)核苷酸到幾百萬個(gè)核苷酸不等的核酸藥物,以輸送到細(xì)胞中。較小的脂質(zhì)體更有可能逃脫吞噬細(xì)胞的攝取(≤100 nm)[9]。然而,納米粒子表面的正電荷可能會導(dǎo)致血清蛋白的非特異性結(jié)合和免疫刺激。為此,開發(fā)了聚乙二醇化陽離子脂質(zhì)體作為替代品。脂質(zhì)納米粒(Lipid nanoparticles,LNP)由可電離的陽離子脂質(zhì)(ionizablelipids)、中性輔助脂質(zhì)、膽固醇、聚乙二醇修飾的脂質(zhì)(PEGylatedlipid)構(gòu)成[10]。其中可電離脂質(zhì)在保護(hù)核酸免受核酸酶降解方面發(fā)揮主要作用;此外,輔助脂類,如磷脂和膽固醇,可以促進(jìn)制劑穩(wěn)定性和膜融合;PEG化脂質(zhì)可以延長半衰期和增加穩(wěn)定性[11]。不同于脂質(zhì)體,脂質(zhì)納米粒的內(nèi)核區(qū)域呈膠束結(jié)構(gòu);此外,與脂質(zhì)體相比,LNPs表現(xiàn)出更好的動力學(xué)穩(wěn)定性和更堅(jiān)硬的形態(tài)?？呻婋x的LNPs在生理pH值下具有近中性的電荷,但可電離脂質(zhì)上的胺基在低pH值時(shí)變得質(zhì)子化并帶正電荷,從而允許與核酸上帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)組裝。絡(luò)合后,可以將pH值調(diào)節(jié)到中性或生理pH值,以便進(jìn)行給藥。體內(nèi)注射后,可電離的LNPs可以從血液中滲出到靶組織。然后LNPs可以吸附到細(xì)胞表面,并通過內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。帶正電荷的可電離脂質(zhì)有助于內(nèi)體逃逸,并與內(nèi)體脂膜上的負(fù)電荷相互作用,從而導(dǎo)致內(nèi)體不穩(wěn)定,促進(jìn)核酸釋放[4,12]。首個(gè)獲得批準(zhǔn)的RNA干擾(RNA interference,RNAi)治療藥物使用了LNPs遞送系統(tǒng)。然而,脂質(zhì)納米粒在儲存運(yùn)輸和使用等方面還存在不足之處,比如需要在低溫下才能長期保存。

2 聚合物納米粒

陽離子聚合物是另一種常見的非病毒核酸遞送載體。制備聚合物納米?？梢允褂锰烊痪酆衔?殼聚糖、右旋糖酐和環(huán)糊精,或用合成聚合物,如聚乙烯亞胺(PEI)、聚賴氨酸(PLL)、聚酰胺(PAMAM)和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。它們結(jié)構(gòu)的一個(gè)共同特征是分子中存在許多帶正電的基團(tuán),可以通過靜電相互作用與核酸結(jié)合,并將其濃縮成小的納米顆粒[13]。由于它們易于合成和功能化,以及它們的結(jié)構(gòu)多功能性、合成放大的能力、高轉(zhuǎn)染效率、基因免疫原性和優(yōu)異的生物相容性,聚合物納米粒是用于遞送核酸藥物最常用的人工材料之一。納米膠囊和納米球是兩種最普遍的聚合物納米粒類型。這兩種形式都可以分為多種亞類,包括多聚物、多聚體和樹枝狀聚合物[14]。

多聚物由陽離子聚合物組成,如PEI、殼聚糖和可生物降解的聚酯。這些陽離子聚合物附著在NAs上,并通過靜電力使其凝結(jié)成微小、致密的結(jié)構(gòu)。縮合過程是由熵驅(qū)動的,當(dāng)陽離子聚合物與核酸藥物結(jié)合時(shí),多聚物的產(chǎn)生會自發(fā)發(fā)生[15]。當(dāng)制備這些納米粒時(shí),通常所使用的陽離子聚合物要多于核酸,這使納米粒具有正的表面電荷。通過被聚合物包圍并封閉在聚合物基質(zhì)中,可以保護(hù)核酸不被酶降解。

被稱為“多聚體”的聚合物囊泡在形態(tài)上類似于基于脂質(zhì)的囊泡,由兩親性嵌段共聚物產(chǎn)生。兩親性嵌段共聚物的自組裝形態(tài)由其親水性分?jǐn)?shù)(Fhydrophilic)決定。制備多聚體的大多數(shù)方法來源于脂質(zhì)體制備方法[16]。主要包括直接溶解共聚物、成膜再水合、交換溶劑和超聲處理。親水性的核酸藥物,如質(zhì)粒DNA、寡核苷酸和小干擾RNA,可以被包封在聚合物囊泡的親水性核心。

樹枝狀聚合物是一類大分子,既有廣泛的分支,又在大小和形狀上是均勻的。它們的基本結(jié)構(gòu)由中心核心、重復(fù)分支單元和提供適應(yīng)性表面功能的端基組成[17]。通過增加重復(fù)分支單元的數(shù)量來控制樹枝狀物的產(chǎn)生和隨后的球形,其表面或內(nèi)腔上的疏水或靜電相互作用允許藥物和核酸的結(jié)合。樹枝狀聚合物由于幾個(gè)獨(dú)特的特征而優(yōu)于其他陽離子聚合物。樹枝狀聚合物由于其豐富的陽離子電荷而有助于核酸分子的絡(luò)合,結(jié)構(gòu)中的叔胺具有高質(zhì)子海綿容量,這有助于核酸分子的內(nèi)體逃逸,從而增強(qiáng)核酸的治療效果。此外,樹枝狀聚合物的表面修飾可以進(jìn)一步提高包封的治療部分的安全性和穩(wěn)定性。

3 無機(jī)納米顆粒

無機(jī)材料比有機(jī)材料更穩(wěn)定,免疫原性更低,并且易于合成和修飾,因此它們也經(jīng)常被用作基因載體。1960年,第一個(gè)基于磷酸鈣的非病毒基因遞送載體被報(bào)道。經(jīng)過幾十年的發(fā)展,無機(jī)載體涵蓋了更廣泛的范圍,包括常見的金納米顆粒、介孔二氧化硅納米顆粒和氧化鐵納米粒。

金納米粒子由于其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì),如發(fā)達(dá)的表面化學(xué)、較低的免疫原性和可忽略的細(xì)胞毒性,作為非病毒基因遞送載體受到了廣泛關(guān)注[18]。金納粒與核酸可以通過共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)。核酸鏈與AuNPs核(13～15 nm)的共價(jià)鍵是通過硫醇基團(tuán)實(shí)現(xiàn)的[19]。這種方法使用DNA和siRNA都可以精確地連接到金芯或聚合的金芯。AuNPs表面可以通過在其表面的聚陽離子(如PEI或PAMAM)和陰離子核酸藥物之間交替涂覆。為了促進(jìn)納米粒與細(xì)胞表面受體的特定相互作用和附著,還可以將靶向配體修飾到納米粒的表面。NP的有效靶向需要考慮配體的大小、密度、疏水性和親和力等因素。

介孔二氧化硅納米顆粒(MSNP)由于其大的負(fù)載能力、化學(xué)可改性的表面、高的表面積和無毒的特性,已被廣泛用作各種生物分子或藥物的有效細(xì)胞內(nèi)遞送的載體[20]。通常,核酸分子通過弱的非共價(jià)相互作用被裝載到二氧化硅納米顆粒中?？椎拇笮『捅砻婀倌芑潭葘怂嶝?fù)載量及釋放率起著至關(guān)重要的作用。具有小孔的二氧化硅納米顆?？梢詾樾》肿雍怂崽峁┛烧{(diào)的釋放速率,而較大的孔可以提供更高的負(fù)載能力和更快的釋放速率。例如,直徑為100 nm,孔徑2.5～5 nm的二氧化硅納米顆粒適合于傳遞小的siRNA,而直徑為250 nm、孔徑超過15 nm的二氧化硅納米顆粒用于裝載大的pDNA。通過共價(jià)修飾過程,二氧化硅納米粒的負(fù)電荷表面可以變成陽離子表面,這可能會對貨物的裝載方式、蛋白質(zhì)如何黏附在其上以及釋放速度產(chǎn)生重大影響。PEI、樹枝狀陽離子聚合物已被用于修飾二氧化硅納米顆粒的表面,使其能夠吸引和負(fù)載核酸藥物。

氧化鐵納米粒子(IONPs)是磁性Fe3O4或Fe2O3納米晶體,可利用與外部磁場的相互作用開發(fā)磁觸發(fā)藥物遞送系統(tǒng)[21]。由于在特定尺寸下的超順磁特性,IONPs成功地作為核酸藥物治療的遞送載體。它們具有最小的毒性、在表面捕獲生物分子的能力、低的生產(chǎn)成本以及使用外部磁體直接靶向的能力,這使其成為核酸藥物遞送應(yīng)用的優(yōu)秀納米材料。然而,當(dāng)IONPs用作藥物載體時(shí),必須對其進(jìn)行表面修飾以提高其膠體穩(wěn)定性。

4 外泌體

外泌體是生物來源的膜結(jié)合納米級囊泡,已知含有各種分子,例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸,它們有助于外泌體介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的能力[22]。近年來,外泌體被認(rèn)為是一種高效且有前途的核酸藥物遞送載體。與脂質(zhì)納米顆粒和其他傳統(tǒng)的合成遞送系統(tǒng)相比,外泌體具有以下優(yōu)勢:(1)外泌體具有相對較低的細(xì)胞毒性和免疫原性,因?yàn)樗鼈兪堑鞍踪|(zhì)、核酸和脂質(zhì)等貨物的天然載體,并且由于纖連蛋白等膜蛋白,它們具有更好的生物相容性。(2)外泌體在體內(nèi)循環(huán)的時(shí)間比LNPs長,在血漿中表現(xiàn)出高穩(wěn)定性,而LNPs更有可能被巨噬細(xì)胞或網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞清除[23]。例如,Kamerkar等人發(fā)現(xiàn)[24],通過外泌體膜上CD47和信號調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)的結(jié)合,外泌體可以逃脫巨噬細(xì)胞的清除。他們還比較了外泌體和LNPs的遞送效率,發(fā)現(xiàn)外泌體在循環(huán)中的滯留時(shí)間更長。(3)外泌體可以通過多種機(jī)制穿過血腦屏障(BBB)。相比之下,如何用LNP有效地將貨物運(yùn)送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)一直是一個(gè)難題。

然而,外泌體遞送核酸藥物目前還有許多挑戰(zhàn)。首先,最重要的挑戰(zhàn)是大規(guī)模生產(chǎn)具有高質(zhì)量和良好特性的外泌體。第二個(gè)挑戰(zhàn)是提高將核酸藥物裝載到外泌體中的效率并促進(jìn)其靶向效率。第三個(gè)挑戰(zhàn)是在臨床試驗(yàn)中評估治療性外泌體的安全性、免疫原性和生物分布。為了實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用,首先目前的外泌體分離和純化方法仍需優(yōu)化和精簡,以實(shí)現(xiàn)高效、經(jīng)濟(jì)高效和可重復(fù)的生產(chǎn);其次,為了提高外泌體中的治療性RNA水平,應(yīng)該開發(fā)有效的新裝載策略;最后,需要進(jìn)行一系列臨床前研究,如藥效學(xué)和毒性檢查,以防止?jié)撛诘陌踩珕栴},并將副作用降至最低。

5 核酸偶聯(lián)物

核酸偶聯(lián)物是通過將遞送配體共價(jià)連接到核酸藥物上制備而成,通過偶聯(lián)分子(膽固醇、多肽、抗體、核酸適配體等)改變核酸藥物的體內(nèi)分布及代謝動力學(xué)等性質(zhì),幫助核酸進(jìn)入到特定的組織和細(xì)胞內(nèi)[25]。目前已經(jīng)開發(fā)了幾種有前景的遞送系統(tǒng),最先進(jìn)的偶聯(lián)物平臺是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)偶聯(lián)物,獲得批準(zhǔn)進(jìn)入臨床應(yīng)用的GalNAc技術(shù)核酸藥物已有3款[26]。核酸偶聯(lián)物受益于具有最小遞送材料和明顯寬的治療窗口的明確結(jié)構(gòu),并且在提高其效力方面不斷取得進(jìn)展。

但核酸偶聯(lián)物仍然面臨一些遞送挑戰(zhàn),如何增強(qiáng)核酸分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性是其面臨的關(guān)鍵問題[27]。此外,設(shè)計(jì)核酸偶聯(lián)物時(shí)需考慮分子間連接子的設(shè)計(jì)及修飾位置。首先,所選擇的連接子在偶聯(lián)核酸分子和載體時(shí)不會破壞它們的結(jié)構(gòu);第二,連接子需要在細(xì)胞外具有高穩(wěn)定性,以防止血液循環(huán)過程中攜帶的核酸分子丟失;最后,用于偶聯(lián)的連接子不會影響核酸分子的性質(zhì),并且可以使核酸分子在進(jìn)入靶細(xì)胞后與偶聯(lián)物脫離。目前報(bào)道的連接子有二硫鍵、酰胺鍵、硫醚鍵和硫醇-馬來酰亞胺鍵等。其中二硫鍵是一種常用于偶聯(lián)化學(xué)鍵,易于生成,通常在細(xì)胞外表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性,在細(xì)胞質(zhì)中相對較高的還原性環(huán)境很容易被破壞,進(jìn)而釋放偶聯(lián)的核酸分子。Cheng[28]等人設(shè)計(jì)了一個(gè)拮抗miR-155的短antimiR-155序列,并通過二硫鍵將其偶聯(lián)到低pH值插入肽(pHLIP)上。該綴合物可以靶向?qū)嶓w瘤的酸性環(huán)境(pH值約為6)并有效抑制淋巴瘤模型中的miR-155基因的表達(dá)。

6 總結(jié)與展望

近年來,非病毒納米載體在基因治療中的應(yīng)用得到迅速發(fā)展,與病毒載體相比,非病毒納米載體具有許多優(yōu)點(diǎn),包括生物安全風(fēng)險(xiǎn)低、材料來源豐富、可以進(jìn)行多種生物功能修飾、易大規(guī)模生產(chǎn)等。

盡管非病毒納米載體在基因治療方面具有巨大潛力,但其在臨床應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)。首先是負(fù)載核酸藥物的納米載體向靶細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)運(yùn)。納米載體在遞送核酸藥物過程中存在眾多生物屏障。第二個(gè)挑戰(zhàn)是對納米顆粒的合成和功能化進(jìn)行有效和精確的控制。每批納米顆粒的尺寸、表面理化性質(zhì)、靈敏度和特異性應(yīng)該更加可控。此外,納米載體的體內(nèi)生物行為和毒性也是限制其臨床轉(zhuǎn)化的主要問題。因此,非病毒基因治療的廣泛應(yīng)用仍需要進(jìn)一步研究來解決這些問題,并充分發(fā)揮核酸藥物治療的潛力。隨著科學(xué)研究領(lǐng)域跨學(xué)科研究的興起,相信新開發(fā)的非病毒核酸遞送系統(tǒng)將越來越安全有效。