郁兵，王波，何鳳琴

作者單位：1西安文理學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院基因工程重點實驗室，陜西 西安710065；2西安市秦嶺天然產(chǎn)物開發(fā)與抗癌類創(chuàng)新藥物研究重點實驗室，陜西 西安710065

人的皮膚組織在20～25歲以后就會出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，體現(xiàn)為干燥、松弛、皺紋、暗沉，然而隨著社會的發(fā)展，人類對肌膚之美的追求日趨強烈。研究表明，一些具有生物活性的天然產(chǎn)物可以有效護膚、美白、抗衰老，這些成分主要來源于植物、動物和微生物，其中一些植物成分的分子細小，容易被皮膚吸收，還具有長期使用無副作用或副作用小的優(yōu)點［1-2］，已在護膚品領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，而動物成分在抗衰老護膚領(lǐng)域的研究和應(yīng)用還比較少，和植物藥材相比，動物藥材成分往往更為復(fù)雜，與人類組織具有較為相似的組化成分，這些因素有可能致使動物藥在護膚領(lǐng)域具有更為廣闊的應(yīng)用前景，我國傳統(tǒng)藥材鹿茸就是一種很好的抗皮膚衰老藥物。作者在前期研究發(fā)現(xiàn)，將鹿茸制成膏劑外用于衰老模型小鼠皮膚具有很好的抗衰老效果，為此探索比單一鹿茸成分抗衰老效果更佳，且成本較低的抗衰老護膚產(chǎn)品，我們于2020年3月至2021年5月將鹿茸和一些具有抗衰老功效的植物藥——黃芪［3-4］、枸杞［5］、玉竹［6-7］、紅花［8］、天山雪菊［9］等進行復(fù)配，并以自研的納米乳為基質(zhì)，再添加增稠和防腐等成分，試制出一種鹿茸復(fù)方抗衰老乳液，再將該乳液外用于衰老模型小鼠以檢驗其抗皮膚衰老的效果，為開發(fā)以鹿茸為主要成分的抗衰老護膚品進行初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 鹿茸新鮮血茸片（銅川鹿苑實業(yè)有限公司）；黃芪、枸杞、紅花、玉竹（西安老百姓大藥房韓森東路店）；天山雪菊（新疆百草堂醫(yī)藥連鎖經(jīng)營部新華南路店）；D-半乳糖（上海藍季生物）；吐溫80（天津市富宇精細化工有限公司）；無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司）；乙酸乙酯（天津市富宇精細化工有限公司）；黃原膠（天津光復(fù)精細化工研究所）；去離子水（天根生化科技（北京）有限公司）；尼泊金乙酯（天津大茂化學(xué)試劑廠）；尼泊金丁酯（天津大茂化學(xué)試劑廠）；超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒（WST-8法）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；羥脯氨酸試劑盒（堿）（南京建成生物工程研究所）；丙二醛測試盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（博士德生物工程有限公司）；青春復(fù)顏彈力乳液（北京同仁堂麥爾?；瘖y品公司）。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 ELx800酶標儀（美國BioTek Instruments，Inc）；YP5002電子天平（上海衡際科學(xué)儀器有限公司）；FW135中草藥粉碎機（北京永光明醫(yī)療器械有限公司）；YHG-400-S遠紅外干燥機（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；L530臺式離心機（湖南湘儀醫(yī)用儀器開發(fā)有限公司）；GEA-TM2剃毛器［創(chuàng)博環(huán)球（北京）生物科技有限公司］；T5-8W紫外燈（稷山縣安壹啟電商商務(wù)有限公司）。

1.1.3 實驗動物 昆明種小鼠，SPF級，體質(zhì)量（20±2）g，70只，雌雄各半，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供，許可證號：SCXK（陜）2019-001，合格證號61001900003858，本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則。

1.2 方法

1.2.1 鹿茸復(fù)方乳液的配制 乳液是護膚品最常見的一種劑型，本復(fù)方乳液采用納米乳作為基質(zhì)，納米乳是一種由粒徑在10～100 nm的乳滴形成的透明或者半透明液體載藥系統(tǒng)，具有極高的藥物溶解度以及生物利用度，且對水溶性和脂溶性成分都有良好的溶解度，還具有提高藥物穩(wěn)定性的特性［10-11］，經(jīng)多次實驗最終確定納米乳的配制方法為：取4 g吐溫80與29 g無水乙醇攪拌均勻，加入30 g乙酸乙酯，一邊攪拌一邊緩慢加入去離子水，直到形成澄清透明且出現(xiàn)丁達爾效應(yīng)的納米乳液，當乳液由渾濁變?yōu)槌吻鍟r的臨界去離子水量為25 mL。將鹿茸、黃芪、枸杞、玉竹、紅花、天山雪菊以45 ℃烘干12 h，粉碎至200目，按照5∶1∶1∶1∶1∶1的比例混合，將混合粉末按照5%、10%、15%含量分別添加到納米乳液中充分混勻，制備成低、中、高濃度的鹿茸復(fù)方乳液，再添加5%的黃原膠進行增稠，添加0.1%尼泊金乙酯和0.1%尼泊金丁酯作為防腐劑［12］。同樣方法制備10%鹿茸乳液備用。

1.2.2 分組和造模 將70只小鼠按體質(zhì)量均衡隨機法分為空白對照組、模型組、陽性組、鹿茸復(fù)方低劑量組（5%鹿茸復(fù)方乳液）、鹿茸復(fù)方中劑量組（10%鹿茸復(fù)方乳液）、鹿茸復(fù)方高劑量組（15%鹿茸復(fù)方乳液）、鹿茸乳液組（10%鹿茸乳液），每組10只，雌雄各半。除過空白對照組以外的各組注射D-半乳糖聯(lián)合紫外光照射誘導(dǎo)小鼠皮膚衰老模型，D-半乳糖劑量為1 g·kg-1·d-1，紫外燈波長為365 nm，在40 cm高度照射40 min/d，照射前剃除背部毛發(fā)?？瞻讓φ战M也做剃毛處理，注射同體積生理鹽水［13-15］。按上述方法連續(xù)處理42 d后，造模各組皮膚松弛，擠壓時出現(xiàn)細密皺紋，而空白對照組上述特征不明顯，然后對各組予以給藥處理。

1.2.3 外用給藥 空白對照組不予處理，用來和模型組相比對皮膚衰老模型是否誘導(dǎo)成功，其余各組小鼠在背部裸露皮膚選3 cm×5 cm大小區(qū)域，模型組涂抹納米乳0.5 g/d，低劑量組涂抹含5%鹿茸復(fù)方乳液0.5 g/d，中劑量組涂抹含10%鹿茸復(fù)方乳液0.5 g/d，高劑量組涂抹含15%鹿茸復(fù)方乳液0.5 g/d，陽性組我們選擇了一種北京同仁堂出品的“青春復(fù)顏彈力乳液”作為陽性對照，該產(chǎn)品具有滋潤肌膚、緊致去紋、延緩衰老、保濕補水的作用，也按照0.5 g/d外用涂抹，以上各組連續(xù)處理42 d。

1.2.4 皮膚外觀觀察及皮膚樣本的采集 比對給藥后各組小鼠用藥部位皮膚的色澤、光滑程度、皺紋等表觀特征并拍照記錄，然后禁食24 h，將小鼠皮膚清潔后處死小鼠，剪下涂藥部位皮膚，剔除皮下組織，用預(yù)冷的生理鹽水漂洗，濾紙拭干。

1.2.5 皮膚含水率、透明質(zhì)酸含量、羥脯氨酸含量的測定 用直徑2 cm打孔器切取皮膚樣本，精確稱取其濕重，再放入烘箱中以80 ℃烘干12 h，稱其干重，計算皮膚含水率，皮膚含水率=（濕重-干重）/濕重×100%。取皮膚組織100 mg剪碎放入玻璃勻漿器，加入0.9 mL預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液，在冰水中制成勻漿液，3 000 r/min離心20 min，取上清液，按照透明質(zhì)酸試劑盒說明書的所示方法測定透明質(zhì)酸含量。皮膚膠原蛋白含量一般可以通過測定羥脯氨酸來反映，取皮膚組織100 mg剪碎放入試管，加入1 mL水解液，加蓋后95 ℃水浴20 min，按照羥脯氨酸試劑盒說明書所示方法測定羥脯氨酸含量。

1.2.6 SOD活力、丙二醛含量的測定 取皮膚組織100 mg剪碎放入勻漿器，加入0.9 mL預(yù)冷的生理鹽水，在冰水中制成勻漿液，3 000 r/min離心10 min，取上清液，按照SOD試劑盒說明書所示方法測定SOD活力。取皮膚組織100 mg剪碎，加入0.9 mL預(yù)冷的生理鹽水，在冰水中制成勻漿液，按照丙二醛試劑盒說明書所示方法測定丙二醛含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用來表示，不同組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠皮膚表觀特征 造模42 d后，與空白對照組小鼠比較，模型組小鼠的皮膚明顯松弛，推擠后皺褶較多，體毛再生較慢，而對照組上述變化不明顯。再給藥42 d后，鹿茸復(fù)方低、中、高劑量組、陽性組、鹿茸乳液組與模型組相比，在皮膚松弛、皺褶等方面都有所改善。

2.2 小鼠皮膚含水率、透明質(zhì)酸、羥脯氨酸含量測定結(jié)果 與空白對照組比較，模型組小鼠皮膚含水率、透明質(zhì)酸及羥脯氨酸含量均顯著降低（P＜0.05），表明皮膚衰老模型制備成功。和模型組比較，鹿茸復(fù)方低、中、高劑量各組皮膚的含水率和羥脯氨酸含量都顯著提高（P＜0.05）；低劑量組透明質(zhì)酸含量較模型組提高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），中、高劑量組皮膚的透明質(zhì)酸含量都顯著提高（P＜0.05）。和陽性組比較，鹿茸復(fù)方低、中、高劑量各組皮膚含水率均顯著高于陽性組（P＜0.05）；中劑量組皮膚的透明質(zhì)酸和羥脯氨酸含量高于陽性組但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），高劑量組的透明質(zhì)酸和羥脯氨酸含量顯著高于陽性組（P＜0.05）。和鹿茸乳液組比較，鹿茸復(fù)方中、高劑量組皮膚含水率高于鹿茸乳液組但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；鹿茸復(fù)方中劑量組皮膚的透明質(zhì)酸含量和羥脯氨酸含量與鹿茸乳液組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），鹿茸復(fù)方高劑量組的透明質(zhì)酸含量和羥脯氨酸含量顯著高于鹿茸乳液組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠皮膚組織含水率、透明質(zhì)酸含量、羥脯氨酸含量的測定/

注：①與模型組比較，P＜0.05。②與陽性組比較，P＜0.05。③與鹿茸乳液組比較，P＜0.05。

組別空白對照組模型組鹿茸復(fù)方低劑量組鹿茸復(fù)方中劑量組鹿茸復(fù)方高劑量組陽性組鹿茸乳液組F值P值羥脯氨酸含量/（μg/mg）0.39±0.12①②③0.16±0.21②③0.35±0.12①0.46±0.18①0.57±0.23①②③0.45±0.29①0.46±0.10①151.84＜0.001鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 10含水率/%78.93±5.32①②③50.44±13.77③67.74±11.37②③72.76±8.13①②76.00±11.13①②53.23±6.62③72.30±6.09①②92.01 0.012透明質(zhì)酸含量/（μg/mg）10.55±0.95①②③6.87±2.34②③7.20±3.76①②③8.44±2.20①9.62±2.94①②③8.07±3.69①8.40±2.13①137.76 0.009

2.3 對小鼠皮膚SOD活力、丙二醛含量的影響測定 與空白對照組比較，模型組小鼠皮膚SOD活力顯著下降（P＜0.05），丙二醛含量顯著上升（P＜0.05）。與模型組比較，鹿茸復(fù)方低、中、高劑量組的SOD活力顯著提高（P＜0.05），丙二醛含量都顯著降低（P＜0.05）。和陽性組比較，鹿茸復(fù)方低、中、高劑量各組的SOD活力均顯著高于陽性組（P＜0.05），丙二醛含量均顯著低于陽性組（P＜0.05）。和鹿茸乳液組比較，鹿茸復(fù)方低、中劑量組SOD活力均顯著低于鹿茸乳液組（P＜0.05），鹿茸復(fù)方高劑量組SOD活力顯著高于鹿茸乳液組（P＜0.05）；鹿茸復(fù)方低劑量組丙二醛含量低于鹿茸乳液組但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），鹿茸復(fù)方中、高劑量組丙二醛含量均顯著低于鹿茸乳液組（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠皮膚組織超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛含量的測定/

注：①與模型組比較，P＜0.05。②與陽性組比較，P＜0.05。③與鹿茸組比較，P＜0.05。

丙二醛含量/（nmol/mL）3.41±0.67①②③9.76±6.13②③5.05±2.59①②③4.04±1.17①②③3.89±2.33①②③6.40±2.13①③5.62±1.57①②184.32＜0.001組別空白對照組模型組鹿茸復(fù)方低劑量組鹿茸復(fù)方中劑量組鹿茸復(fù)方高劑量組陽性組鹿茸乳液組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 10 SOD活力/（μ/mg）158.67±15.91①②③48.11±1.83②③75.94±4.05①②③107.34±4.58①②③143.33±8.50①②③57.91±2.25①③129.39±9.09①②218.80＜0.001

3 討論

一般認為，隨著年齡的增長，皮膚組織的自由基含量增多，過量的自由基破壞成纖維細胞的細胞膜、線粒體、核酸等細胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致膠原蛋白合成減少，透明質(zhì)酸含量下降，皮膚含水率下降，而紫外線則是導(dǎo)致皮膚衰老的外在誘因，過量紫外線促使產(chǎn)生過氧化脂質(zhì)，過氧化脂質(zhì)使膠原蛋白交聯(lián)，皮膚失去彈性產(chǎn)生皺紋，過氧化脂質(zhì)在氧化酶作用下還可以分解成丙二醛，與蛋白質(zhì)反應(yīng)形成褐色素，造成皮膚色斑和暗沉，紫外線造成的皮膚細胞損傷還會引起膠原蛋白和透明質(zhì)酸含量的減少［16-20］。中藥主要通過清除自由基、調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌、調(diào)節(jié)免疫功能、保護和修復(fù)DNA、延緩端粒的縮短等機制實現(xiàn)抗衰老［19］。鹿茸是梅花鹿處于旺盛生長階段的幼角，每天最多可生長2～3 cm，其內(nèi)部富含多種促進生長的成分，鹿茸抗衰老的有效成分包括蛋白多肽類、氨基酸、糖類、生物胺類、甾體類、脂類和無機元素。蛋白多肽類是鹿茸最主要的活性成分，與抗衰老有關(guān)的肽類主要是酶類和生長因子類，酶類包括具有抗氧化、抗衰老作用的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、單胺氧化酶等，生長因子主要是胰島素樣生長因子、表皮生長因子等，這些物質(zhì)能夠促進皮膚成纖維細胞的功能，增加膠原蛋白和透明質(zhì)酸的合成。鹿茸中的糖類包括硫酸軟骨素、酸性黏多糖、中性糖、半乳糖胺等，這些成分往往具有抗氧化或者保濕的作用。鹿茸多胺可以抗脂質(zhì)過氧化，促進核酸和蛋白質(zhì)合成。鹿茸中的甾體類包括雌二醇、膽甾醇、5a-雄甾烷-1，3-二酮、睪丸酮、膽甾-3，5-二烯，5a-膽甾-7-烯-3-酮等成分，這些激素類成分能夠抑制黑色素細胞絡(luò)氨酸酶活性、促進成纖維細胞增生和增加膠原蛋白和透明質(zhì)酸合成、抑制炎癥形成、延緩皮膚衰老。研究證實外用全組分鹿茸可以起到很好的抗皮膚衰老效果，其抗皮膚衰老功效是由所含的多種組份互相協(xié)同而產(chǎn)生［20-21］。而黃芪、枸杞、紅花，玉竹、天山雪菊這些藥物富含酮、酚、多糖等活性成分，可以有效清除自由基，增強SOD活力，降低過氧化脂質(zhì)，促進膠原蛋白合成［9-15］，因此將這些中藥材合理配伍，可能會幫助我們開發(fā)出較單一藥材效果更好的抗衰老護膚產(chǎn)品。本研究表明，5%鹿茸復(fù)方抗衰老乳液，在提高衰老模型小鼠的皮膚含水率、羥脯氨酸含量、增強SOD活力、降低丙二醛含量等四個指標具有明顯效果（P＜0.05），在提高含水率和增強SOD活力兩個指標上略優(yōu)于陽性組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。10%鹿茸復(fù)方抗衰老乳液即可在提高皮膚含水率、透明質(zhì)酸、羥脯氨酸含量、增強SOD活力、降低丙二醛含量等全部五個指標都具有明顯效果（P＜0.05），而且各指標均優(yōu)于陽性組（P＜0.05）。10%鹿茸復(fù)方乳液在提高衰老模型小鼠的皮膚含水率、透明質(zhì)酸、羥脯氨酸含量三個指標上，與鹿茸乳液組的效果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），降低丙二醛含量的效果顯著優(yōu)于鹿茸乳液組（P＜0.05），增強SOD活力方面10%鹿茸乳液優(yōu)于10%鹿茸復(fù)方乳液（P＜0.05），但考慮到和模型組比較，鹿茸復(fù)方低、中、高劑量組均已達到顯著提高SOD活力的效果（P＜0.05），所以總體來說，10%鹿茸復(fù)方乳液的抗衰老效果相當于10%鹿茸乳液，但是減少了一半的鹿茸用量，有利于產(chǎn)品成本的控制。

綜上所述，外用10%鹿茸復(fù)方乳液具有顯著的抗皮膚衰老功效，且抗衰老效果總體優(yōu)于陽性藥物，相當于10%鹿茸乳液，且成本較低，因此10%的鹿茸復(fù)方乳液為該組方的最佳濃度，在后續(xù)的研究中我們將對本配方做進一步優(yōu)化。