任翠翠 ，李俊峰 ，呂佳佳 ，葉凱 ，劉子源 ，黃芊 ，竇建衛(wèi)

1.西安市第一醫(yī)院，陜西 西安 710002； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.邛崍?zhí)煦y制藥有限公司，四川 邛崍 611530； 4.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西 西安 710061；5.西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710021

世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球新增癌癥中，乳腺癌（11.7%）首次超過(guò)肺癌（11.4%）成為全球新確診人數(shù)最多的癌癥[1]。目前乳腺癌主要以手術(shù)為主，并配合放療、化療、免疫及內(nèi)分泌治療等[2-3]。中醫(yī)治療乳腺癌積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，《外科癥治全生集》記載陽(yáng)和湯用于治療乳巖，乳巖歸于陰疽，屬陰證、寒證，病機(jī)主要為陰寒凝結(jié)，氣血凝滯，故提出以陽(yáng)和湯加土貝母的方法治療乳腺癌[4]。近年來(lái)，關(guān)于陽(yáng)和湯治療乳腺癌的臨床及基礎(chǔ)研究也屢見(jiàn)報(bào)道[5-7]，然其機(jī)制不甚明了。

研究發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞凋亡有關(guān)的STAT1/p53信號(hào)通路是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)和湯含藥血清可顯著抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞BT549增殖及遷移[9]。在此基礎(chǔ)上，本研究以STAT1/p53信號(hào)通路為切入點(diǎn)，觀察陽(yáng)和湯含藥血清對(duì)BT549細(xì)胞形態(tài)、凋亡和周期的影響，探討陽(yáng)和湯治療三陰性乳腺癌的具體作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用和后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞

SPF級(jí)雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵守西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)指導(dǎo)原則與要求。人三陰性乳腺癌細(xì)胞BT549，購(gòu)自上海晶都生物技術(shù)有限公司。

1.2 藥物及制備

陽(yáng)和湯（熟地黃30 g，肉桂3 g，麻黃2 g，鹿角膠9 g，芥子6 g，姜炭2 g，甘草3 g，土貝母15 g），飲片購(gòu)自北京同仁堂西安門(mén)店，經(jīng)西安交通大學(xué)藥學(xué)院竇建衛(wèi)副教授鑒定，符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。鹿角膠先加水1 000 mL煎煮1 h，再加入熟地黃、肉桂、芥子、姜炭、甘草、土貝母繼續(xù)煎煮30 min，后下麻黃，煎煮10 min，取濾液，藥渣加水600 mL再煎煮20 min，合并2次藥液，濃縮至原藥材濃度1.4 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?-氟尿嘧啶注射液，天津金耀，批號(hào)12020959，0.25 g/支。

1.3 主要試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司，貨號(hào)SH30809.01），胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)M3851），胰酶、青霉素-鏈霉素雙抗（美國(guó)HyClone公司，批號(hào)分別為SH3004201、SV30010），信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）1抗體（美國(guó)CST公司，貨號(hào)#9176），STAT3抗體（武漢三鷹生物，貨號(hào)#10253），p53抗體（武漢三鷹生物，貨號(hào)#60283），Bax抗體（美國(guó)CST公司，貨號(hào)#89477），DAPI染色液（江蘇凱基生物，貨號(hào)KGA215），細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（福州飛凈生物，批號(hào)分別為PH0539、PH0530）。

倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號(hào)BX53），電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，型號(hào)JY300C），細(xì)胞恒溫恒壓培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司，型號(hào)TC 2323），全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（美國(guó)Thermo Scientific公司，型號(hào)HT2型），低溫冰箱（青島海爾公司，型號(hào)BCD-458WDVMU1），超低溫冰箱（青島海爾，型號(hào)DW-40L278），離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司，型號(hào)Biofugeprimo R），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司，型號(hào)FACSCalibur）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 含藥血清制備

根據(jù)體質(zhì)量將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陽(yáng)性藥組及陽(yáng)和湯低、中、高劑量組，每組8只。陽(yáng)和湯低、中、高劑量組按4.5、9、18 g/kg灌胃（相當(dāng)于臨床成人劑量的5、10、20倍），陽(yáng)性藥組尾靜脈注射5-氟尿嘧啶注射液（0.125 g/5 mL）15 mg/kg，空白對(duì)照組和陽(yáng)性藥組予蒸餾水灌胃，灌胃體積10 mL/kg，每日2次，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離血清，56 ℃水浴30 min滅活，分裝，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將胎牛血清與RPMI-1640培養(yǎng)基以1∶9比例混合，再按總體積的1%加入雙抗搖勻，配制成完全培養(yǎng)基。BT549細(xì)胞復(fù)蘇或傳代后，每培養(yǎng)瓶（25 cm2）加完全培養(yǎng)基4 mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陽(yáng)性藥組及陽(yáng)和湯低、中、高劑量組，將大鼠血清分別加空白培養(yǎng)基稀釋，配制成10%含藥血清，用于干預(yù)細(xì)胞。

2.3 DAPI染色

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×106個(gè)/孔接種至6孔板，待細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基，加入相應(yīng)含藥血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞，每孔加入DAPI染液100 μL，避光孵育10～15 min，棄去染色液，PBS漂洗，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種至6孔板中，每孔約1×106個(gè)，培養(yǎng)12 h后，棄去原培養(yǎng)基，血清饑餓法繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入相應(yīng)含藥血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，棄去舊培養(yǎng)基，PBS洗滌，胰酶消化細(xì)胞1 min，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10 mL離心管，PBS洗滌2次，1 200 r/min離心4.5 min，收集細(xì)胞，加入Binding Buffer 450 μL、Annexin V-FITC溶液5 μL、PI溶液10 μL充分混勻，室溫避光反應(yīng)10～15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，每孔約1×106個(gè)，培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，棄去原培養(yǎng)基，血清饑餓法培養(yǎng)24 h，加入相應(yīng)含藥血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。PBS洗滌，胰酶消化細(xì)胞，1 200 r/min離心4.5 min，細(xì)胞用PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×106個(gè)/mL，取1 mL細(xì)胞懸液，1 200 r/min離心4.5 min，吸去上清液，沉淀用PBS 300 μL重懸，加入無(wú)水乙醇，4 ℃固定過(guò)夜，離心，棄固定液，用RNase A液100 μL重懸細(xì)胞，37 ℃水浴30 min，加PI溶液400 μL充分混勻，4 ℃避光放置30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

2.6 qRT-PCR檢測(cè)

將BT549細(xì)胞接種于6孔板，每孔約5×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，棄去原培養(yǎng)基，血清饑餓法培養(yǎng)24 h，加入相應(yīng)含藥血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，取RNA 5 μg反轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.7 Western blot檢測(cè)

細(xì)胞在25 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)12 h后，棄去原培養(yǎng)基，血清饑餓法繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入相應(yīng)含藥血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，預(yù)冷PBS洗細(xì)胞1次，加入RIPA裂解工作液200 μL提取蛋白，冰上孵育5 min，收集細(xì)胞，4 ℃、12 000×g離心5 min，BCA法蛋白定量，加5×蛋白上樣緩沖液，沸水滅活5 min，凝膠電泳（90 V、30 min，120 V、2 h），轉(zhuǎn)膜（200 mA、1.5 h），血清封閉2 h，加STAT1、STAT3、p53、Bax一抗（均為1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，加二抗（1∶10 000），孵育2 h，TBST洗滌，加發(fā)光劑避光反應(yīng)3 min，顯影儀顯影，Image J軟件檢測(cè)條帶灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 陽(yáng)和湯對(duì)BT549細(xì)胞形態(tài)的影響

空白對(duì)照組BT549細(xì)胞胞核邊緣清晰、著色均勻；陽(yáng)和湯低、中、高劑量組和陽(yáng)性藥組BT-549細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞邊緣不規(guī)則、細(xì)胞核深染、凋亡小體等典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，且陽(yáng)和湯高劑量組凋亡更明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組BT549細(xì)胞形態(tài)（DAPI染色，×500）

4.2 陽(yáng)和湯對(duì)BT549細(xì)胞凋亡的影響

與空白對(duì)照組比較，陽(yáng)性藥組及陽(yáng)和湯低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組BT549細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）

表2 各組BT549細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）

注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01

組別空白對(duì)照組陽(yáng)性藥組陽(yáng)和湯低劑量組陽(yáng)和湯中劑量組陽(yáng)和湯高劑量組n 6 6 6 6 6凋亡率4.85±0.53 21.48±1.52**7.88±0.67**12.65±0.61**17.52±0.90**

4.3 陽(yáng)和湯對(duì)BT549細(xì)胞周期的影響

與空白對(duì)照組比較，陽(yáng)性藥組及陽(yáng)和湯低、中、高劑量組G0/G1期細(xì)胞比例增加，G2/M期細(xì)胞比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組BT549細(xì)胞周期分布比較（±s，%）

表3 各組BT549細(xì)胞周期分布比較（±s，%）

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別空白對(duì)照組陽(yáng)性藥組陽(yáng)和湯低劑量組陽(yáng)和湯中劑量組陽(yáng)和湯高劑量組n 6 6 6 6 6 G0/G1期47.11±4.12 72.38±6.25**55.26±5.09*65.91±5.95**69.87±5.81**S期16.15±2.12 13.12±2.66 12.61±2.08 15.03±2.16 13.48±1.98 G2/M期36.74±3.58 14.50±1.75**32.13±3.15*19.06±2.65**16.65±2.43**

4.4 陽(yáng)和湯對(duì)BT549細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1、p53 mRNA表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，陽(yáng)性藥組及陽(yáng)和湯高劑量組細(xì)胞STAT1 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01），陽(yáng)性藥組及陽(yáng)和湯中、高劑量組細(xì)胞p53 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)表4。

表4 各組BT549細(xì)胞STAT1、p53 mRNA表達(dá)比較（±s）

表4 各組BT549細(xì)胞STAT1、p53 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別空白對(duì)照組陽(yáng)性藥組陽(yáng)和湯低劑量組陽(yáng)和湯中劑量組陽(yáng)和湯高劑量組n 3 3 3 3 3 STAT1 1.00±0.00 2.72±0.34**1.48±0.09 1.54±0.38 2.19±0.32**p53 1.00±0.00 2.88±0.28**1.16±0.33 2.08±1.34*2.23±0.12**

4.5 陽(yáng)和湯對(duì)BT549細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1/3、p53、Bax蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，陽(yáng)性藥組及陽(yáng)和湯低、中、高劑量細(xì)胞p53、Bax蛋白表達(dá)顯著升高，STAT3蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01）；陽(yáng)性藥組及陽(yáng)和湯中、高劑量組細(xì)胞STAT1蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖2、表5。

圖2 各組BT549細(xì)胞STAT1、STAT3、p53、Bax蛋白免疫印跡

表5 各組BT549細(xì)胞STAT1、STAT3、p53、Bax蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 各組BT549細(xì)胞STAT1、STAT3、p53、Bax蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別空白對(duì)照組陽(yáng)性藥組陽(yáng)和湯低劑量組陽(yáng)和湯中劑量組陽(yáng)和湯高劑量組n 3 3 3 3 3 STAT1 0.57±0.02 1.22±0.03**0.64±0.09 0.75±0.03**0.88±0.03**STAT3 1.24±0.04 0.39±0.03**0.62±0.04**0.45±0.03**0.40±0.03**p53 0.48±0.02 1.13±0.07**0.68±0.08*0.68±0.09*1.09±0.06**Bax 0.29±0.02 1.02±0.13**0.52±0.07*0.77±0.09**0.84±0.07**

5 討論

三陰性乳腺癌是乳腺癌中最具侵襲性的亞型，其特點(diǎn)是雌激素受體、孕激素受體和原癌基因HER-2呈陰性表達(dá)。雖然三陰性乳腺癌占全部乳腺癌患者的15%～20%，但因其對(duì)HER-2選擇性和內(nèi)分泌治療無(wú)效，缺乏特異性靶點(diǎn)，常規(guī)治療效果差。

隨著細(xì)胞和分子生物學(xué)的發(fā)展，乳腺癌的分子生物學(xué)機(jī)制研究已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)[10]。細(xì)胞凋亡是機(jī)體程序性地清除部分多余、對(duì)機(jī)體有害細(xì)胞的自我防御機(jī)制，細(xì)胞的異常增殖和分化，以及細(xì)胞凋亡異常都可影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[11-12]。STAT1是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)樞紐的一員，影響細(xì)胞的正?；顒?dòng)功能，在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖與凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程及癌癥相關(guān)免疫編輯等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13]。p53是重要的轉(zhuǎn)錄因子，可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。野生型p53（wtp53）能夠阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、增加腫瘤對(duì)放化療的敏感性，被視為重要的腫瘤抑制基因。STAT1能與p53形成絡(luò)合物，在p53依賴的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄活性，還可作為共活化劑增強(qiáng)p53介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄活性，從而加重DNA損傷和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。STAT1通過(guò)調(diào)節(jié)p53的腫瘤抑制功能，從而對(duì)腫瘤放療敏感性產(chǎn)生影響。STAT3是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，可激活癌基因，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。在乳腺癌中，wtp53借助其下游因子Bax、Bcl-2等引起線粒體外膜通透性改變，形成凋亡復(fù)合體，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[15]。

Bcl-2是一種癌基因，具有抑制凋亡作用[16]。Bax是最常見(jiàn)的促凋亡基因[15]，正常情況下，Bax位于胞質(zhì)，在受到凋亡信號(hào)刺激后，Bax會(huì)移位到線粒體膜，并形成Bax/Bcl-2二聚體，促使線粒體膜形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放[17]，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。激活的STAT1（白細(xì)胞介素、生長(zhǎng)激素等激活）能促進(jìn)Bax/Bcl-2二聚體解體，加速Bax蛋白釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察陽(yáng)和湯含藥血清對(duì)BT549細(xì)胞STAT1、STAT3及下游p53、Bax等關(guān)鍵凋亡蛋白表達(dá)的影響，探討陽(yáng)和湯治療乳腺癌的潛在機(jī)制。

結(jié)果顯示，低、中、高劑量陽(yáng)和湯含藥血清干預(yù)BT549細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞比例增加，G2/M期細(xì)胞比例降低，說(shuō)明陽(yáng)和湯可將BT549細(xì)胞的周期抑制在G0/G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。凋亡檢測(cè)中，隨著陽(yáng)和湯含藥血清濃度增加，細(xì)胞凋亡率增加，表明陽(yáng)和湯能誘導(dǎo)乳腺癌BT549細(xì)胞凋亡。通過(guò)Western blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，陽(yáng)和湯各劑量組STAT1、p53、Bax表達(dá)升高，STAT3表達(dá)降低，表明陽(yáng)和湯含藥血清可通過(guò)激活STAT1/p53信號(hào)通路及抑制STAT3，進(jìn)一步上調(diào)下游促凋亡蛋白Bax表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)采用血清藥理學(xué)方法，以STAT1/p53信號(hào)通路為切入點(diǎn)，研究陽(yáng)和湯治療三陰性乳腺癌的分子機(jī)制，可為其臨床應(yīng)用和后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)支持。但三陰性乳腺癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多因素、多靶點(diǎn)的共同作用，對(duì)其機(jī)制的進(jìn)一步了解仍需后續(xù)深入研究。