張媛媛 ，朱向東 ，蘇菲 ，關曉文 ，翟艷會 ，段永強 ，梁建慶

1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉化重點實驗室，糖尿病實驗室，甘肅 蘭州 730000；2.寧夏醫(yī)科大學，寧夏 銀川 750004

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種以高血糖為主要癥狀的糖脂代謝紊亂性疾病。T2DM機制主要涉及胰島β細胞功能紊亂、胰島素抵抗、炎癥反應和氧化應激反應[1]。研究表明，氧化應激會引起胰島β細胞功能損傷及外周組織胰島素抵抗，最終導致糖尿病[2]。肝臟作為胰島素的重要靶器官，對機體糖脂代謝平衡有重要作用[3]。目前認為，肝臟胰島素抵抗與氧化應激相關。動物實驗表明，葛根芩連湯可有效改善T2DM大鼠胰島素抵抗[4-5]。本研究旨在探究葛根芩連湯對T2DM小鼠肝臟氧化應激的影響，以期為葛根芩連湯防治T2DM提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級db/db小鼠75只、db/m小鼠15只，8周齡，體質(zhì)量（20±5）g，常州卡文斯實驗動物有限公司提供，動物許可證號SCXK（蘇）2016-0010。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級屏障實驗室，溫度21～25 ℃，相對濕度50%～60%，12 h明暗交替，自由攝食飲水。適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。本實驗經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準（2020-280）。

1.2 藥物及制備

葛根芩連湯（葛根、黃芩、黃連、炙甘草），飲片購自甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院。上述飲片按8∶3∶3∶2比例配伍[6]，葛根先煎30 min，再與其余藥物共煎30 min，紗布過濾，殘渣加8倍量水繼續(xù)煎煮30 min，合并2次濾液，使用旋轉蒸發(fā)儀濃縮成含原藥材3.19、1.91、0.69 g/mL濃縮液。鹽酸二甲雙胍片，中美上海施貴寶股份有限公司，0.5 g/片，批號ABS5857。將藥片粉碎，用蒸餾水配制成濃度為0.02 g/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

BCA試劑盒，北京索萊寶有限科技公司，貨號20220117；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抗體、p-AMPK抗體，美國GeneTex公司，批號GTX103487、GTX109608；沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）抗體、叉頭框蛋白1（FoxO1）抗體、p-FoxO1抗體，英國Abcam公司，批號ab189494、ab52857、ab259337；GAPDH抗體、HRP羊抗兔IgG（H+L）抗體，美國Immunoway公司，批號ym3215、RS0002；ECL超敏發(fā)光液、PVDF膜，Millpore公司，批號36208ES60、R6KA9704H；RNA提取液、RT First Strand cDNA Synthesis Kit、2×SYBR Green qPCR Master Mix（None ROX），武漢Servicebio公司，批號G3013、G333、G3320；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20220117、20220114、22020117；糖化血紅蛋白（HbA1c）測定試劑盒，美國PTS公司，批號8193302401。Advantage型血糖儀（德國羅氏公司），Power PacTMBasic垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司），Gelwiew 6000Plus凝膠成像儀（廣州博鷺騰），CFX熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad），NanoDrop2000超微量分光光度計（美國Thermo）。

2 實驗方法

2.1 分組及給藥

將75只db/db小鼠按血糖隨機分為模型組、二甲雙胍組和葛根芩連湯高、中、低劑量組，每組15只，另取15只db/m小鼠作為空白組。給藥組根據(jù)臨床成人常用劑量，并參照人與動物體表面積計算小鼠等效劑量，葛根芩連湯高、中、低劑量組分別予31.9、19.1、6.9 g/kg葛根芩連湯藥液灌胃，二甲雙胍組予0.2 g/kg二甲雙胍溶液灌胃，空白組和模型組予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)12周。

2.2 取材

末次給藥后禁食12 h，摘眼球取血，血清常溫靜置1.5 h，4 ℃、3 000×g離心10 min，血清置-20 ℃冰箱保存。冰上分離肝臟，用預冷生理鹽水清洗，濾紙吸干水分，放于凍存管中，置-80 ℃冰箱保存。

2.3 體質(zhì)量及血糖檢測

藥物干預期間，每周同一時間測量小鼠體質(zhì)量，禁食6 h后尾靜脈采血，用血糖儀測定血糖，末次給藥后禁食12 h，取尾靜脈血檢測空腹血糖（FPG）及糖化血紅蛋白（HbA1c）含量。

2.4 HE染色

將肝組織用甲醛固定，全自動脫水機脫水，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下拍照觀察。

2.5 氧化應激相關指標測定

取適量肝組織，預冷PBS漂洗，稱定質(zhì)量，加入預冷PBS 5～10 mL，用高通量冷凍組織研磨器（70 Hz/min）冰上研磨，勻漿液4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液，用化學發(fā)光免疫分析法檢測MDA含量和GSH-Px、CAT活性。

2.6 Western blot檢測

剪取0.05～0.1 g肝臟，預冷生理鹽水漂洗，加入RIPA裂解液和磷酸酶抑制劑，用高通量冷凍組織研磨器研磨，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA蛋白定量試劑盒進行定量分析后上樣，蛋白經(jīng)電泳分離，300 mA恒流濕轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉（磷酸化蛋白使用5%BSA），室溫輕搖封閉2 h，TBST洗膜3次，加入AMPK、p-AMPK、SIRT1、FoxO1、p-FoxO1一抗（均為1∶1 000）和GAPDH一抗（1∶5 000），室溫輕搖1 h后放入4 ℃冰箱過夜。次日復溫30 min，TBST洗膜8 min×4次，加入二抗，37 ℃輕搖2 h，TBST洗膜8 min×4次，ECL顯色后曝光。采用Image J 1.8.0軟件進行分析，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達量。

2.7 RT-qPCR檢測

取肝組織100 mg，Trizol法提取總RNA。微量分光光度計測定RNA純度及濃度。將總RNA反轉錄為互補cDNA，進行PCR，反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對各基因mRNA表達進行相對定量分析。引物由寶日醫(yī)生物技術有限公司設計合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，符合正態(tài)分布組間比較用方差分析，方差不齊用秩和檢驗。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 葛根芩連湯對模型小鼠體質(zhì)量的影響

與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組和葛根芩連湯各劑量組小鼠體質(zhì)量顯著降低（P<0.05，P<0.01）；與二甲雙胍組比較，葛根芩連湯高劑量組小鼠體質(zhì)量顯著降低（P<0.05）。見表2。

表2 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，g）

表2 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，g）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與二甲雙胍組比較，▽P<0.05

組別空白組模型組二甲雙胍組葛根芩連湯高劑量組葛根芩連湯中劑量組葛根芩連湯低劑量組只數(shù)8 8 8 8 8 8劑量/（g/kg）0.2 31.9 19.1 6.9體質(zhì)量23.81±1.17 44.60±2.00**37.81±3.23##33.09±5.01##▽38.55±3.18##39.80±2.42#

4.2 葛根芩連湯對模型小鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠FPG和HbA1c含量均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組和葛根芩連湯各劑量組小鼠FPG和HbA1c含量均顯著降低（P<0.05，P<0.01）；與二甲雙胍組比較，葛根芩連湯高劑量組小鼠FPG和HbA1c含量均顯著降低（P<0.05）。見表3。

表3 各組小鼠FPG和HbA1c含量比較（±s）

表3 各組小鼠FPG和HbA1c含量比較（±s）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與二甲雙胍組比較，▽P<0.05

組別空白組模型組二甲雙胍組葛根芩連湯高劑量組葛根芩連湯中劑量組葛根芩連湯低劑量組只數(shù)8 8 8 8 8 8劑量/（g/kg）0.2 31.9 19.1 6.9 FPG/（mmol/L）5.98 ±1.02 30.66±1.17**18.80±5.43##13.70±8.30##▽16.36±4.55##17.15±7.06##HbA1c/（mg/mL）4.31 ±0.06 10.06 ±0.73**7.30 ±1.08##6.29 ±0.86##▽7.24 ±0.35##8.13 ±1.15#

4.3 葛根芩連湯對模型小鼠肝組織病理變化的影響

空白組小鼠肝組織結構正常，被膜完整，肝小葉分葉不明顯，肝索排列較整齊。與空白組比較，模型組小鼠可見較多肝細胞空泡變性，且少量肝細胞脂肪變性，胞質(zhì)內(nèi)含透明圓形脂滴，肝細胞點狀壞死，胞核固縮崩解。與模型組比較，葛根芩連湯低劑量組小鼠病變程度略減輕，有少量肝細胞空泡變性，較多肝細胞脂肪變性，內(nèi)含大小不一脂滴，肝竇輕微淤血；二甲雙胍組和葛根芩連湯中、高劑量組明顯減輕。見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織形態(tài)（HE染色，×200）

4.4 葛根芩連湯對模型小鼠肝組織氧化應激相關指標的影響

與空白組比較，模型組小鼠肝組織MDA含量顯著增加，GSH-Px、CAT活性顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組和葛根芩連湯各劑量組小鼠肝組織MDA含量顯著減少，GSH-Px、CAT活性顯著升高（P<0.05，P<0.01）；與二甲雙胍組比較，葛根芩連湯高、中劑量組小鼠肝組織MDA含量顯著減少，GSH-Px、CAT活性顯著升高（P<0.05）。見表4。

表4 各組小鼠肝組織MDA、GSH-Px、CAT水平比較（±s）

表4 各組小鼠肝組織MDA、GSH-Px、CAT水平比較（±s）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與二甲雙胍組比較，▽P<0.05

組別空白組模型組二甲雙胍組葛根芩連湯高劑量組葛根芩連湯中劑量組葛根芩連湯低劑量組只數(shù)3 3 3 3 3 3劑量/（g/kg）0.2 31.9 19.1 6.9 MDA/（nmol/g）14.01 ±0.37 31.79±0.44**25.99±1.29##15.85 ±0.42##▽20.54±1.31##▽21.81±0.47##▽GSH-Px/（mol/L）0.14±0.01 0.03±0.01**0.06±0.01##0.09±0.01##▽0.11±0.01#▽0.06±0.01##CAT/（U/mg）91.71 ±2.02 57.52±1.66**67.91±1.43##84.58±1.05##▽79.98±0.37##▽74.13±2.59##▽

4.5 葛根芩連湯對模型小鼠肝組織AMPK、SIRT1、FoxO1蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組小鼠肝組織AMPK、p-AMPK、SIRT1蛋白表達降低，F(xiàn)oxO1、p-FoxO1蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組和葛根芩連湯高、中劑量組小鼠肝組織AMPK、p-AMPK、SIRT1蛋白表達升高，F(xiàn)oxO1、p-FoxO1蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）；與二甲雙胍組比較，葛根芩連湯高劑量組小鼠肝組織AMPK、p-AMPK、SIRT1蛋白表達升高，F(xiàn)oxO1、p-FoxO1蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表5、圖2。

圖2 各組小鼠肝組織AMPK、p-AMPK、SIRT1、FoxO1、p-FoxO1蛋白免疫印跡

表5 各組小鼠肝組織AMPK、p-AMPK、SIRT1、FoxO1、p-FoxO1蛋白表達比較（±s）

表5 各組小鼠肝組織AMPK、p-AMPK、SIRT1、FoxO1、p-FoxO1蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與二甲雙胍組比較，▽P<0.05

組別空白組模型組二甲雙胍組葛根芩連湯高劑量組葛根芩連湯中劑量組葛根芩連湯低劑量組只數(shù)3 3 3 3 3 3劑量/（g/kg）0.2 31.9 19.1 6.9 AMPK 1.04±0.10 0.57±0.01**0.92±0.05#1.62±0.10#▽1.02±0.02#0.99±0.05#p-AMPK 1.30±0.19 0.39±0.05**0.62±0.01#0.97±0.04##▽0.73±0.05##0.59±0.01 SIRT1 1.42±0.14 0.42±0.01**0.62±0.05#1.17±0.02##▽0.97±0.03##0.61±0.03 FoxO1 0.47±0.06 1.33±0.10**0.87±0.07##0.59±0.08##▽0.66±0.07##▽0.84±0.02##p-FoxO1 0.49±0.03 1.55±0.05**0.84±0.09##0.63±0.03##▽0.68±0.04##▽0.83±0.03##

4.6 葛根芩連湯對模型小鼠肝組織AMPK、SIRT1、FoxO1 mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組小鼠肝組織AMPK、SIRT1 mRNA表達顯著降低，F(xiàn)oxO1 mRNA表達顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠肝組織AMPK、SIRT1 mRNA表達顯著升高，F(xiàn)oxO1 mRNA表達顯著降低（P<0.05）；與二甲雙胍組比較，葛根芩連湯高劑量組小鼠肝組織AMPK、SIRT1 mRNA表達顯著升高，F(xiàn)oxO1 mRNA表達顯著降低（P<0.05）。見表6。

表6 各組小鼠肝組織AMPK、SIRT1、FoxO1 mRNA表達比較（±s）

表6 各組小鼠肝組織AMPK、SIRT1、FoxO1 mRNA表達比較（±s）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；與二甲雙胍組比較，▽P<0.05，▽▽P<0.01

組別空白組模型組二甲雙胍組葛根芩連湯高劑量組葛根芩連湯中劑量組葛根芩連湯低劑量組只數(shù)3 3 3 3 3 3 AMPK 1.00±0.00 0.33±0.04**0.61±0.57#0.71±0.70#▽0.65±0.01#0.47±0.06#▽SIRT1 1.00±0.00 0.22±0.01**0.52±0.01#0.87±0.04#▽0.74±0.02#▽0.56±0.01#FoxO1 1.00±0.00 3.27±0.03**1.62±0.01#1.04±0.18#▽1.65±0.02#2.16±0.03#▽▽

5 討論

根據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會統(tǒng)計，過去10年，我國糖尿病患者人數(shù)由9 000萬增加至1.4億，增幅達56%[7]?！饵S帝內(nèi)經(jīng)太素》：“五氣，五谷之氣。液在脾者，五谷液也。肥羹令人熱中，故脾行涎液，出廉泉，入口中，名曰脾癉。內(nèi)熱氣溢，轉為消渴，以蘭為湯飲之，可以除陳氣也?！标U述脾癉主要病機為中滿內(nèi)熱。仝小林院士[8]認為，中滿日久化熱是肥胖型糖尿病發(fā)病的關鍵，也是脾癉轉為消渴的主要樞機，治療當大劑消導以消中滿，同時重用苦寒以清內(nèi)熱，以清為主。

葛根芩連湯源于《傷寒論·太陽病脈證并治》“治太陽病桂枝證，醫(yī)反下之，利遂不止，脈促者，表未解也；喘而汗出者，葛根芩連湯主之”。全方由葛根、黃連、黃芩、炙甘草4味藥組成，主治協(xié)熱下利，臨床多用于治療濕熱所致腹瀉和痢疾。葛根芩連湯治療T2DM早期，屬古方新用[9]。方中葛根甘、辛，性涼，入陽明經(jīng)，善解胃熱之消渴；黃芩、黃連苦寒，清肝胃之熱；炙甘草甘緩和中，調(diào)和諸藥。諸藥相伍，外解表熱，內(nèi)清里熱，清熱燥濕，生津潤燥，切中T2DM早期“中滿內(nèi)熱，濕熱內(nèi)阻”病機。本研究選取db/db小鼠，其表現(xiàn)為肥胖及多飲、多食等癥狀，與人類T2DM表現(xiàn)極為相似，是研究T2DM的理想動物模型[10]。氧化應激是體內(nèi)氧化作用與抗氧化作用失去平衡，即活性氧簇和活性氮簇生成過多而抗氧化系統(tǒng)無法完全清除[11]。氧化應激參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，與糖尿病關系十分密切[12]。在T2DM發(fā)生發(fā)展過程中，氧化應激產(chǎn)生的主要機制包括葡萄糖自身氧化、蛋白質(zhì)非酶糖化、多元醇途徑激活、蛋白激酶C激活、線粒體氧化磷酸化、抗氧化系統(tǒng)清除能力減弱等[13]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應的終產(chǎn)物，能反映氧化應激受損程度。GSH-Px是機體抗氧化系統(tǒng)中重要的抗氧化酶，能清除細胞呼吸代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物和羥自由基，減輕對機體的損傷[14]。CAT是過氧化物酶體系的標志酶，存在于動物各種組織細胞內(nèi)，以肝臟中濃度最高[15]。本研究結果顯示，葛根芩連湯能降低模型小鼠體質(zhì)量、FPG及HbA1c，HE染色可見少量肝細胞空泡變性，肝細胞點狀壞死有所改善，肝組織氧化應激相關指標MDA含量減少，GSH-Px和CAT活性升高，表明葛根芩連湯可有效調(diào)節(jié)小鼠肝臟氧化應激水平。AMPK作為動物細胞內(nèi)能量平衡的主要感受器，主要在肝臟內(nèi)表達，可調(diào)節(jié)脂肪酸氧化代謝和脂質(zhì)代謝相關基因表達[16-17]。研究表明，AMPK磷酸化后，通過激活下游SIRT1信號通路，增強線粒體氧化磷酸化水平[18]。SIRT1作為FoxO1上游分子，通過抑制FoxO1磷酸化增強抗氧化系統(tǒng)活性，抑制氧化應激產(chǎn)生[19-20]。本實驗結果顯示，葛根芩連湯能上調(diào)肝組織AMPK、SIRT1 mRNA和蛋白表達，下調(diào)FoxO1 mRNA和蛋白表達，改善db/db小鼠肝臟氧化應激狀態(tài)，發(fā)揮抗氧化應激作用。

綜上所述，葛根芩連湯可通過上調(diào)AMPK/SIRT1通路蛋白表達，下調(diào)FoxO1通路蛋白表達，提高db/db小鼠抗氧化能力，減少自由基生成，降低肝臟氧化應激水平，改善T2DM。本研究進一步揭示了葛根芩連湯改善T2DM的可能作用機制，可為中醫(yī)防治糖尿病提供實驗依據(jù)。