張銘， 吳天宇， 劉小碣， 張妍， 何曉宇， 劉賽賽， 趙士弟，，陳莉秋， 陳傳好， 張小楠，△

甘草附子湯加減方通過(guò)抑制GSDMD介導(dǎo)的焦亡治療CIA大鼠的作用機(jī)制研究*

張銘1，2， 吳天宇3， 劉小碣1， 張妍4， 何曉宇1， 劉賽賽5， 趙士弟1，5，陳莉秋6， 陳傳好2△， 張小楠1，5△

（1蚌埠醫(yī)學(xué)院心腦血管疾病基礎(chǔ)與臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2蚌埠醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，3蚌埠醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，4蚌埠醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，5蚌埠醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，6蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科，安徽 蚌埠 233030）

探討甘草附子湯加減方（GCFZD）抑制gasdermin D （GSDMD）介導(dǎo)細(xì)胞焦亡途徑對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠的治療效果。SD大鼠尾跟部注射由牛Ⅱ型膠原與弗氏佐劑混合形成的乳化劑，構(gòu)建CIA大鼠模型并對(duì)其關(guān)節(jié)炎指數(shù)進(jìn)行評(píng)估，將成功誘發(fā)關(guān)節(jié)炎的30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為模型組、甘草附子湯低（4 g/kg）、中（8 g/kg）和高（16 g/kg）劑量組及甲氨蝶呤（1 mg/kg）組，每組6只，連續(xù)給藥30 d。測(cè)定大鼠的體重、關(guān)節(jié)炎指數(shù)和足爪腫脹指數(shù)；X線影像學(xué)觀察骨質(zhì)破壞和軟組織厚度改變；HE染色觀察脾臟和關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變；番紅O-固綠染色觀察關(guān)節(jié)軟骨改變；TUNEL染色觀察關(guān)節(jié)內(nèi)細(xì)胞焦亡發(fā)生情況；Western blot測(cè)定TLR4、caspase-1、NLRP3和GSDMD蛋白表達(dá)；real-time PCR和ELISA測(cè)定IL-1β、IL-6和IL-10細(xì)胞因子表達(dá)。與模型組相比，GCFZD治療顯著改善CIA大鼠軟組織腫脹和骨質(zhì)破壞，降低脾臟和胸腺指數(shù)；HE染色結(jié)果顯示，GCFZD治療減輕CIA大鼠脾臟和踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變；番紅O-固綠染色結(jié)果顯示，GCFZD治療減少軟骨組織破壞，修復(fù)軟骨結(jié)構(gòu)；TUNEL染色結(jié)果顯示，GCFZD顯著抑制關(guān)節(jié)組織內(nèi)的細(xì)胞焦亡；Western blot結(jié)果表明，GCFZD降低CIA大鼠脾臟中TLR4、cleaved caspase-1、NLRP3和GSDMD-N的蛋白表達(dá)；real-time PCR和ELISA結(jié)果顯示，GCFZD減少CIA大鼠IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白水平的表達(dá)，上調(diào)IL-10的mRNA和蛋白水平的表達(dá)。GCFZD能夠抑制GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，減少IL-1β和IL-6分泌，促進(jìn)IL-10分泌，有效減輕CIA大鼠的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀。

甘草附子湯；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；gasdermin D；細(xì)胞焦亡

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種慢性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞和侵蝕性滑膜炎癥為主要病理特征，致殘率高且預(yù)后較差，尚缺乏有效防治措施［1］。RA臨床藥物治療常通過(guò)免疫抑制劑與非甾體藥物的聯(lián)合應(yīng)用緩解患者病情，但常規(guī)藥物治療導(dǎo)致的治療耐受和毒副作用致使其臨床應(yīng)用受限［2］。因此，探索RA治療新途徑尤為重要。

甘草附子湯源于張仲景的《傷寒論》，包含甘草、附子、白術(shù)和桂枝四種中藥，制附子補(bǔ)火助陽(yáng)、逐風(fēng)驅(qū)濕；桂枝助陽(yáng)化氣、溫經(jīng)散寒；白術(shù)除濕益燥、健脾益氣；甘草通血利痹、調(diào)和諸藥，全方共奏除濕祛風(fēng)、溫經(jīng)散寒之效，能夠有效緩解關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、僵直等癥狀，臨床已有報(bào)道其對(duì)RA具有較好治療效果［3-4］，本研究前期根據(jù)臨床患者實(shí)際癥狀和兼癥，在原方劑的基礎(chǔ)上加入了知母、白芍、威靈仙、雞血藤、木瓜和伸筋草等六味中藥，臨床治療效果較好，但其具體機(jī)制不明。細(xì)胞焦亡是一種由Gasdermin D（GSDMD）蛋白介導(dǎo)的溶解性細(xì)胞程序性死亡，研究表明，依賴GSDMD誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡途徑與RA滑膜炎癥的發(fā)生密切相關(guān)，通過(guò)抑制GSDMD的表達(dá)有助于緩解RA［5-6］。已有研究證明甘草附子湯能夠通過(guò)抑制滑膜成纖維細(xì)胞增殖、炎癥因子分泌等減輕RA疾病活動(dòng)度［7-8］，但從細(xì)胞焦亡層面探究GCFZD的藥效學(xué)機(jī)制尚缺乏文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究對(duì)CIA模型大鼠給予不同劑量的GCFZD處理后，通過(guò)檢測(cè)TLR4、caspase-1、NLRP3、GSDMD等焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，首次探討了GCFZD是否能夠抑制GSDMD誘導(dǎo)的焦亡途徑對(duì)CIA大鼠起到治療作用，旨在進(jìn)一步探究GCFZD治療RA的作用機(jī)制，為RA治療方法的創(chuàng)新發(fā)展提供理論依據(jù)。

材料和方法

1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠45只，5～6周，體重（200±20） g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)，飼養(yǎng)于SPF環(huán)境，保證充足食物與飲水，保持12 h光照周期。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開始前，經(jīng)過(guò)6～7 d適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境，動(dòng)物方案經(jīng)過(guò)蚌埠醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2　主要試劑

牛Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑（貨號(hào)20022、貨號(hào)7009，chondrex）；甲氨蝶呤（國(guó)藥準(zhǔn)字H31020644，上海上藥信誼藥廠有限公司）；異氟烷（R510-22，RWD）；4%多聚甲醛通用型組織固定液、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)BL359A、BL504A、BL612A、BL521A，biosharp）；兔抗β-Actin和兔抗GSDMD抗體（貨號(hào)WX766117、A20728，ABclonal）；兔抗cleaved caspase-1、兔抗GSDMD N-Terminal抗體（貨號(hào)AF4005、DF13758，Affinity）；鼠抗TLR4（貨號(hào)sc-293072，SANTA）；兔抗caspase-1、兔抗NLRP3、HRP-羊抗兔IgG、HRP-羊抗小鼠IgG（貨號(hào)BA2220、A00034、BA1054、BA1050，BOSTER）；Trizol（貨號(hào)：15596026，ambion）；FastKing RT Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SuperReal PreMix Plus 試劑盒（貨號(hào)KR116、FP205，TIANGEN）；大鼠白細(xì)胞介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒、大鼠IL-6 ELISA試劑盒和大鼠IL-10 ELISA試劑盒（貨號(hào)JM-01454R2、JM-01597R2、JM-01602R2，江蘇晶美生物科技）；TUNEL試劑盒（貨號(hào)G1501，武漢賽維爾生物科技有限公司）。

3　主要方法

3.1甘草附子湯制備制附子（15 g）、桂枝（10 g）、甘草（9 g）、知母（12 g）、白芍（20 g）、威靈仙（12 g）、雞血藤（20 g）、白術(shù)（15 g）、木瓜（12 g）和伸筋草（20 g）購(gòu)自山東。按照2020版《中華人民共和國(guó)藥典》制備甘草附子湯，藥材提前浸入20倍量水浸泡，武火煎煮1次，轉(zhuǎn)文火蒸煮至藥液至300 mL，取出后濾過(guò)，放入4 ℃冰箱備用。

3.2大鼠CIA模型構(gòu)建膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠模型的建立在課題組前期經(jīng)驗(yàn)及參考文獻(xiàn)中的方法優(yōu)化進(jìn)行［9］。步驟簡(jiǎn)述如下：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開始前，經(jīng)過(guò)6～7 d適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境，取弗氏不完全佐劑1∶1分次滴加至2 g/L牛II型膠原中，使用沃信手持式勻漿機(jī)冰上配制乳化液；配置的 2 g/L的牛Ⅱ型膠原-弗氏佐劑乳化液，在大鼠尾根前1 cm處采用皮內(nèi)注射，針斜面朝上平行進(jìn)針，初次免疫劑量200 μL，7 d后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每只SD大鼠注射乳化劑量100 μL，加強(qiáng)免疫5～8 d后，出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫，關(guān)節(jié)炎評(píng)分、足爪 X-ray、大體照片、足跖厚度證明成模。

3.3實(shí)驗(yàn)分組和藥物治療從初始免疫后第15天開始，每隔3 d對(duì)大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）評(píng)分，實(shí)驗(yàn)組大鼠AI>4 分，認(rèn)定為關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)成功，分入實(shí)驗(yàn)組；按照隨機(jī)分組原則，每組6只，分為正常（vehicle）組，模型組（CIA），甘草附子湯低（GCFZD-L）、中（GCFZD-M）、高劑量組（GCFZD-H）和MTX組，各組連續(xù)灌胃給藥30 d。甘草附子湯低、中、高劑量組給藥量分別為4、8和16 g/kg ；MTX組給藥量為1 mg/kg，每周1次；正常組和模型組給予2 mL的PBS溶液。

3.4關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)估根據(jù)大鼠關(guān)節(jié)紅腫程度、范圍及關(guān)節(jié)腫大、變形情況，采用五級(jí)評(píng)分法進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分，每個(gè)關(guān)節(jié)的炎癥最高分為4分，4個(gè)關(guān)節(jié)炎癥的總和最高為16分（0分，無(wú)關(guān)節(jié)炎；1分，個(gè)別足趾發(fā)紅、腫脹；2分，大部分足趾及足底腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)及以下腫脹；4分，腫脹累及踝關(guān)節(jié)以上且不能負(fù)重）。

3.5胸腺和脾指數(shù)評(píng)估大鼠脫頸處死后，剝離胸腺和脾臟，無(wú)菌PBS清洗組織血液，無(wú)菌吸水紙吸去多余水分，分別稱量胸腺和脾臟重量，其與大鼠體重比值即為胸腺和脾臟指數(shù)。

3.6X線影像學(xué)評(píng)估處死前3 d，異氟烷麻醉大鼠，固定大鼠四肢，使用數(shù)字診斷DR系統(tǒng)（飛利浦醫(yī)療），對(duì)CIA大鼠后肢軟組織腫脹情況及骨質(zhì)情況進(jìn)行數(shù)字放射成像檢查。

3.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)異氟烷麻醉大鼠后，將SD大鼠置于仰臥位，固定四肢，用無(wú)菌剪刀剪開腹部皮膚，無(wú)菌鑷撥開腸組織，暴露腹后壁，使用玻璃分針?lè)珠_腹主靜脈和腹主動(dòng)脈，刺入腹主動(dòng)脈后接入無(wú)菌采血管采血。血液室溫放置20～30 min后，低溫離心機(jī)4 ℃，3 000 r/min，離心10 min，取得血清。按照說(shuō)明書，用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（江蘇晶美）檢測(cè)CIA大鼠血清中IL-1β、IL-6和IL-10的表達(dá)水平。

3.8組織病理學(xué)染色脾組織和關(guān)節(jié)滑膜組織在4%多聚甲醛中固定后，關(guān)節(jié)脫鈣后與脾組織進(jìn)行脫水和包埋處理。切片5 μm厚，蘇木精伊紅（H&E）染色、番紅固綠染色及TUNEL染色。對(duì)脾組織切片進(jìn)行外周動(dòng)脈淋巴鞘密度、淋巴結(jié)節(jié)增生、邊緣帶增生和紅髓等參數(shù)的評(píng)估；對(duì)踝關(guān)節(jié)的滑膜組織、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、軟骨破壞、骨質(zhì)侵蝕、血管翳形成和滑膜增生等變化進(jìn)行評(píng)估；通過(guò)TUNEL染色陽(yáng)性率對(duì)關(guān)節(jié)組織中是否發(fā)生細(xì)胞焦亡進(jìn)行評(píng)估。公式：TUNEL陽(yáng)性率（%）=TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/Hoechst陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)×100%。

3.9real-time PCR在盛放組織的無(wú)菌EP管中加入Trizol裂解液，采用超微量組織研磨機(jī)充分研磨組織，按照5∶1加入氯仿充分震蕩，低溫12 000 r/min×15 min，取上清后等比例加入異丙醇，顛倒混勻后低溫12 000 r/min×10 min，棄上清后加入75%乙醇低溫7 500 r/min×5 min洗滌兩次，加入無(wú)水乙醇低溫7 500 r/min×5 min洗滌兩次，無(wú)菌吸水紙吸干多余液體，加入DEPC水溶解。按照FastKing RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求操作合成cDNA，以cDNA 為模板，按照SuperReal PreMix Plus試劑盒要求操作加樣，試驗(yàn)所用引物均由安徽華曉基因科技有限公司合成，引物序列信息見(jiàn)表1。選擇β-actin作為內(nèi)參照，用相對(duì)定量（2-ΔΔCt）法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1　real-time PCR引物序列

F： forward； R： reverse.

3.10Western blot提取各組大鼠脾臟組織蛋白，使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，上樣后120 V電泳1.5 h，200 mA轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂牛奶封閉2 h，Ⅰ抗（均1∶1 000；TLR4抗體， Santa Cruz； NLRP3和caspase-1抗體，Boster；cleaved caspase-1和GSDMD N-Terminal抗體，Affinity； GSDMD抗體， ABclonal）4 °C搖床孵育過(guò)夜，Ⅱ抗室溫封閉2 h，使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物在凝膠成像系統(tǒng)曝光，采集曝光圖像并使用ImageJ軟件分析灰度值。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及LSD-檢驗(yàn)。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　大鼠的一般情況

各組大鼠造模前基本狀態(tài)良好，毛發(fā)正常有光澤，排便正常，關(guān)節(jié)活動(dòng)自由。加強(qiáng)免疫一周后，除對(duì)照組外，各組大鼠的足爪和踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)不同程度的紅腫，體重增長(zhǎng)不明顯，毛發(fā)雜亂。加強(qiáng)免疫兩周后，除對(duì)照組外，各組大鼠足爪厚度明顯增加，踝關(guān)節(jié)紅腫明顯，關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，體重出現(xiàn)下降趨勢(shì)，毛發(fā)灰暗無(wú)光澤。經(jīng)藥物治療4周后，各治療組大鼠精神狀態(tài)較好，體重增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯，毛發(fā)整齊有光澤，關(guān)節(jié)腫脹度減輕，關(guān)節(jié)活動(dòng)尚可。

2　GCFZD降低CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹及骨質(zhì)破壞

X線影像學(xué)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)軟組織腫脹明顯，關(guān)節(jié)間隙增寬，骨密度降低；GCFZD中、高劑量組和甲氨蝶呤組處理后大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度明顯降低，骨質(zhì)破壞程度減輕，見(jiàn)圖1。

Figure 1.　Imaging data of joint swelling and bone changes in different groups of rats. ↓： Soft tissue swelling；↑： Bone erosion；←： Joint space.

3　GCFZD對(duì)CIA大鼠體質(zhì)量、關(guān)節(jié)炎指數(shù)和足爪腫脹指數(shù)的影響

模型組大鼠的體重增長(zhǎng)緩慢，明顯低于對(duì)照組大鼠（<0.01）；GCFZD中、高劑量和甲氨蝶呤治療后大鼠體重增加（<0.01），見(jiàn)圖2A。與模型組大鼠相比，GCFZD低、中、高劑量和甲氨蝶呤治療可以顯著降低大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（<0.01），減輕足爪腫脹程度（<0.01），見(jiàn)圖2B、C。

Figure 2.　Changes of joint weight， arthritis score and paw swelling index in each group. A： body weight； B： arthritis score； C： degree of foot swelling. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs CIA group.

4　GCFZD降低CIA大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)

與對(duì)照組相比，模型組大鼠脾臟明顯肥大，GCFZD中、高劑量和甲氨蝶呤治療后CIA大鼠脾臟增大得到緩解，形態(tài)大小接近對(duì)照組（圖3A）。進(jìn)一步對(duì)各組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，模型組大鼠較對(duì)照組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯升高（<0.01）；GCFZD中、高劑量和甲氨蝶呤治療后可降低CIA大鼠脾臟指數(shù)（<0.01）和胸腺指數(shù)（<0.01），甘草附子湯低劑量組對(duì)CIA大鼠胸腺指數(shù)無(wú)明顯影響（>0.05），見(jiàn)圖3B、C。

Figure 3.　Effect of GCFZD on spleen and thymus index of CIA rats. A： spleen samples of rats in each group； B： index of spleen； C： index of thymus. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs vehicle group； ##P<0.01 vs CIA group.

5　GCFZD改善CIA大鼠脾臟組織病理學(xué)改變

脾臟HE染色鏡下結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠脾臟組織紅髓著色較深，周圍動(dòng)脈淋巴鞘密度顯著增高，邊緣區(qū)增寬和淋巴結(jié)節(jié)增生明顯；與模型組相比，GCFZD中、高劑量和甲氨蝶呤治療組大鼠脾組織白髓和主要生發(fā)中心未見(jiàn)明顯增生，但經(jīng)GCFZD低劑量處理的CIA大鼠仍可見(jiàn)邊緣區(qū)和淋巴結(jié)節(jié)增生（圖4A）。脾組織病理學(xué)評(píng)估顯示，GCFZD低、中、高劑量治療組大鼠各項(xiàng)病理參數(shù)評(píng)分均低于模型組大鼠（圖4B）。

Figure 4.　Spleen HE staining images （A） and histopathological scores （B） of rats in each group. a： peripheral arterial lymphatic sheath density； b： marginal zone hyperplasia； c： lymphoid nodular hyperplasia； d： red pulp. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs vehicle group； #P<0.05， ##P<0.01 vs CIA group.

6　GCFZD改善CIA大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變

踝關(guān)節(jié)HE染色鏡下結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)內(nèi)組織結(jié)構(gòu)完整，關(guān)節(jié)面光滑無(wú)破損，滑膜組織和軟骨組織未見(jiàn)增生；與對(duì)照組相比，模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨和滑膜組織增生明顯，骨質(zhì)侵蝕程度較重，可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和血管翳產(chǎn)生；經(jīng)GCFZD低、中、高劑量和甲氨蝶呤治療后，CIA大鼠關(guān)節(jié)破壞程度顯著降低，軟骨面相對(duì)完整，滑膜組織厚度增生不明顯，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少（圖5A、B）。踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評(píng)分顯示，GCFZD低、中、高劑量治療組大鼠滑膜增生、骨質(zhì)侵蝕、血管翳和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)水平得到不同程度緩解，中、高劑量治療組效果與甲氨蝶呤治療組相似，沒(méi)有顯著性差異（圖5C）。

Figure 5.　Images of H&E and Safranine O-Fast Green staining of the ankle joint in various groups of rats. A： HE staining of ankle joint； B： HE staining of synovial tissue； C： statistical chart of ankle pathological score； D： safranin O-Fast Green staining of ankle joint. e： synovium hyperplasia； f： carilage damage； g： vascular pannus； h： inflammatory cellular infiltration. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs vehicle group； #P<0.05， ##P<0.01 vs CIA group.

為進(jìn)一步反映關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨及軟骨下骨的組織形態(tài)學(xué)變化，對(duì)踝關(guān)節(jié)進(jìn)行番紅O-固綠染色。鏡下結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下組織結(jié)構(gòu)完整，軟骨潮線清晰，軟骨基質(zhì)分布均勻；與對(duì)照組相比，模型組大鼠軟骨面不完整并伴有糜爛、脫落，軟骨下骨組織受侵襲程度較重，軟骨潮線模糊，軟骨基質(zhì)分布不均勻；經(jīng)GCFZD低、中、高劑量和甲氨蝶呤處理后大鼠關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，軟骨及軟骨下組織分界清晰，軟骨潮線較規(guī)則清晰，軟骨面相對(duì)完整（圖5D）。

7　GCFZD抑制細(xì)胞焦亡并降低TLR4、caspase-1和NLRP3蛋白水平抑制GSDMD表達(dá)

踝關(guān)節(jié)TUNEL染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠關(guān)節(jié)可見(jiàn)大量膨大、變形的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞；經(jīng)GCFZD治療后，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率明顯降低（<0.05），見(jiàn)圖6A。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠脾臟中TLR4蛋白表達(dá)增高，同時(shí)伴有cleaved caspase-1、NLRP3和GSDMD-N的表達(dá)升高，這提示TLR4通過(guò)激活caspase-1，活化的caspase-1剪切端和NLRP3炎癥小體導(dǎo)致GSDMD-N與胞膜磷脂蛋白結(jié)合后形成孔洞，誘發(fā)細(xì)胞焦亡（<0.05），經(jīng)GCFZD和甲氨蝶呤處理后，TLR4、cleaved caspase-1、NLRP3等焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)，并降低GSDMD-N蛋白表達(dá)，且GCFZD對(duì)GSDMD-N降低較MTX相比更明顯（<0.05），見(jiàn)圖6B、C。

Figure 6.　GCFZD decreased TLR4， caspase1 and NLRP3 protein levels and inhibited GSDMD expression. A： the TLR4， caspase-1， NLRP3 and GSDMD protein gray bands in different groups； B： gray scale statistics of TLR4， caspase-1， NLRP3 and GSDMD proteins in different groups. GSDMD-FL： full length of GSDMD； GSDMD-N： N-terminal of GSDMD. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs vehicle group； #P<0.05， ##P<0.01 vs CIA group.

8　GCFZD減少CIA大鼠IL-1β和IL-6分泌，并促進(jìn)IL-10表達(dá)抑制RA進(jìn)展

與模型組相比，GCFZD低、中、高劑量治療組大鼠血清中IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白水平表達(dá)下調(diào)（<0.05），見(jiàn)圖7A，且治療效果呈現(xiàn)劑量依賴性；甲氨蝶呤治療組IL-1β表達(dá)水平與高劑量組相比沒(méi)有顯著差異（>0.05），但甲氨蝶呤治療組IL-6的mRNA水平明顯低于GCFZD高劑量治療組（<0.01）；低、中、高劑量和甲氨蝶呤組治療后可增加CIA大鼠IL-10的mRNA和蛋白表達(dá)水平（<0.01），但高劑量治療組比甲氨蝶呤組升高更為明顯（<0.01），見(jiàn)圖7B。

Figure 7.　GCFZD reduced the secretion of IL-1β and IL-6， and increased IL-10 in CIA rats to inhibit the progression of rheumatoid arthritis. A： the protein levels of IL-1β， IL-6 and IL-10 were detected by ELISA； B： the mRNA levels of IL-1β， IL-6 and IL-10 were detected by real-time PCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs vehicle group； #P<0.05， ##P<0.01 vs CIA group.

討論

RA是一種中老年人群?；嫉穆苑莻魅拘约膊。膊≡缙诔Ｍㄟ^(guò)單獨(dú)使用甲氨蝶呤或甲氨蝶呤聯(lián)合非甾體類抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、靶向藥等降低疾病活動(dòng)度［10］。甲氨蝶呤作為常規(guī)治療藥物雖然能夠改善部分患者的臨床癥狀，但因其安全窗口窄、早期耐受性差、毒副作用明顯等弊端導(dǎo)致臨床上應(yīng)用受限［11］。因此，迫切需要探索RA治療新途徑、新方法。甘草附子湯原方劑由甘草、附子、白術(shù)和桂枝4味主藥組成，具有散寒止痛、溫通經(jīng)脈、補(bǔ)脾益氣的作用，是治療RA的經(jīng)典湯劑。結(jié)合中醫(yī)辨證論治的整體觀念，本研究在原方劑的基礎(chǔ)上加入知母止渴除煩、通便潤(rùn)燥；白芍?jǐn)筷幹购?、柔肝止痛；威靈仙祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)；雞血藤舒筋活絡(luò)；木瓜祛濕除痹；伸筋草活血化瘀，以加強(qiáng)方劑活血通絡(luò)、祛風(fēng)散寒、補(bǔ)氣益血的功效。CIA大鼠是常用的RA動(dòng)物模型，與RA患者具有高度一致的免疫和病理學(xué)改變［9］。本研究通過(guò)尾部注射牛Ⅱ型膠原與弗氏佐劑形成的乳化劑來(lái)構(gòu)建CIA大鼠模型，給予不同劑量甘草附子湯加減方，觀察了甘草附子湯加減方對(duì)RA的治療效果，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了探究。

RA作為一種慢性自身免疫病，全身炎癥反應(yīng)和滑膜成纖維細(xì)胞異常增殖導(dǎo)致的關(guān)節(jié)腫脹、骨密度降低和關(guān)節(jié)畸形等是RA的主要臨床表現(xiàn)和生物學(xué)觀測(cè)指標(biāo)［12］。甲氨蝶呤作為傳統(tǒng)抗風(fēng)濕藥，主要通過(guò)抑制二氫葉酸和脫氧胸苷一磷酸的生成進(jìn)而減少嘌呤和嘧啶的生成，從而發(fā)揮優(yōu)異的免疫抑制和抗炎作用［13］。同傳統(tǒng)抗風(fēng)濕藥物的治療機(jī)制類似，中醫(yī)單藥或復(fù)方治療也主要通過(guò)抑制過(guò)度活躍的免疫應(yīng)答或維持滑膜細(xì)胞正常生理穩(wěn)態(tài)以達(dá)到抗炎和骨保護(hù)的效果。例如，昆明山海棠通過(guò)抑制IL-12、IL-23和MMP-13等炎癥因子的分泌發(fā)揮全身抗炎作用，對(duì)RA有較好的治療效果［14］；傳統(tǒng)中草藥青風(fēng)藤的有效成分青藤堿通過(guò)增加miR-23b-3p的表達(dá)并下調(diào)其下游靶標(biāo)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9（fibroblast growth factor 9，F(xiàn)GF9）的水平，誘導(dǎo)疾病活動(dòng)期滑膜成纖維細(xì)胞的凋亡并抑制其異常增殖［15］。與上述的研究結(jié)果相似，我們通過(guò)給予不同實(shí)驗(yàn)劑量的甘草附子湯加減方治療后，CIA大鼠關(guān)節(jié)軟組織腫脹和骨質(zhì)破壞程度得到顯著改善，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，關(guān)節(jié)炎指數(shù)和足爪腫脹指數(shù)明顯降低，這說(shuō)明甘草附子湯加減方能夠有效降低RA的疾病活動(dòng)度。

多種炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)的滑膜炎癥在RA的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用［16］。研究證明，GSDMD蛋白介導(dǎo)的免疫細(xì)胞焦亡與炎癥因子的釋放密切相關(guān)［17］。焦亡發(fā)生過(guò)程中，GSDMD的特定結(jié)構(gòu)域被NLRP3激活的caspase-1/-4/-5/-11識(shí)別并切割，釋放出GSDMD-N端片段與質(zhì)膜上的磷脂分子相結(jié)合，誘導(dǎo)質(zhì)膜孔洞的形成，破壞細(xì)胞膜完整結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致質(zhì)膜溶解并釋放IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子，誘導(dǎo)滑膜炎癥的發(fā)生［18-19］。本研究結(jié)果顯示，RA發(fā)病過(guò)程中存在細(xì)胞焦亡，經(jīng)GCFZD處理后，CIA大鼠踝關(guān)節(jié)中發(fā)生焦亡的細(xì)胞數(shù)明顯降低（<0.05），這提示GCFZD能夠抑制細(xì)胞焦亡發(fā)揮治療效果。同時(shí)，脾臟中TLR4、cleaved caspase-1、NLRP3、GSDMD-N端蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)（<0.05），IL-1β和IL-6促炎細(xì)胞因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低（<0.01），IL-10抗炎細(xì)胞因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平增加（<0.01），這說(shuō)明GCFZD能夠抑制GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡途徑，減少炎癥因子的分泌，改善RA的滑膜炎癥。

綜上所述，甘草附子湯能夠抑制GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，下調(diào)IL-1β和IL-6促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平，增加IL-10抗炎因子的分泌，顯著抑制RA關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變和滑膜炎癥的發(fā)生，降低RA的疾病活動(dòng)度。但本項(xiàng)研究中缺少GCFZD對(duì)CIA大鼠成纖維滑膜細(xì)胞方面的調(diào)控研究，在后續(xù)的研究中將從細(xì)胞層面更加深入探討分析GCFZD對(duì)RA干預(yù)的作用機(jī)制。本研究探究了甘草附子湯加減方對(duì)RA的治療效果和作用機(jī)制，為RA的創(chuàng)新療法提供理論依據(jù)。

［1］ Sparks JA. Rheumatoid arthritis［J］. Ann Intern Med， 2019， 170（1）：ITC1-ITC16.

［2］ Aletaha D， Smolen JS. Diagnosis and management of rheumatoid arthritis： a review［J］. JAMA， 2018， 320（13）：1360-1372.

［3］曹江山， 莊賀， 侯王君， 等. 甘草附子湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎34例臨床觀察［J］. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2013， 19（5）：35-37.

Cao JS， Zhuang H， Hou WJ， et al. Chinical observation of 34 cases of rheumatoid arthritis treated by Licorice Aconiti Decoction［J］. Cuid J Tradit Chin Med Pharm， 2013， 19（5）：35-37.

［4］葉映月. 甘草附子湯治療寒濕型踝關(guān)節(jié)炎33例時(shí)效觀察［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2010， 16（12）：231.

Ye YY. Observation on 33 cases of cold and dampness ankle arthritis treated by Glycyrrhiza aconiti Decoction［J］. Chin J Exp Tradit Med Formulae， 2010， 16（12）：231.

［5］ Shi J， Gao W， Shao F. Pyroptosis： gasdermin-mediated programmed necrotic cell death［J］. Trends Biochem Sci， 2017， 42（4）：245-254.

［6］ Spel L， Martinon F. Inflammasomes contributing to inflammation in arthritis［J］. Immunol Rev， 2020， 294（1）：48-62.

［7］李東薇， 穆柏辰， 竇德強(qiáng)， 等. 甘草附子湯對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-10及TNF-α含量的影響［J］. 中華中醫(yī)藥雜志， 2020， 35（12）：6355-6358.

Li DW， Mu BC， Dou DQ， et al. Effects of Gancao Fuzi Decoction on IL-1β， IL-10 and TNF-α in serum and synovial fluid of collagen-induced arthritis rats［J］. China J Tradit Chin Med Pharm， 2020， 35（12）：6355-6358.

［8］蔡悅， 張博， 郭靜. 甘草附子湯對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜成纖維樣細(xì)胞增殖的影響［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2019， 25（11）：29-33.

Cai Y， Zhang B， Guo J. Effect of Gancao Fuzitang on synovial fibroblast-like cell proliferation in adjuvant arthritis mice model［J］. Chin J Exp Tradit Med Formulae， 2019， 25（11）：29-33.

［9］ Zhao T， Xie Z， Xi Y， et al. How to model rheumatoid arthritis in animals： from rodents to non-human primates ［J］. Front Immunol， 2022， 13：887460.

［10］ García-González CM， Baker J. Treatment of early rheumatoid arthritis： methotrexate and beyond［J］. Curr Opin Pharmacol， 2022， 64：102227.

［11］ Giollo A， Fuzzi E， Doria A. Methotrexate in early rheumatoid arthritis： is the anchor drug still holding？［J］. Autoimmun Rev， 2022， 21（4）：103031.

［12］ Scherer HU， H?upl T， Burmester GR. The etiology of rheumatoid arthritis［J］. J Autoimmun， 2020， 110：102400.

［13］ Katturajan R， S V， Rasool M， et al. Molecular toxicity of methotrexate in rheumatoid arthritis treatment： a novel perspective and therapeutic implications［J］. Toxicology， 2021， 461：152909.

［14］ 母?jìng)髻t， 劉國(guó)玲. 昆明山海棠對(duì)CIA大鼠足爪組織MMP-13蛋白表達(dá)及血清和足爪組織中IL-12、IL-23和IL-37水平的影響［J］. 中國(guó)病理生理雜志， 2015， 31（11）：2090-2095.

Mu CX， Liu GL. Effect ofHutch on MMP-13 protein expression and IL-12， IL-23 and IL-37 levels in serum and foot paws of rats with collagen-induced arthritis［J］. Chin J Pathophysiol， 2015， 31（11）：2090-2095.

［15］ 李嘉， 付婷婷， 張光峰， 等. 青藤堿通過(guò)miR-23b-3p/FGF9誘導(dǎo)人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞凋亡［J］. 中國(guó)病理生理雜志， 2020， 36（9）：1653-1660.

Li J， Fu TT， Zhang GF， et al. Sinomenine induces apoptosis of human rheumatoid arthritis fibroblastlike synoviocytes via miR-23b-3p/FGF9 signaling pathway［J］. Chin J Pathophysiol， 2020， 36（9）：1653-1660.

［16］ Kondo N， Kuroda T， Kobayashi D. Cytokine networks in the pathogenesis of rheumatoid arthritis［J］. Int J Mol Sci， 2021， 22（20）：10922.

［17］ Tang L， Lu C， Zheng G， et al. Emerging insights on the role of gasdermins in infection and inflammatory diseases ［J］. Clin Transl Immunology， 2020， 9（10）：e1186.

［18］ Tang D， Kang R， Berghe TV， et al. The molecular machinery of regulated cell death［J］. Cell Res， 2019， 29（5）：347-364.

［19］ Chadha S， Behl T， Bungau S， et al. Mechanistic insights into the role of pyroptosis in rheumatoid arthritis［J］. Curr Res Transl Med， 2020， 68（4）：151-158.

Mechanism of Gancao-Fuzi Decoction in treatment of collagen-induced arthritis rats via inhibiting GSDMD-mediated pyroptosis

ZHANG Ming1，2， WU Tianyu3， LIU Xiaojie1， ZHANG Yan4， HE Xiaoyu1， LIU Saisai5， ZHAO Shidi1，5， CHEN Liqiu6， CHEN Chuanhao2△， ZHANG Xiaonan1，5△

（1，，2，，3，，4，5，6，，233030，）

To explore the therapeutic effect of Gancao-Fuzi Decoction （GCFZD） on collagen-induced arthritis （CIA） in rats by inhibiting the GSDMD-mediated pyroptosis.The tail heels of rats were injected with an emulsifier formed by mixing the bovine type II collagen with Freund's adjuvant to construct the CIA rat models and evaluate its arthritis indexes. The 30 male CIA rats were randomly divided into the model group， the low- （4 g/kg）， medium- （8 g/kg） and high-dose （16 g/kg） groups of GCFZD and the methotrexate group （1 mg/kg）， 6 rats per group for 30 days. The body weight， arthritis index and paw swelling index were recorded in each group of rats.X-ray imaging to observe the changes in bone destruction and soft tissue thickness， and the spleen and joints were detected by HE staining to observe the histopathological changes.The safranine o-fast green staining was used to observe articular cartilage changes. TUNEL staining was performed to evaluate cellular pyroptosis. Western blot for TLR4， caspase-1， NLRP3 and GSDMD protein expression. Real-time PCR and ELISA for IL-1β， IL-6 and IL-10 cytokine expression.Compared with the model group， there were significant improvements in soft tissue swelling and bone destruction， as well as reduced spleen and thymus indices in CIA rats with GCFZD treatment. HE staining results showed that the histopathological changes in the spleen and ankle joint of CIA rats were significantly improved with GCFZD treated. The safranine o-fast green staining showed that GCFZD could reduce the cartilage tissue destruction and repaired cartilage structure. TUNEL staining results indicated that GCFZD could significantly inhibit joint tissue pyroptosis. Western blot showed that TLR4， cleaved caspase-1， NLRP3 and GSDMD-N were decreased in spleen of CIA rats in GCFZD treatment groups. Real-time PCR and ELISA results showed that the GCFZD decreased the mRNA and protein level expression of IL-1β and IL-6 while upregulating the mRNA and protein level expression of IL-10 in blood serum of CIA rats.GCFZD may inhibit GSDMD-mediated pyroptosis and decrease IL-1β and IL-6 secretion and promote IL-10 secretion， resulting in an effective reduction of rheumatoid arthritis symptoms in CIA rats.

Gancao-Fuzi Decoction； rheumatoid arthritis； gasdermin D； pyroptosis

R593.21； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.015

1000-4718（2023）02-0325-10

2022-09-07

2022-12-14

［基金項(xiàng)目］安徽省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目重點(diǎn)項(xiàng)目（No. KJ2020A0588）；安徽省重點(diǎn)科研平臺(tái)開放課題基金項(xiàng)目（No. KLICD-2022-Z5）；蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（No. Byycx21012、21058）；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（No. S202110367076）

張小楠 Tel： 13609827842； E-mail： zhangxn@bbmc.edu.cn； 陳傳好 Tel： 15212108484； E-mail： cch711124@bbmc.edu.cn

（責(zé)任編輯：宋延君，李淑媛）