沈廷明，顏于露，葉希奇，黃春情，吳軍軍，方 芝，王英豪，沈悰祺，吳荔芬

1.寧德市中醫(yī)院，福建 寧德 352100

2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122

3.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 太原 030024

4.莆田學(xué)院附屬醫(yī)院，福建 莆田 351100

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指在排除酒精和其他明確原因的情況下，由代謝紊亂誘發(fā)肝臟出現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過度沉積的一種慢性肝病[1]。脂質(zhì)在肝臟中異常聚集會(huì)導(dǎo)致肝臟正常生理功能受損，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致肝臟纖維化、肝硬化、肝臟壞死。2020年專家組織在共識(shí)聲明中提議將非酒精性脂肪性肝病更名為代謝相關(guān)脂肪性肝病（metabolic-related fatty liver disease，MAFLD）[2]。MAFLD 全球患病率持續(xù)上升，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅。目前，西醫(yī)尚無治療MAFLD 的藥物，而中醫(yī)藥作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，在治療MAFLD 方面有獨(dú)特療效，顯現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì)和開發(fā)應(yīng)用前景。

金線蓮Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl 為蘭科開唇蘭屬的一種多年生草本植物，含有多種化學(xué)成分，包括黃酮類、多糖類、生物堿等[3]?，F(xiàn)代研究表明，金線蓮具有抗腫瘤、降血糖、保肝等藥理作用[4]。近年來，金線蓮及其提取物在治療MAFLD方面體現(xiàn)出一定的療效[5]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法[6]探討金線蓮治療MAFLD 的作用機(jī)制，揭示金線蓮防治MAFLD 在靶點(diǎn)-通路層面的復(fù)雜分子機(jī)制，為金線蓮治療MAFLD 的作用機(jī)制探究提供新思路和新方向。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)C57BL/6 雌性小鼠，7～8 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)NO.110324210105903262。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度22～24 ℃、相對(duì)濕度（55±5）%、12 h 光暗循環(huán)的環(huán)境下，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)號(hào)IACUC-2021-0008。

1.2 藥品與試劑

槲皮素（批號(hào)HY-18085，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.02%）、木犀草素（批號(hào)HY-N0162，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.49%）、小鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子（批號(hào)HY-P7085）購自MedChemExpress 公司；DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)CM10013）購自中科邁晨；Opti-MEM 培養(yǎng)基（批號(hào) 31985-070）購自美國 Gibco 公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購自Invivogen 公司；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP，批號(hào)A2383）購自美國Sigma-Aldrich 公司；NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）抗體（批號(hào)15101S）、白細(xì)胞介素-1β 前體（interleukin-1β precursor，pro IL-1β）抗體（批號(hào)12242S）購自美國CST 公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1 前體（cystein-asparate protease-1 precursor，pro Caspase-1）抗體（批號(hào)AG-20B-0042）購自Adipogen 公司；凋亡斑點(diǎn)樣蛋白（apoptotic spot-like protein，ASC）抗體（批號(hào)sc-22514-R）購自Santa Cruz Biotechnology；IL-1β 抗體（批號(hào)12703S）購自R&D systems；Lamin B 抗體（批號(hào)66095-1-Ig）購自Proteintech 公司；驢抗小鼠二抗（批號(hào)115-035-003）、驢抗兔二抗（批號(hào)111-035-003）、驢抗羊二抗（批號(hào)705-035-003）購自Jackson Immuno Research。

1.3 儀器

3-18K 型離心機(jī)（美國Sigma 公司）；RX-N-C型顯影膠片（廣西巨星醫(yī)療器械有限公司）；JYJX5+型電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；HERAcell vios 160i 型培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 金線蓮活性成分篩選

從PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取金線蓮化學(xué)成分2D 結(jié)構(gòu)及smile 式，進(jìn)一步通過 SwissADME 數(shù)據(jù)庫（http://www.swissadme.ch/）篩選出其潛在的活性成分，通過SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstarget prediction.ch/）對(duì)潛在的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)合UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）進(jìn)行轉(zhuǎn)換。

2.2 MAFLD 疾病靶點(diǎn)篩選

以“metabolic associated fatty liver disease”為關(guān)鍵詞在Drugbank 數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）、TTD 數(shù)據(jù)庫（http://db.idrblab.net/ttd/）及Disgenet 數(shù)據(jù)庫（http://www.disgenet.org）中檢索得到疾病靶點(diǎn)，通過UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）進(jìn)行轉(zhuǎn)換。

2.3 “活性成分-MAFLD”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Venny 圖得到金線蓮活性成分與MAFLD的交集靶點(diǎn)，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建“活性成分-MAFLD”網(wǎng)絡(luò)。

2.4 交集靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)通過String 11.5 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/）構(gòu)建物種為“Homo sapiens”的PPI，設(shè)定相互作用得分≥0.7，并隱藏掉游離靶點(diǎn)；將PPI結(jié)果從String 中導(dǎo)出并導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件中進(jìn)行可視化分析。

2.5 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

通過David 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析，限定物種為“Homo sapiens”，其他參數(shù)默認(rèn)[7]。當(dāng)P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 細(xì)胞提取與培養(yǎng)

采用頸椎脫位法處死C57BL/6 雌性小鼠，用75%乙醇浸泡3～5 min，從小鼠骨髓中分離小鼠骨髓巨噬細(xì)胞BMDMs，用含有胎牛血清、青霉素-鏈霉素和50 ng/mL 小鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，第3 天補(bǔ)加DMEM 培養(yǎng)基和小鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子[8]。

2.7 細(xì)胞分組與給藥

2.7.1 核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路激活劑給藥處理 將BMDMs 以1×106個(gè)/mL接種于24 孔板中，500 μL/孔，培養(yǎng)過夜后，用含有不同濃度（10、20、40 μmol/L）槲皮素或木犀草素的Opti-MEM 培養(yǎng)基處理1 h，再給予50 ng/mL LPS 共同處理細(xì)胞3 h；另設(shè)置不含藥物的對(duì)照組和僅給予LPS 處理的模型組。

2.7.2 NLRP3 信號(hào)通路激活劑給藥處理 將BMDMs 以1×106個(gè)/mL 接種于24 孔板中，500 μL/孔，培養(yǎng)過夜后，用含50 ng/mL LPS 的DMEM 培養(yǎng)基處理細(xì)胞4 h，誘導(dǎo)炎癥小體前體組裝蛋白的表達(dá)；然后更換為含有不同濃度（10、20、40 μmol/L）木犀草素的Opti-MEM 培養(yǎng)基處理1 h，再給予5 mmol/L ATP 刺激1 h，誘導(dǎo)NLRP3 炎癥小體激活。另設(shè)置不含藥物的對(duì)照組和僅給予LPS處理的模型組。

2.8 Western blotting 檢測(cè)上清液中IL-1β 和細(xì)胞中NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞和上清液，提取蛋白[9-10]，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，加入5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜；加入二抗孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行分析，定量數(shù)據(jù)用±s表示，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析或t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 金線蓮的活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)

共收集到金線蓮活性成分278 種，通過設(shè)定的ADME 條件篩選出潛在的活性成分166 種，去重后獲得活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)557 個(gè)。

3.2 MAFLD 的疾病靶點(diǎn)

從Drugbank、TTD 數(shù)據(jù)庫分析得到14 個(gè)疾病靶點(diǎn)，從Disgenet 數(shù)據(jù)庫分析得到493 個(gè)疾病靶點(diǎn)，整合后共得到496 個(gè)疾病靶點(diǎn)。

3.3 “活性成分-MAFLD”網(wǎng)絡(luò)

將166 種活性成分的557 個(gè)靶點(diǎn)與MAFLD 的496 個(gè)疾病靶點(diǎn)取交集，得到103 個(gè)交集靶點(diǎn)（圖1）。通過Cytoscape 3.8.2 軟件可視化分析，構(gòu)建“活性成分-MAFLD”網(wǎng)絡(luò)（圖2），主要成分包括槲皮素、木犀草素、異鼠李素、山柰酚等。

圖1 金線蓮活性成分與MAFLD 靶點(diǎn)的Venn 圖Fig.1 Venn diagram of active ingredient of A.roxburghii and MAFLD targets

圖2 “活性成分-MAFLD”網(wǎng)絡(luò)Fig.2 “Active ingredient-MAFLD” network

3.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

通過String 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建金線蓮活性成分與MAFLD 交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖3所示，共有96 個(gè)節(jié)點(diǎn)、327 條邊，度值排名前10 位的靶點(diǎn)分別為熱休克蛋白90α（heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、蛋白激酶1（kinase protein 1，AKT1）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子 3 （signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、雌激素受體α（estrogen receptor 1，ESR1）、過氧化物酶體增生激活受體γ（peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARG）、PPARA、MAPK8、Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）。

圖3 交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of intersecting targets

3.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析

GO 功能富集分析涉及細(xì)胞因子、細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控、血管生成等163 個(gè)生物過程（biological process，BP），胞核、胞質(zhì)等24 種細(xì)胞組分（cell component，CC），蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等63 個(gè)分子功能（molecular function，MF）；KEGG 通路富集分析涉及炎癥通路、MAFLD、NLRP3 通路、NF-κB 通路等153 條通路。選擇-lgP最大的前10 名做圖，見圖4。

圖4 GO 功能(A)和KEGG 通路(B)富集分析(前10)Fig.4 GO function(A)and KEGG pathway(B)enrichment analysis(top 10)

3.6 槲皮素和木犀草素抑制NF-κB信號(hào)通路的激活

經(jīng)典的NLRP3 炎癥小體組成蛋白NLRP3 和pro IL-1β 的表達(dá)受NF-κB 信號(hào)通路調(diào)控，NF-κB 參與了調(diào)控多種細(xì)胞焦亡和增殖相關(guān)因子的表達(dá)[11]。激活NF-κB 繼而促進(jìn)NLRP3 和pro IL-1β、pro IL-18的轉(zhuǎn)錄，可為NLRP3炎癥小體的活化和發(fā)揮作用提供物質(zhì)基礎(chǔ)[12]。為了驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出的活性成分對(duì)NF-κB 信號(hào)通路的影響，采用Western blotting 檢測(cè)LPS 刺激的BMDMs 中NLRP3、pro Caspase-1、pro IL-1β 和ASC 蛋白表達(dá)，如圖5、6所示，槲皮素、木犀草素呈劑量相關(guān)性地抑制pro IL-1β的表達(dá)（P＜0.001），并對(duì)NLRP3 蛋白表達(dá)有輕微的抑制作用，表明槲皮素、木犀草素可以抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活。

圖5 槲皮素和木犀草素抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活Fig.5 Quercetin and luteolin inhibited the activation of NF-κB signaling pathway

3.7 木犀草素有效抑制NLRP3炎癥小體的激活

為了考察木犀草素對(duì)NLRP3 炎癥小體活化的影響，采用Western blotting 檢測(cè)LPS 及ATP 刺激的BMDMs 上清液中IL-1β 及細(xì)胞中NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)，如圖7所示，木犀草素呈劑量相關(guān)性抑制BMDMs 上清液中成熟IL-1β 的分泌（P＜0.001），但對(duì)BMDMs 中NLRP3、pro Caspase-1、pro IL-1β 和ASC 蛋白表達(dá)沒有明顯影響。

圖7 木犀草素抑制NLRP3炎癥小體的激活(±s,n = 3)Fig.7 Luteolin inhibited activation of NLRP3 inflammasome(±s,n = 3)

圖6 槲皮素和木犀草素抑制pro IL-1β 蛋白表達(dá)(±s,n = 3)Fig.6 Quercetin and luteolin inhibited pro IL-1β protein expression(±s,n = 3)

4 討論

MAFLD 源自NAFLD，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，關(guān)于MAFLD 的發(fā)病機(jī)制最經(jīng)典的莫過于“二次打擊”學(xué)說[13]，認(rèn)為其與通過多種途徑及損傷之間的相互作用有關(guān)，涉及胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥浸潤、細(xì)胞凋亡等過程。其中，胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝紊亂為“首次打擊”[14]，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積；“第二次打擊”為氧化應(yīng)激介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致星形細(xì)胞激活造成肝細(xì)胞纖維化。細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)是MAFLD 發(fā)生肝纖維化、肝硬化的關(guān)鍵因素。NLRP3 炎癥小體在MAFLD、非酒精性脂肪性肝炎、腸炎、動(dòng)脈粥樣硬化等多種炎性疾病中發(fā)揮了重要的作用，提示NLRP3 炎癥小體可以作為上述疾病診療的干預(yù)靶點(diǎn)[15-17]。

目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的治療手段主要是改善胰島素抵抗和保肝抗炎，中藥治療通常以保肝抗炎為主[18-19]。研究顯示，金線蓮?fù)ㄟ^抑制脂質(zhì)的過氧化、緩解血脂代謝紊亂、抗氧化應(yīng)激、抗炎作用于MAFLD，與其發(fā)病機(jī)制契合。借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的手段可有利地闡釋以金線蓮為例的藥物治療MAFLD 的核心成分及作用機(jī)制[20]。同時(shí)，通過細(xì)胞模型，借助Western blotting 驗(yàn)證金線蓮靶向調(diào)控NLRP3炎癥小體的活性成分，對(duì)闡明金線蓮治療炎性疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制、新藥開發(fā)和質(zhì)量控制具有重要的作用。

4.1 金線蓮治療MAFLD 藥效成分發(fā)現(xiàn)

結(jié)合金線蓮“活性成分-MAFLD”網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，金線蓮治療MAFLD 的主要活性成分是黃酮類，確認(rèn)槲皮素、異鼠李素、木犀草素、山柰酚等166個(gè)活性成分，可以與103 個(gè)靶點(diǎn)相互作用，主要通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂來降低肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積從而達(dá)到治療MAFLD 的作用。張茂華等[21]發(fā)現(xiàn)槲皮素能改善胰島素抵抗，抑制脂質(zhì)過氧化和影響炎癥因子水平，改善肝臟脂肪化的程度。周健等[22]發(fā)現(xiàn)異鼠李素可通過減輕氧化應(yīng)激，緩解游離脂肪酸引起的脂質(zhì)沉積，提高谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶活性。王新等[23]發(fā)現(xiàn)木犀草素能夠減少高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD 小鼠肝臟中脂質(zhì)積累，并且能抑制小鼠肝臟內(nèi)脂質(zhì)合成的基因表達(dá)。由此可見，以槲皮素、異鼠李素、木犀草素、山柰酚為代表的活性成分在治療MAFLD 中發(fā)揮重要作用[24-25]。

4.2 金線蓮治療MAFLD 關(guān)鍵靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法揭示了金線蓮可能介導(dǎo)關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路起到治療MAFLD 的作用。PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，金線蓮可能通過作用于HSP90AA1、STAT3、AKT1、EGFR、MAPK1、ESR1、PPARG、PPARA、MAPK8、JAK2 等主要靶點(diǎn)治療MAFLD。靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，HSP90AA1 可能為MAFLD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。SKP1 的G2 等位基因抑制因子（suppressor of G2 allele of SKP1，SGT1）、熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）和NOD樣受體（NOD-like receptors，NLRs）蛋白的關(guān)聯(lián)對(duì)于炎癥小體激活是不可或缺的[26]，因此靶向NLRP3炎癥小體或可作為上述疾病診療的干預(yù)靶點(diǎn)。

4.3 金線蓮治療MAFLD 作用機(jī)制研究

KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，金線蓮治療MAFLD 主要涉及晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end product，AGE）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end product，RAGE）信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈硬化、胰島素抵抗、酒精性肝病等通路，這些通路大多與MAFLD 疾病進(jìn)程中的炎癥浸潤、脂質(zhì)代謝紊亂和氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，并參與MAFLD 的發(fā)生發(fā)展。排名前10 位的通路有3 項(xiàng)與癌癥通路相關(guān)，提示金線蓮在癌癥防治方面的臨床應(yīng)用前景，另一方面對(duì)脂肪肝進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化、肝癌有一定防治作用。

4.4 靶向NLRP3炎癥小體的金線蓮活性成分治療MAFLD 的生物學(xué)驗(yàn)證

綜上所述，金線蓮可能通過槲皮素、木犀草素、異鼠李素等多個(gè)活性成分，作用于HSP90AA1、STAT3、AKT1、EGFR、MAPK1、ESR1、PPARG、PPARA、MAPK8、JAK2 等103 個(gè)靶點(diǎn)，調(diào)控糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路等信號(hào)通路，參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂、抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等過程改善MAFLD 的肝損傷，發(fā)揮治療MAFLD 的作用。生物學(xué)驗(yàn)證結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了金線蓮中的木犀草素、槲皮素不僅可以抑制NF-κB信號(hào)通路活化，而且還可以有效抑制NLRP3炎癥小體的激活。充分體現(xiàn)了中藥多組分、多靶點(diǎn)、多層次的整體調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為探索抗MAFLD 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制提供了方向，同時(shí)為金線蓮的安全性-有效性評(píng)價(jià)、質(zhì)量控制、進(jìn)一步開發(fā)及應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突