趙少磊，原 震，朱艷茹，丁浩強(qiáng)，鄭鑫杰，張靜澤，劉岱琳*

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617

2.天津現(xiàn)代創(chuàng)新中藥科技有限公司，天津 300384

近年來(lái)，脂質(zhì)代謝異常已經(jīng)成為僅次于高血壓、吸煙的第3 大心血管疾病獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]，高脂血癥與心血管事件的發(fā)生密切相關(guān)。低密度脂蛋白膽固醇升高是心血管疾病尤其是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，因此，調(diào)節(jié)血脂對(duì)于防治心血管疾病、降低心血管事件的發(fā)生具有重要意義。中藥以其療效確切、不良反應(yīng)小以及多途徑、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)在調(diào)節(jié)血脂異常、防治高脂血癥方面具有良好的前景。

地骨皮為茄科植物枸杞Lycium chinenseMill.或?qū)幭蔫坭絃.barbarumL.的干燥根皮。《本草綱目》中曾記載“春采枸杞葉，名天精草；夏采花，名長(zhǎng)生花；秋采子，名枸杞子；冬采根，名地骨皮”。果實(shí)枸杞為藥食同源的常用中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有可滋補(bǔ)肝腎、益精明目的功效，用于治療虛勞精虧、腰膝酸痛、眩暈耳鳴、陽(yáng)痿遺精、內(nèi)熱消渴、血虛萎黃、目昏不明等癥[2]。枸杞的根皮名為地骨皮，可涼血除蒸、清肺降火，用于治療陰虛潮熱、骨蒸盜汗、肺熱咳嗽、咯血、衄血、內(nèi)熱消渴等癥[3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，地骨皮具有降血壓、調(diào)血脂、降血糖、抗骨質(zhì)疏松、抗炎等多種作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，地骨皮中的蒽醌類成分能夠降低高脂血癥大鼠總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇水平，增加膽汁酸的外排，從而發(fā)揮調(diào)血脂作用[5-6]。地骨皮含有環(huán)肽類、黃酮、蒽醌、生物堿、多糖等多種活性成分，但是其調(diào)血脂活性成分及作用機(jī)制研究報(bào)道相對(duì)較少。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法[7]，通過(guò)基因、靶蛋白、疾病以及藥物等數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)以及計(jì)算機(jī)生物學(xué)分析并構(gòu)建地骨皮調(diào)血脂的潛在活性成分、靶點(diǎn)、疾病以及通路相互作用網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)分子對(duì)接和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，為揭示地骨皮的調(diào)血脂機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人肝癌HepG2 細(xì)胞由武警后勤學(xué)院軍事藥學(xué)教研室提供，人結(jié)腸腺癌Caco-2 細(xì)胞購(gòu)自普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

β-谷甾醇（批號(hào)MUST1310515）、大黃素（批號(hào) MUST13022715）、 金合歡素（批號(hào)MUST1305235）、蒙花苷（批號(hào)MUST1320153）購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批號(hào)059M4031V）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；胎牛血清（批號(hào)12B031）購(gòu)自Excell Bio 公司；青霉素-鏈霉素（批號(hào) WH1021A161）、 胰蛋白酶（批號(hào)WH2122Z111）、DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)WH0022Z121）購(gòu)自普諾賽生命科技有限公司；油酸（批號(hào)C13292586）購(gòu)自麥克林生化科技有限公司；辛伐他?。ㄅ?hào)L2103127）購(gòu)自阿拉丁生化試劑有限公司；腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 A1（ATP binding cassette transport protein A1，ABCA1）抗體（批號(hào)27U4953）、β-actin 抗體（批號(hào)12W2944）購(gòu)自Affinity 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（批號(hào)CR2108180）購(gòu)自賽維爾生物科技有限公司；油紅O 染色試劑盒（批號(hào)20220704）、CCK-8 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)316R012）、BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20220705）購(gòu)自索萊寶科技有限公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)AK060P081896）購(gòu)自伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.3 儀器

Thermo 371 型CO2培養(yǎng)箱、Thermo-R 型離心機(jī)、1300SA2 型生物安全柜、Multiskan GO1510 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；Dmi1型倒置生物顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；AI680RGB型凝膠成像儀（美國(guó)GE 公司）。

2 方法

2.1 分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.1.1 地骨皮化學(xué)成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的篩選 在TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫(kù)以“地骨皮”為關(guān)鍵詞檢索化學(xué)成分，將地骨皮按照吸收、分布、代謝、排泄（absorption,distribution,metabolism,excretion，ADME）過(guò)程篩選潛在活性成分，以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 為條件建立相應(yīng)的綜合模型收集相應(yīng)的化學(xué)成分及其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白。同時(shí)通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[26]補(bǔ)充活性成分以構(gòu)建地骨皮活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。運(yùn)用PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載化合物的2D 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入到SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置屬性為“Homo sapiens”，點(diǎn)擊“Predict Targets”，預(yù)測(cè)相應(yīng)的靶點(diǎn)，去除可能性為零的相關(guān)靶點(diǎn)，并將數(shù)據(jù)合并去重。

2.1.2 高脂血癥疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建 以“hyperlipidemia”為關(guān)鍵詞在GeneCards（https://www.genecards.org/）和OMIM（https://www.omim.org／）數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)相關(guān)的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，之后進(jìn)行數(shù)據(jù)合并及去重以構(gòu)建高脂血癥疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.1.3 活性成分和疾病共同靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)Uniprot（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)將物種設(shè)定為Human，確定靶點(diǎn)蛋白的基因名稱，隨后利用Venny 2.1 對(duì)地骨皮中的活性成分和疾病的靶點(diǎn)取交集，得到活性成分和疾病的交集靶點(diǎn)。

2.1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 為明確地骨皮活性成分相關(guān)蛋白與疾病靶點(diǎn)的相關(guān)作用，獲取地骨皮調(diào)血脂的潛在作用靶點(diǎn)，將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到String（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)[8]中，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型。將生物物種設(shè)定為“Homo spaiens”，將置信度設(shè)置為最高置信度“highest confidence（0.9）”，其余設(shè)置均為默認(rèn)，獲取PPI關(guān)鍵靶點(diǎn)。將結(jié)果進(jìn)一步導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件中進(jìn)行可視化處理，設(shè)置參數(shù)使節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺反映度值的大小，邊的粗細(xì)反映結(jié)合率評(píng)分的高低，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

2.1.5 地骨皮活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建將篩選出的活性成分靶點(diǎn)以及疾病靶點(diǎn)輸入到Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）中得到交集韋恩圖[9]。結(jié)合Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖以及網(wǎng)絡(luò)拓樸學(xué)分析。

2.1.6 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將地骨皮與調(diào)血脂的核心作用靶點(diǎn)錄入 Metascape（http://metascape.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，物種設(shè)置“Homo sapiens”，設(shè)置閾值“P＜0.01”，進(jìn)行GO 功能及KEGG 通路富集分析，分析其主要的生物學(xué)過(guò)程與相關(guān)通路，之后運(yùn)用Cytoscape 3.8.2 軟件進(jìn)行成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建以及可視化處理。

2.1.7 分子對(duì)接 為了更好地闡述地骨皮發(fā)揮調(diào)血脂作用的潛在靶點(diǎn)和對(duì)應(yīng)活性成分之間的結(jié)合活性，根據(jù)上述篩選出的活性成分和核心靶點(diǎn)，結(jié)合臨床藥理實(shí)驗(yàn)及大量調(diào)血脂相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，選取過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）通路中的2 個(gè)靶點(diǎn)作為研究對(duì)象，利用ChemBioDraw Ultra 軟件繪制篩選得到的14 個(gè)單體化合物的結(jié)構(gòu)，并用Chem 3D 軟件獲取所有單體化合物3D 格式的結(jié)構(gòu)式。在RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)PPARα 和PPARγ的配體，盡量選擇分辨率高、有配體、結(jié)構(gòu)相對(duì)完整的晶體結(jié)構(gòu)，并下載PDB 格式文件。應(yīng)用SYBYLX 2.0 軟件對(duì)化合物和蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，并利用其自帶的打分函數(shù)對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行模擬篩選，獲得總得分值，總得分≥5 表明受體和配體親和力較大。之后利用Discovery Studio 2019 Client 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1 HepG2 細(xì)胞和Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2 細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Caco-2 細(xì)胞用含20%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d 更換1 次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞融合度為80%時(shí)用胰蛋白酶消化傳代。

2.2.2 細(xì)胞活力測(cè)定 分別精密稱取β-谷甾醇、蒙花苷、大黃素和金合歡素適量，用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液完全溶解，配制成濃度為0.01 mol/L 的各樣品藥液，使用時(shí)用含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基稀釋成不同濃度。HepG2 細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，與500 μmol/L 油酸和20 μmol/L 辛伐他汀以及不同濃度（0、25、50、100、200 μmol/L）β-谷甾醇、蒙花苷、大黃素和金合歡素分別培養(yǎng)24 h，另設(shè)置空白孔（不含細(xì)胞），每孔加入10 μL CCK-8 試劑，孵育2 h，使用酶標(biāo)儀于450 nm 處測(cè)定吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，并篩選出最適藥物濃度。

Caco-2 細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，與不同濃度（0、25、50、100、200 μmol/L）蒙花苷和大黃素分別培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，孵育2 h，使用酶標(biāo)儀于450 nm 處測(cè)定A值，計(jì)算細(xì)胞存活率，并篩選出最適藥物濃度。

細(xì)胞存活率＝(A給藥－A空白)/(A對(duì)照－A空白)

2.2.3 油紅O 染色 HepG2 細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種于96 孔，培養(yǎng)24 h 后，設(shè)置對(duì)照組、模型組、辛伐他?。?0 μmol/L）組、β-谷甾醇（100 μmol/L）組、蒙花苷（100 μmol/L）組、大黃素（50 μmol/L）組和金合歡素（100 μmol/L）組。除對(duì)照組外，其余各組加入500 μmol/L 油酸，各給藥組另加入相應(yīng)藥物培養(yǎng)24 h 后，根據(jù)油紅O 染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色，蒸餾水清洗3 次，于顯微鏡下觀察細(xì)胞脂滴，采用Image J 6.0 軟件分析細(xì)胞脂滴含量。

2.2.4 Western blotting 分析 Caco-2 細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，設(shè)置對(duì)照組（以不含胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)）、模型組（以含20%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)）、蒙花苷組（以含100 μmol/L 蒙花苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)）和大黃素組（以含50 μmol/L 大黃素的培養(yǎng)基培養(yǎng)），加入藥物培養(yǎng)24 h后用高效RIPA 組織/細(xì)胞快速裂解液提取細(xì)胞總蛋白，并使用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，加入脫脂牛奶，室溫封閉2 h，分別加入ABCA1 抗體（1∶500）和β-actin 抗體（1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜；TBST 洗滌3 次，每次10 min，加入二抗，室溫孵育2 h；TBST 洗滌3 次，每次10 min，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白條帶，采用Image J 6.0 軟件分析條帶灰度值。

2.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Image J 6.0 和GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并使用檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。

3 結(jié)果

3.1 地骨皮活性成分的篩選

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)查找，得到地骨皮有效成分37 個(gè)，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18 進(jìn)行篩選，同時(shí)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，最終獲得地骨皮中調(diào)血脂的潛在活性成分14 個(gè)（表1）。

表1 地骨皮的潛在活性成分Table 1 Potential active components of Lycii Cortex

3.2 成分靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)以及交集靶點(diǎn)的篩選

將TCMSP 和SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)得到的活性成分靶點(diǎn)合并去重后共得到393 個(gè)活性成分靶點(diǎn)，依據(jù)GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)相關(guān)的疾病靶點(diǎn)檢索結(jié)果，進(jìn)行數(shù)據(jù)合并及去重后得到1486 個(gè)靶點(diǎn)，之后將篩選出的成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)輸入Venny 2.1 取交集（圖1），得到153 個(gè)交集靶點(diǎn)，作為藥物作用于疾病的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

圖1 地骨皮成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的Venn 圖Fig.1 Venn diagram of component targets and disease targets of Lycii Cortex

3.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將得到的153 個(gè)藥物和疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到String 數(shù)據(jù)庫(kù)中，設(shè)置相互作用得分為最高0.9，剔除未參與蛋白互作的靶點(diǎn)，從而得到PPI網(wǎng)絡(luò)。將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape 3.8.2 軟件中進(jìn)行進(jìn)一步處理和分析見圖2，活性成分和靶點(diǎn)均以節(jié)點(diǎn)表示，相互關(guān)系則以邊表示。

圖2 活性成分與疾病交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network of intersection targets of active ingredient and disease

3.4 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將活性成分和疾病靶點(diǎn)篩選得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到Cytoscape 3.8.2 軟件中，構(gòu)建成分-交集靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)（圖3），活性成分、靶點(diǎn)以及疾病均以節(jié)點(diǎn)表示，相互關(guān)系則以邊表示。之后進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，以度值反映節(jié)點(diǎn)的重要程度，度值越大則表示其在該網(wǎng)絡(luò)中越重要。地骨皮中篩選的14 個(gè)成分中主要的活性成分為苦楝萜酮內(nèi)酯、莨菪堿、金色酰胺醇酯、醋酸芳樟酯、β-谷甾醇、大黃素、金合歡素等。

圖3 活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Active ingredient-target-disease target network

3.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析

將地骨皮調(diào)血脂作用交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行GO 功能富集分析（P＜0.5），主要包括生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能分析。如圖4所示，這些成分發(fā)揮作用的生物過(guò)程主要涉及細(xì)胞脂質(zhì)反應(yīng)、脂質(zhì)代謝過(guò)程的正調(diào)控、脂質(zhì)定位、脂質(zhì)定位的調(diào)節(jié)以及蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控等過(guò)程；分子功能主要是包括脂質(zhì)結(jié)合、絲氨酸型肽酶活性、酰胺結(jié)合、激酶結(jié)合、氧化還原酶活性、脂肪酸的結(jié)合和酪氨酸激酶活性；在細(xì)胞成分層面主要作用在細(xì)胞膜、細(xì)胞膜頂端以及細(xì)胞質(zhì)核周圍。進(jìn)一步進(jìn)行KEGG 通路富集分析，并根據(jù)P值的大小和富集基因數(shù)目篩選，如圖5所示，主要涉及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、脂肪消化吸收、膽汁分泌等過(guò)程，以及AMP 激活的蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）、PPAR 等信號(hào)通路。其中氣泡的顏色代表富集顯著性，顏色越紅，代表富集度越高；而氣泡的大小代表該通路上基因富集的數(shù)量，氣泡越大代表富集的基因數(shù)目越多。

圖4 GO 功能富集分析Fig.4 GO function enrichment analysis

圖5 KEGG 通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

3.6 活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

根據(jù)KEGG 通路富集分析從而構(gòu)建地骨皮化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)（圖6），節(jié)點(diǎn)的大小既反映度值大小，也反映各成分與靶點(diǎn)以及靶點(diǎn)與通路之間的關(guān)系，節(jié)點(diǎn)越大表示其關(guān)聯(lián)程度越高。地骨皮中篩選出的活性成分通過(guò)作用在脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、胰島素抵抗、脂肪消化吸收、膽汁分泌、AMPK、PPAR 等信號(hào)通路上的清道夫受體B1（scavenger receptor B1，SCARB1）、PPARα、PPARγ、糖原合酶激酶-3β（glycogen synthasc kinase-3β，GSK-3β）等蛋白靶點(diǎn)相互協(xié)同作用，從而發(fā)揮調(diào)血脂作用。

圖6 地骨皮活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Active ingredient-target-pathway network in Lycii Cortex

3.7 分子對(duì)接

將地骨皮中篩選出的14 個(gè)單體化合物與PPAR信號(hào)通路上的靶點(diǎn)蛋白PPARα 和PPARγ 進(jìn)行分子對(duì)接，總得分≥5 表明受體和配體親和力較大，對(duì)接越好。各配體分子和受體蛋白的分子對(duì)接得分結(jié)果見表2，可以看出莨宕堿、金合歡素、蒙花苷、阿托品、枸杞酰胺、β-谷甾醇以及大黃素得分均大于5，說(shuō)明這些化合物與PPAR 信號(hào)通路上的PPARα以及PPARγ 靶蛋白均表現(xiàn)出良好的結(jié)合作用。分子對(duì)接篩選出的關(guān)鍵活性成分莨宕堿、金合歡素、蒙花苷、阿托品、枸杞酰胺、β-谷甾醇以及大黃素與靶蛋白PPARα 和PPARγ 分子對(duì)接模型見圖7、8。

圖7 關(guān)鍵活性成分與靶點(diǎn)蛋白PPARα 對(duì)接模型圖Fig.7 Docking model of key components and target PPARα

表2 地骨皮活性成分與靶蛋白分子對(duì)接結(jié)果Table 2 Docking of core active ingredients of Lycii Cortex to key targets

圖8 關(guān)鍵活性成分與靶點(diǎn)蛋白PPARγ 對(duì)接模型圖Fig.8 Docking model of key components and target PPARγ

3.8 β-谷甾醇、蒙花苷、大黃素和金合歡素對(duì)HepG2 細(xì)胞活力的影響

經(jīng)過(guò)對(duì)比上述分子對(duì)接的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇、蒙花苷、大黃素以及金合歡素的得分結(jié)果要明顯高于其他成分的得分，說(shuō)明這4 個(gè)化合物與靶蛋白結(jié)合作用更好，可能是潛在的關(guān)鍵活性成分，因此選擇β-谷甾醇、蒙花苷、大黃素以及金合歡素進(jìn)行HepG2 細(xì)胞調(diào)血脂活性篩選。采用CCK-8 法考察不同濃度的β-谷甾醇、蒙花苷、大黃素和金合歡素對(duì)HepG2 細(xì)胞活力的影響，如圖9-A所示，與對(duì)照組比較，油酸組和辛伐他汀組對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，因此選取500 μmol/L 油酸作為造模濃度，20 μmol/L 辛伐他汀作為陽(yáng)性藥濃度；β-谷甾醇、蒙花苷和金合歡素在0～100 μmol/L 對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用，濃度為200 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞活力下降，因此選擇100 μmol/L 作為給藥濃度；大黃素在0～50 μmol/L 對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用，濃度為100 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞活力下降，因此選擇50 μmol/L 作為大黃素給藥濃度。

3.9 β-谷甾醇、蒙花苷、大黃素和金合歡素對(duì)油酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中脂滴含量的影響

如圖9-B所示，對(duì)照組HepG2 細(xì)胞中未出現(xiàn)明顯脂滴，500 μmol/L 油酸誘導(dǎo)的模型組細(xì)胞中出現(xiàn)大量脂滴（P＜0.01），說(shuō)明造模成功。與模型組比較，辛伐他汀組、β-谷甾醇組、蒙花苷組、大黃素組脂滴均明顯減少（P＜0.05、0.01），而金合歡素組效果并不顯著。

圖9 β-谷甾醇、蒙花苷、大黃素和金合歡素對(duì)HepG2 細(xì)胞活力(A)以及對(duì)油酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)積累(B)的影響(±s,n = 3)Fig.9 Effects of β-sitosterol,linarin,emodin and acacetin on viability of HepG2 cells(A)and lipid accumulation(B)in HepG2 cells induced by oleic acid(±s,n = 3)

3.10 蒙花苷與大黃素對(duì) Caco-2 細(xì)胞活力和ABCA1 蛋白表達(dá)的影響

根據(jù)HepG2 細(xì)胞調(diào)血脂活性篩選結(jié)果表明，蒙花苷、β-谷甾醇以及大黃素的作用效果較為顯著，而金合歡素并無(wú)顯示顯著效果；同時(shí)β-谷甾醇在多種藥材中均存在，其特征代表性較弱，分子對(duì)接得分結(jié)果也顯示蒙花苷和大黃素與靶蛋白PPARα 和PPARγ 的結(jié)合能力遠(yuǎn)強(qiáng)于β-谷甾醇，因此主要考察蒙花苷和大黃素對(duì)下游蛋白ABCA1 表達(dá)的影響，進(jìn)而評(píng)價(jià)其調(diào)血脂作用。

采用CCK-8 法考察蒙花苷及大黃素對(duì)Caco-2細(xì)胞活力的影響，如圖10-A所示，與對(duì)照組比較，蒙花苷在0～100 μmol/L 對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用，濃度為200 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞活力下降，所以選擇100 μmol/L 作為給藥濃度；大黃素在0～50 μmol/L 對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用，濃度為100 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞活力下降，所以選擇50 μmol/L 作為給藥濃度。

圖10 蒙花苷和大黃素對(duì)Caco-2 細(xì)胞活力(A)以及ABCA1 蛋白表達(dá)(B)的影響(±s,n = 3)Fig.10 Effects of linarin and emodin on viability of Caco-2 cells(A)and ABCA1 protein expression(B)(±s,n = 3)

ABCA1 是一種完整的細(xì)胞膜蛋白，能夠通過(guò)與載脂蛋白受體相互作用，從而影響高密度脂蛋白膽固醇的生物合成[10]，是影響膽固醇外流的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[11]。血脂的升高與膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)有著十分緊密的聯(lián)系，ABCA1 是介導(dǎo)肝臟中膽固醇輸出的關(guān)鍵蛋白，PPARγ/肝X 受體α（liver X receptor α，LXRα）/ABCA1 是一條經(jīng)典的脂質(zhì)代謝通路，PPARγ蛋白表達(dá)的升高可以激活下游相關(guān)蛋白如ABCA1的表達(dá)升高，從而促進(jìn)膽固醇以及脂質(zhì)的代謝。如圖10-B所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中ABCA1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），表明模型組細(xì)胞膽固醇外流顯著降低，增加了細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積。與模型組比較，給予蒙花苷（100 μmol/L）與大黃素（50 μmol/L）處理均有效地升高了ABCA1 蛋白的表達(dá)水平（P＜0.05、0.01），表明蒙花苷與大黃素可通過(guò)升高ABCA1 蛋白的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流，減少細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積，發(fā)揮調(diào)血脂作用。

4 討論

血脂異常是指成人血漿總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇升高和高密度脂蛋白膽固醇降低為特征的疾病[12]。血脂升高可引發(fā)外周血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、胰腺炎等[13]。大量研究結(jié)果表明，總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇水平升高在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，與人群中冠心病的發(fā)病率和病死率呈顯著正相關(guān)[14]。中醫(yī)古籍中無(wú)確切高脂血癥病名，《靈樞·五窿津液別》最早出現(xiàn)了有關(guān)“膏”的記載：“五谷之津液，和合而為膏者，內(nèi)滲于骨空，補(bǔ)益腦髓，而下流于陰股”，為后世醫(yī)家有關(guān)血脂異常的論述提供了思路。根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸屬為“痰濕”“痰濁”“眩暈”“瘀血”等證。我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療血脂異常有著悠久歷史?！鹅`樞·逆順?lè)适荨吩唬骸把獫釟鉂?，疾瀉之，則經(jīng)可通也?！惫湃苏J(rèn)為，濁之在血脈，須以清化通利之瀉法除去血中之濁物，方可脈通氣順。地骨皮性涼，歸肺、肝、腎經(jīng)，具有清熱涼血的功效，可以通過(guò)清化通利之法調(diào)節(jié)血脂。

本研究根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和檢索相關(guān)文獻(xiàn)，共篩選出莨菪堿、醋酸芳樟酯、金合歡素、蒙花苷、東莨菪苷、阿托品、柳杉酚、金色酰胺醇酯、苦楝萜酮內(nèi)酯、常春藤皂苷元、β-谷甾醇、豆甾醇、膽甾醇和大黃素14 個(gè)潛在活性成分，得到成分對(duì)應(yīng)的393個(gè)靶點(diǎn)和1486 個(gè)疾病靶點(diǎn)。將活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，得到153 個(gè)共有靶點(diǎn)。GO 功能分析顯示地骨皮的活性成分發(fā)揮調(diào)血脂作用主要涉及細(xì)胞脂質(zhì)反應(yīng)、脂質(zhì)代謝過(guò)程的正調(diào)控以及蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控等過(guò)程，這些成分可能是通過(guò)作用在細(xì)胞膜、細(xì)胞膜頂端以及細(xì)胞質(zhì)核周圍，從而影響脂質(zhì)結(jié)合、氧化還原酶活性、脂肪酸的結(jié)合和酪氨酸激酶活性等分子功能。KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)主要涉及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、胰島素抵抗、脂肪消化吸收、膽汁分泌、AMPK、PPAR 等信號(hào)通路。胰島素抵抗容易導(dǎo)致代謝綜合征、2 型糖尿病以及肥胖等癥狀，可引起血管內(nèi)皮功能障礙、血脂異常、高血壓和血管炎癥等[15]。研究發(fā)現(xiàn)，地骨皮水提物可以顯著降低2 型糖尿病大鼠的空腹血糖，改善血脂異常和肝臟病理變化，可能是通過(guò)作用于AMPK信號(hào)通路上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4（glucose transporter 4，GLUT4）和PPARα 蛋白表達(dá)水平，下調(diào)GSK-3β 蛋白表達(dá)來(lái)改善胰島素抵抗[16]。胰島素抵抗發(fā)生的主要原因是炎性細(xì)胞因子的升高，從而干擾胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中胰島素抵抗的正常磷酸化，進(jìn)一步阻斷下游信號(hào)激活的一系列級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，從而影響胰島素的生成、轉(zhuǎn)運(yùn)等生理功能，引起胰島素抵抗，目前研究較多的炎性細(xì)胞因子引起胰島素抵抗的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要是與AMPK、GSK-3β、蛋白酪氨酸磷酸酶-1B（protein tyrosine phosphatase-1B，PTP-1B）、c-Jun 氨基末端激酶（c-JunN-terminal kinase，JNK）以及核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)[17]。大黃素能夠降低KKAγ 小鼠空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油等，還能減少炎癥反應(yīng)，能夠上調(diào)KKAγ 小鼠骨骼肌和脂肪組織PPARγ及GLUT4的mRNA 和蛋白表達(dá)水平，從而促進(jìn)骨骼肌和脂肪組織對(duì)體內(nèi)葡萄糖的攝取，改善胰島素抵抗[18]。microRNA-192 與脂肪代謝有關(guān)，miR-192 表達(dá)的激活以及甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1（sterol regulatory element binding transcription factor 1，SREBF1）、PPARγ 表達(dá)的下調(diào)能夠促進(jìn)豬卵母細(xì)胞的脂質(zhì)代謝[19]。PPAR 信號(hào)通路是發(fā)揮調(diào)血脂作用的一條重要途徑，PPAR 信號(hào)通路上的蛋白如PPARα、PPARγ 等能夠影響脂肪吸收、脂肪代謝、脂質(zhì)合成等一系列的代謝相關(guān)重要環(huán)節(jié)[20]。同時(shí)PPARγ 作為核受體，可以通過(guò)降低游離脂肪酸水平調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪因子分泌，促進(jìn)機(jī)體對(duì)葡萄糖的利用，進(jìn)一步改善胰島素抵抗[21]。AMPK 信號(hào)通路被激活后，下游通路與脂質(zhì)合成相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)水平下調(diào)，同時(shí)能導(dǎo)致ACC 磷酸化水平提高，從而抑制脂質(zhì)生成，達(dá)到調(diào)節(jié)脂肪代謝的作用[22]。

PPARα 具有多效性，能夠參與脂肪酸代謝、膽固醇代謝等過(guò)程，可以調(diào)節(jié)高密度脂蛋白膽固醇、載脂蛋白ApoI和ApoII，減少肝合成和釋放低密度脂蛋白膽固醇，調(diào)節(jié)血脂。激活的PPARα 可以促進(jìn)脂蛋白脂肪酶合成，催化脂蛋白中的三酰甘油脂解成為游離脂肪酸，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[23]。PPARγ 有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，在脂肪細(xì)胞分化調(diào)控、機(jī)體糖脂代謝平衡的調(diào)節(jié)、胰島素敏感性增強(qiáng)等方面均發(fā)揮重要的作用[24]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，地骨皮的調(diào)血脂潛在有效成分莨宕堿、金合歡素、蒙花苷、阿托品、金色酰胺醇酯、β-谷甾醇以及大黃素與靶蛋白PPARα 和PPARγ 的對(duì)接總得分均≥5，說(shuō)明地骨皮核心潛在活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子生物結(jié)合親和力高，具有較好的藥效活性。經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)金合歡素、蒙花苷、β-谷甾醇以及大黃素的得分結(jié)果要明顯高于莨宕堿、阿托品和金色酰胺醇酯的得分，說(shuō)明這4 個(gè)化合物的結(jié)合能力更強(qiáng)，藥效活性可能更好。推測(cè)地骨皮中可能主要是金合歡素、蒙花苷、β-谷甾醇以及大黃素等潛在活性成分通過(guò)作用關(guān)鍵靶蛋白PPARα 和PPARγ 等，調(diào)控PPAR、AMPK、胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝等信號(hào)通路起到調(diào)血脂的作用。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，金合歡素和蒙花苷屬于黃酮類化合物，這類成分能夠改善血管的通透性及脆性，調(diào)節(jié)血脂和膽固醇[25]。席梅等[26]對(duì)金合歡素的調(diào)血脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)金合歡素能使HepG2 細(xì)胞中低密度脂蛋白受體mRNA 和蛋白的水平顯著升高，降低小鼠血清中的總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的水平，具有調(diào)血脂的效果。β-谷甾醇是植物甾醇類成分，是中藥發(fā)揮調(diào)血脂的活性成分之一，可以通過(guò)抑制腸道中膽固醇的吸收、降低血清總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇來(lái)改善血脂異常[27]。張帆[28]研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇等6 種植物甾醇能顯著降低Caco-2 對(duì)膽固醇的吸收，發(fā)揮調(diào)血脂作用。地骨皮中的蒽醌類成分也具有一定的調(diào)血脂作用[5-6]。韓偉等[29]對(duì)高脂血癥模型鵪鶉連續(xù)ig 大黃素8 周，發(fā)現(xiàn)大黃素能顯著降低血清總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、丙二醛以及脂質(zhì)過(guò)氧化物的含量，具有顯著的調(diào)血脂作用。莨菪堿和阿托品是莨菪烷類生物堿，這類成分能明顯改善微循環(huán)和組織的缺血、缺氧狀態(tài)，改善血液流變、穩(wěn)定細(xì)胞膜、改善心功能和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等[30]，金色酰胺醇酯具有一定的抗炎活性[31]，而關(guān)于這幾種成分調(diào)血脂方面研究還有待進(jìn)一步深入。同時(shí)根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果顯示金合歡素、蒙花苷、β-谷甾醇以及大黃素的調(diào)血脂作用可能更為顯著，因此選擇將金合歡素、蒙花苷、β-谷甾醇以及大黃素作用于HepG2 細(xì)胞，進(jìn)行體外調(diào)血脂活性篩選。結(jié)果顯示蒙花苷、β-谷甾醇以及大黃素對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)蓄積具有一定的抑制作用，可能是發(fā)揮調(diào)血脂作用的關(guān)鍵活性成分，而金合歡素對(duì)HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)的蓄積并無(wú)顯著效果?？赡苁怯捎诮鸷蠚g素與PPARα 和PPARγ等靶蛋白結(jié)合后影響了其他調(diào)血脂有關(guān)的通路發(fā)揮作用，并未對(duì)細(xì)胞中脂質(zhì)蓄積產(chǎn)生影響[26]。

肝臟中ABCA1 的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)膽固醇的外排，導(dǎo)致肝細(xì)胞中的脂質(zhì)積累減少以及高密度脂蛋白膽固醇水平的升高，從而發(fā)揮一定的調(diào)血脂作用[32]。Western blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蒙花苷和大黃素給藥后顯著升高了ABCA1 蛋白表達(dá)水平，從而促進(jìn)了細(xì)胞中膽固醇的外流以及脂質(zhì)的代謝，發(fā)揮調(diào)血脂作用。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究發(fā)現(xiàn)地骨皮中的蒙花苷、大黃素以及β-谷甾醇等活性成分可能是通過(guò)作用于PPARα、PPARγ 等多個(gè)靶點(diǎn)，進(jìn)而影響PPAR、AMPK、胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝等信號(hào)通路上與調(diào)血脂有關(guān)的蛋白表達(dá)，改善和影響細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流以及脂質(zhì)積累，發(fā)揮調(diào)血脂作用。因此地骨皮可能是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路來(lái)實(shí)現(xiàn)調(diào)血脂作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突