李偉慷，崔清卓#，鄭玉光，張一昕，郭炳顏，趙京山,2,*，劉 琳

1.河北中醫(yī)學院藥學院，河北省中藥炮制創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050020

2.河北中醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，河北 石家莊 050020

3.河北省中藥資源利用與質量評價國際聯(lián)合研究中心，河北 石家莊 050020

4.河北醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，河北 石家莊 050020

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是冠心病、卒中、心肌梗死等多種心血管疾病的主要原因，也是造成全球人口死亡最主要的病因。AS 表現(xiàn)為細胞和富含脂質的斑塊沉積于內膜下，浸潤的白細胞和巨噬細胞促進血管炎癥、斑塊生長和破裂，最終導致動脈血栓形成，堵塞動脈血管。因此，傳統(tǒng)理論認為AS 源于內皮損傷，是“由內到外”的反應過程。然而，支架置入或球囊血管成形術損傷內皮后，在新生內膜產(chǎn)生之前，血管外膜成纖維細胞（vascular adventitial fibroblasts，VAFs）早已開始增殖并遷移到內膜區(qū)域，分泌細胞外基質蛋白產(chǎn)生新生內膜[1]。近一半的新生內膜細胞來源于增殖的外膜成纖維細胞，表明動脈外膜參與血管重構反應。因此，越來越多的研究證實，AS 的發(fā)生發(fā)展可能是“由外而內”的過程[1]，構成外膜的VAFs 發(fā)揮著重要作用。中醫(yī)對心血管疾病的研究在不斷深入，吳以嶺院士的脈絡學說為心血管疾病的防治提供了理論依據(jù)，其核心理論為營衛(wèi)承制調平。營氣與血管內膜，衛(wèi)氣與血管外膜具有相關性。營行脈中，衛(wèi)行脈外，衛(wèi)外固護，阻邪于外，營衛(wèi)調和，才能發(fā)揮血管舒縮功能；反之，“營衛(wèi)不通，血凝不流。”心血管病在中醫(yī)中歸屬“胸痹”的范疇，衛(wèi)氣失常是胸痹的始動因素，衛(wèi)失固護，腠理疏松，痰瘀邪氣入脈，久而脈積[2]，這與近年來醫(yī)學對血管外膜的研究成果相一致。

炎癥是AS 及其相關的心血管疾病的主要驅動因素，抑制炎癥能夠治療AS。白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的單克隆抗體canakinumab可降低患者心血管事件復發(fā)的風險[3]。NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥小體由NLRP3、凋亡斑點樣蛋白（apoptotic spot-like protein，ASC）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）組成，ASC可以通過與pro Caspase-1 結合激活Caspase-1，進而促進IL-1β、IL-18 及下游炎癥通路的激活[4]。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）及核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）為NLRP3 炎性小體的上游分子。研究表明，TLR4/NF-κB/NLRP3 信號通路在心肌缺血/再灌注損傷及心肌損傷中發(fā)揮重要作用[5-6]。然而，TLR4/NF-κB/NLRP3 信號通路在血管重塑及AS 中對血管外膜的作用有待進一步研究。

心血管疾病在中醫(yī)中統(tǒng)稱為“胸痹”，常以活血化瘀藥治療。中醫(yī)認為胸痹主要病位在心和血脈，血液濃稠、凝固，心脈瘀阻而“胸痹”，當以活血化瘀、宣痹通脈。紅花是我國應用廣泛的活血化瘀藥，紅花及其水提物常用于輔助治療冠心病、腦梗死、冠狀AS。羥基紅花黃色素A（hydroxylsafflower yellow A，HSYA）是紅花的主要活性成分，在心血管疾病中發(fā)揮重要保護作用[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，HSYA能夠通過AMP 依賴的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/NF-κB/NLRP3 信號通路抑制支氣管炎，從而減輕小鼠的哮喘癥狀[9]，還可通過抑制NLRP3 炎癥小體激活保護心肌缺血/再灌注損傷[10]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HSYA 能夠通過調控自噬抑制血管緊張素II（angiotensin II，ANG II）誘導的VAFs 遷移，改善血管重塑[11]。然而，HSYA在TLR4/NF-kB/NLRP3 信號通路中的作用目前尚未被研究。本研究主要探討HSYA 是否通過調控TLR4/NF-kB/NLRP3 信號通路抑制ANG II誘導的VAFs 遷移，為HSYA 改善血管重塑及治療AS 提供實驗基礎和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠，體質量160～200 g，6 周齡，購自河北省實驗動物中心，動物合格證號IP08169。動物飼養(yǎng)于河北中醫(yī)學院動物房，遵循SPF級動物飼養(yǎng)條件，環(huán)境溫度穩(wěn)定為24 ℃，相對濕度為45%，通風，12 h/12 h 光照/黑暗交替，自由飲食。動物實驗遵循實驗動物護理原則，并經(jīng)河北中醫(yī)學院動物保護委員會批準（批準號DWLL202203044）。

1.2 藥品與試劑

羥基紅花黃色素A（批號2021100361，質量分數(shù)為99%）購自上海源葉生物科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批號2022060581）、血管緊張素II（批號2022031156）購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基（批號2022011271）購自美國Gibco 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號2021051623）購自杭州四季青生物科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔抗大鼠抗體（批號2022061362）購自英國Abcam公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）兔抗大鼠抗體（批號2022040511）、波形蛋白（Vimentin）兔抗大鼠抗體（批號CY5134）、NLRP3兔抗大鼠抗體（批號2022030316）、Caspase-1 兔抗大鼠抗體（批號202205187）、HRP 標記的IgG 二抗（批號2022040315）、山羊抗兔488 熒光二抗（批號2022032619）、山羊抗兔 594 熒光二抗（批號2022050106）購自上海泊灣生物科技有限公司；ASC兔抗大鼠抗體（批號2022020817）購自美國Affinity Biosciences 公司；TLR4 抗體、NF-κB 抗體、p-NFκB 抗體、核質蛋白提取試劑盒（批號2022180627）購自上海泊灣生物科技有限公司；CCK-8 試劑盒（批號2022060721）購自上海圣爾生物有限公司。

1.3 儀器

SW-CJ-2FD 型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；311 型細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；VICTOR Nivo 型多功能微孔讀數(shù)儀（德國Perkln Elmer 公司）；ECLIPSE Ti2 型倒置相差顯微鏡、ECLIPSE TS2 型熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）；5804 型高速離心機（德國Eppendorf公司）；1645050 型電泳、電轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；Fusion FX5 Spectra 型多功能成像系統(tǒng)（法國Vilber 公司）。

2 方法

2.1 原代VAFs 培養(yǎng)

大鼠ip 25%烏拉坦（10 mL/kg）麻醉，固定，75%乙醇消毒，打開胸腔，取出胸主動脈。PBS 清洗主動脈后，去除血管外膜周圍的脂肪組織，縱切面剪開血管，清洗管腔，去除血管內皮細胞和中層平滑肌細胞，將剩余的血管外膜剪成小塊（1 mm2/塊），用含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

組織貼壁培養(yǎng)1 周后，用0.25%胰酶消化組織貼塊周圍的細胞，待細胞由梭形變圓時，去除胰酶，并用培養(yǎng)基終止消化過程。收集細胞懸液，1000 r/min 離心10 min，棄上清，獲得P0 代VAFs。細胞按1∶3 傳至P3 代，獲得實驗用VAFs。通過免疫熒光實驗鑒定VAFs。

2.2 ANG II 及HSYA 的量效、時效關系確定

將細胞按3000 個/孔接種于96 孔板，待細胞處于對數(shù)生長期時，在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，然后添加100 μL 含不同濃度梯度的ANG II（0、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9mol/L）或HSYA（0、5、10、20、40、80、160 μmol/L）的培養(yǎng)基刺激細胞，并設置對照組（無細胞培養(yǎng)基），細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用CCK-8 法檢測細胞活力。確定ANG II及HSYA 作用濃度后，將細胞接種于96 孔板，接種密度和培養(yǎng)條件相同。細胞饑餓刺激后，將ANG II或HSYA 的作用時間設置為0、12、24、48 h，并設置對照組，采用倒序給藥法對細胞給予ANG II或HSYA 刺激。最后一次給藥即為0 h，給藥結束后，CCK-8 法檢測細胞活力，平行測定6次，實驗重復3 次，取平均值。

2.3 CCK-8 法測定VAFs 活力

將對數(shù)生長期的細胞接種于96 孔板，待細胞穩(wěn)定生長時，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，給予ANG II或HSYA 刺激，每組設置6 個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，37 ℃孵育1 h 后，酶標儀檢測490 nm 處的吸光度（A）值，計算細胞活力。實驗重復3 次。

2.4 Western blotting 檢測ANG II 誘導的VAFs 中TLR4 和NF-κB 蛋白表達

VAFs 以2×105個/孔接種于6 孔板，待細胞對數(shù)生長后，設置對照組、ANG II組和HSYA（20、40、60 μmol/L）組，對照組給予培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，其余各組給予1×10-7mol/L ANG II處理24 h 構建ANG II誘導的VAFs 遷移模型。然后更換為含不同濃度HSYA 的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集各組細胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜；加入二抗孵育后，利用化學發(fā)光法將蛋白印跡顯色。

2.5 免疫熒光實驗

VAFs 以1×104個/孔接種于放置無菌爬片的24孔板，培養(yǎng)48 h。設置對照組、ANG II組、HSYA 組、LPS 組和LPS＋HSYA 組，對照組給予培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，其余各組給予1×10-7mol/L ANG II處理24 h 構建ANG II誘導的VAFs 遷移模型。然后更換為含100 nmol/L LPS 或40 μmol/L HSYA 的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出爬片，使用0.25% Triton X 100 打孔，滴加37 ℃山羊血清封閉30 min，滴加兔抗鼠NLRP3、Vimentin、α-SMA、ACS 抗體（1∶200），37 ℃封閉1 h；滴加山羊抗兔594 熒光二抗，避光封閉30 min，滴加DAPI封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 劃痕實驗

VAFs 以2×105個/孔接種于6 孔板，待細胞對數(shù)生長，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h 后，用無菌槍頭在細胞上劃線，按“2.5”項下方法分組，LPS 提前3 h 預處理細胞，再加入相應濃度的ANG II和HSYA。拍照記錄給藥0 h 細胞狀態(tài)，更換為含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨機選取3 個劃痕視野拍照記錄24 h 細胞狀態(tài)，計算細胞遷移率。

遷移率＝(0 h 劃痕寬度－24 h 劃痕寬度)/0 h 劃痕寬度

2.7 統(tǒng)計學分析

采用Graphpad Prism 5 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結果以±s表示，One-way ANOVA 用于多組比較分析，t檢驗用于兩兩比較分析。

3 結果

3.1 原代VAFs 的形態(tài)及鑒定

VAFs 形態(tài)為梭形，大鼠胸主動脈血管外膜組織貼塊爬出的細胞形態(tài)符合VAFs（圖1-A）。免疫熒光染色檢測VAFs 的標志蛋白Vimentin 及血管平滑肌細胞的標志蛋白α-SMA，如圖1-B所示，Vimentin呈陽性表達，未見α-SMA 表達，進一步證實VAFs培養(yǎng)成功。

圖1 VAFs 形態(tài)(A，×100)及α-SMA、Vimentin 蛋白表達(B，×400)Fig.1 Morphology(A,× 100),α-SMA and Vimentin protein expressions(B,× 400)of VAFs

3.2 ANG II 的劑量及作用時間確定

利用CCK-8 法檢測ANG II處理VAFs 后細胞活力的變化，確定ANG II的作用濃度和刺激時間。如圖2所示，1×10-7mol/L ANG II促進細胞生長的作用最強（P＜0.01），因此，選用1×10-7mol/L 的ANG II進行后續(xù)實驗。進一步的作用時效結果顯示，ANG II的作用時效呈鐘形，即細胞活力隨著作用時間增加顯著增強，24 h 作用最強（P＜0.01），24 h 后隨時間延長細胞活力逐漸降低，因此后續(xù)ANG II作用時間選擇24 h。

圖2 ANG II 對VAFs 活力的量效(A)和時效(B)關系(±s,n = 6)Fig.2 Dose-effect(A)and time-dependent(B)of ANG Ⅱ on cell viability of VAFs(±s,n = 6)

3.3 HSYA 的劑量及作用時間確定

利用CCK-8 法檢測HSYA 處理VAFs 后細胞活力的變化，確定HSYA 的作用濃度和刺激時間，如圖3所示，HSYA 能夠顯著抑制VAFs 活力（P＜0.05、0.01），當作用濃度達到40 μmol/L，細胞抑制率達到50%，當作用濃度達到80 μmol/L 時，細胞出現(xiàn)萎縮。因此，選用40 μmol/L 的HSYA 進行后續(xù)實驗。進一步的作用時效結果顯示，隨著HSYA 作用時間延長至24 h，細胞活力顯著下降（P＜0.01）；繼續(xù)延長至48 h，細胞活力下降50%，但出現(xiàn)皺縮，因此后續(xù)HSYA 作用時間選擇24 h。

3.4 HSYA 抑制TLR4/NF-κB 信號通路

如圖4所示，與對照組比較，ANG II組TLR4蛋白表達水平顯著升高（P＜0.001），p-NF-κB 和核內NF-κB 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05、0.001）；與ANG II組比較，HSYA 組TLR4 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01、0.001），HSYA（40、60 μmol/L）組p-NF-κB 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），HSYA 各劑量組核內NF-κB 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），表明HSYA 能夠抑制TLR4/NF-κB 信號通路，并且可以抑制NF-κB的磷酸化和入核。

圖4 HYSA 抑制ANG II 誘導的VAFs 中TLR4、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達(±s,n = 4)Fig.4 HSYA inhibited the expression of TLR4,NF-κB and p-NF-κB protein expressions(±s,n = 4)

3.5 HSYA 抑制NLRP3 和ASC 共表達

如圖5所示，與對照組比較，ANG II組NLRP3和ASC 熒光強度增加，NLRP3 和ASC 共表達增加，提示ANG II促進NLRP3 炎性小體激活和組裝。與ANG II組比較，HSYA 組NLRP3 和ASC 熒光強度減弱，NLRP3 和ASC 共表達減少，表明HSYA 能夠抑制NLRP3 炎性小體的組裝和激活。

圖5 HSYA 抑制NLRP3 和ASC 共表達(×400)Fig.5 HSYA inhibited the co-expression of NLRP3 and ASC(× 400)

3.6 HSYA 抑制ANG II 及LPS 誘導的VAFs 遷移

LPS 能夠激活TLR4/NF-κB 信號通路，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)HSYA 能夠抑制ANG II誘導的VAFs的遷移[11]。為了確定HSYA 抑制VAFs 的遷移作用與TLR4/NF-κB 有關，在ANG II誘導的VAFs 遷移模型上對細胞進行LPS 刺激，通過劃痕實驗檢測細胞遷移情況，如圖6所示，與對照組比較，ANG II組細胞遷移率顯著增加（P＜0.01）；與ANG II組比較，HSYA 組細胞遷移率顯著降低（P＜0.01），LPS組細胞細胞遷移率增加；與LPS 組比較，LPS＋HSYA 組細胞遷移率顯著降低（P＜0.01），表明HSYA 能夠逆轉LPS 對VAFs 遷移的促進作用。

圖6 HSYA 對LPS 誘導的VAFs 遷移的作用(×40，±s,n = 4)Fig.6 Effect of HSYA on LPS-induced VAFs migration(× 40,±s,n = 4)

3.7 HSYA 抑制LPS 誘導的VAFs 中NLRP3 和ASC 共表達

為了進一步確定HSYA 可通過調控TLR4/NFκB 通路抑制NLRP3炎癥小體的激活，檢測LPS 刺激的VAFs 細胞中NLRP3 炎癥小體相關蛋白的共表達。如圖7所示，與對照組比較，ANG II組NLRP3和ASC 蛋白共表達增加；與ANG II組比較，HSYA組NLRP3 和ASC 蛋白共表達降低，LPS 組NLRP3和ASC 蛋白共表達增加；與LPS 組比較，LPS＋HSYA 組NLRP3 和ASC 蛋白共表達降低，HSYA逆轉了LPS 對VAFs 中Caspase-1 和ASC 的共表達，表明HSYA 靶向抑制NLRP3 炎性小體組裝。LPS 為TLR4/NF-κB 通路及NLRP3炎癥小體的激活的上游刺激物質，能夠激活TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路，HSYA 能夠抑制LPS 刺激的NLRP3炎癥小體的組裝及VAFs 的遷移。以上結果表明HSYA通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3 通路抑制LPS 誘導NLRP3 炎性小體激活。

圖7 HSYA 對LPS 誘導的NLRP3 和ASC 共表達的作用(×40)Fig.7 Effect of HSYA on LPS-induced co-expression of NLRP3 and ASC(× 40)

4 討論

動脈血管由以內皮細胞為主的內膜、以血管平滑肌細胞為主的中膜以及富含膠原纖維的外膜組成。內皮細胞和血管平滑肌細胞已受到血管生物學家的廣泛關注，而構成外膜的主要細胞類型——外膜成纖維細胞在很大程度上被忽視。然而，越來越多的實驗數(shù)據(jù)表明，血管外膜在AS 和高血壓等血管疾病中發(fā)揮關鍵調節(jié)作用[12-13]。外膜作為血管壁的主要“損傷感知組織”，在內膜發(fā)生改變之前，VAFs 早已對缺氧、血管膨脹、損傷及炎癥等環(huán)境壓力做出反應，表現(xiàn)為VAFs 激活、增殖并遷移至內膜和中膜，進而導致血管重構[14]。另外，遷移的VAFs能夠增加細胞因子的分泌，直接影響血管平滑肌細胞張力，促進血管炎癥發(fā)生，從而影響整個血管張力和血管壁結構[15-16]。因此，VAFs 能夠“由外而內”調節(jié)血管的功能和結構。抑制VAFs 的遷移，能夠改善血管纖維化、AS 及其相關的心血管疾病。

心血管疾病在中醫(yī)中屬“脈絡-系統(tǒng)性疾病”，從《絡病學》的“絡病證治”到《脈絡論》的“絡脈學說”，其核心理論為營衛(wèi)承制調平。衛(wèi)氣失常，衛(wèi)外不固，腠理疏松，痰濁瘀血邪氣易侵，久則脈積，易發(fā)中風、胸痹等。脈積與西醫(yī)中AS 相關，是心血管疾病的發(fā)病基礎。血管外膜護衛(wèi)不利，外膜滋養(yǎng)血管增多，招募炎癥細胞[17]，促進成纖維細胞活化，發(fā)生表型轉化，向內膜遷移，造成內膜增生增厚[18]，導致血液瘀阻，從而促進心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。中醫(yī)衛(wèi)營調平與血管外內膜穩(wěn)態(tài)具有相關性，固衛(wèi)外，消瘀堵，在疾病早期抑制血管外膜重構或可成為潛在治療靶點。

持續(xù)的炎癥免疫反應在動脈硬化不穩(wěn)定斑塊的形成、發(fā)展和破裂過程中發(fā)揮重要作用。TLR4 是一種跨膜轉導受體，能夠與LPS 結合，NF-κB 及其轉錄調控的各種炎性細胞因子，在AS 的發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵作用[19]。抑制TLR4/NF-κB 通路可減輕AS[20]。因此，TLR4/NF-κB 通路在LPS 感染中起重要作用。除TLR4/NF-κB 通路外，NLRP3炎癥小體的激活在AS 的發(fā)展過程發(fā)揮重要作用[21]。NLRP3可調節(jié)IL-1β 和IL-18 的生成，參與炎癥介導的斑塊的形成與發(fā)展[21]。因此TLR4、NF-κB、NLRP3 炎癥小體是AS 等炎癥性疾病的有前景的藥理靶點。

紅花是經(jīng)典的活血化瘀藥，常用于治療多種心腦血管疾病。HSYA 為紅花最主要的有效成分，在多種疾病中發(fā)揮重要作用[7-8]。研究表明，HSYA 可通過抑制炎癥減輕小鼠的哮喘癥狀[9]，HSYA 還可通過蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路抑制內皮損傷及血管平滑肌細胞的遷移減輕AS[22-23]。然而，HSYA 能否通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3 通路抑制ANG II誘導的VAFs 的遷移，改善血管重構，目前尚未被研究。本研究利用ANG II誘導VAFs的增殖和遷移，并給予細胞LPS 刺激，探究HSYA在LPS 誘導的TLR4/NF-κB/NLRP3 炎癥通路中的作用。通過免疫熒光實驗鑒定大鼠主動脈組織貼塊法培養(yǎng)的細胞為VAFs。ANG II及HSYA 的量效、時效結果確定ANG II和HSYA 的最佳作用濃度分別為1×10-7mol/L 和40 μmol/L，作用時間均為24 h。Western blotting 結果顯示，ANG II刺激顯著增加VAFs 中TLR4 及NF-κB 的磷酸化水平，還能升高核內NF-κB 含量；HSYA 能夠顯著抑制ANG II誘導的TLR4 及NF-κB 的磷酸化水平升高，抑制效果與作用濃度正相關。NLRP3 炎性小體的激活在血管重塑中發(fā)揮重要作用，為了明確HSYA 對ANG II誘導的VAFs 遷移的抑制作用與NLRP3 炎癥小體有關，檢測細胞中NLRP3炎癥小體的組裝情況，結果顯示，與對照組比較，ANG II組細胞中NLRP3和ASC 熒光重合后，熒光強度增加，提示ANG II促進NLRP3 和ASC 的共表達，以上結果表明，ANG II促進NLRP3 炎性小體組裝。與ANG II組比較，隨著HSYA 劑量增加，VAFs 中NLRP3 和ASC 的共表達逐漸降低，表明ANG II誘導的VAFs 中NLRP3炎性小體的激活被HSYA 顯著抑制。劃痕實驗結果表明，HSYA 能夠顯著抑制ANG II及LPS 誘導的VAFs 遷移。LPS 為NLRP3 炎性小體的上游，能夠激活NLRP3 炎性小體[24]。對細胞進行LPS 刺激，檢測HSYA 對LPS 誘導的NLRP3 炎性小體激活的作用。采用免疫熒光雙染實驗同時檢測ASC 和NLRP3 蛋白，免疫熒光結果顯示LPS 誘導ASC 和NLRP3 共表達增加，提示LPS 促進NLRP3 炎性小體的組裝，而HSYA 逆轉了這一作用，表明HSYA 通過抑制NLRP3 炎性小體的組裝和激活抑制ANG II誘導的VAFs 遷移。

無菌性炎癥在早期和晚期AS 的發(fā)展中起著重要作用[25]。TLR4 信號參與AS 的進展[20]，NLRP3炎性小體激活pro Caspase-1 的切割，促進炎癥細胞因子的IL-1β 成熟與釋放，加劇血管重構。VAFs 作為血管損傷響應的前哨細胞，啟動并參與AS 相關的血管重構。因此，進一步探究HSYA 對ANG II誘導的TLR4/NF-κB 通路及NLRP3 炎性小體組裝的影響。發(fā)現(xiàn)ANG II刺激能夠激活TLR4/NF-κB 通路，促進NF-κB 的磷酸化與入核、NLRP3 炎性小體的組裝，從而激活TLR4/NF-κB/NLPR3 通路的炎癥反應；HSYA 能夠抑制LPS 誘導的NLRP3 炎性小體組裝及VAFs 的遷移和增殖，進而抑制血管重塑及其相關的心血管疾病。以上結果表明TLR4/NFκB/NLPR3 通路在VAFs 遷移和表型轉化中起重要作用，進一步證實了HSYA 通過影響TLR4/NFκB/NLPR3 通路，抑制ANG II誘導的VAFs 遷移。

本研究發(fā)現(xiàn)，HSYA 能夠通過 TLR4/NFκB/NLPR3 信號通路抑制ANG II誘導的VAFs 遷移。然而，HSYA 具有半衰期短、體內消除速度、口服生物利用度較低的特點[26-27]。HSYA 在體內是否能夠顯著改善ANG II誘導的血管重塑，需要進一步的動物實驗來驗證。另外，HSYA 在臨床上常以血必凈注射液或丹紅注射液等復方制劑形式用藥。因此，在研究HSYA 調控VAFs 遷移相關的血管重塑的作用機制的基礎上，還應結合HSYA 在體內的代謝方式，選擇合適的藥用輔料，延長藥物在體內的半衰期，為其臨床治療血管重塑性疾病提供實驗基礎依據(jù)。綜上，HSYA 通過抑制TLR4/NFκB/NLPR3 通路抑制ANG II誘導的VAFs 遷移，改善血管重塑。HSYA 可能是治療血管重塑性疾病的一個潛在的治療候選藥物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突