高一波，李佳妍，石子琪，寧 青*，韋英杰*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028

2.江蘇省中醫(yī)藥研究院，國家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點研究室，江蘇 南京 210028

3.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210028

4.煙臺毓璜頂醫(yī)院 藥學(xué)部，山東 煙臺 264000

補骨脂為豆科植物補骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果實，溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉，用于治療腎陽不足、陽痿遺精、遺尿尿頻、腰膝冷痛、腎虛作喘、五更泄瀉；外用消風(fēng)祛斑，治療白癜風(fēng)、斑禿[1]。補骨脂始載于《雷公炮炙論》，臨床應(yīng)用歷史悠久廣泛，據(jù)藥智數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，含補骨脂的中成藥方劑有224 種，保健食品達(dá)52 種。補骨脂常作為傳統(tǒng)補益類中藥，亦為骨傷科要藥，但近年來含補骨脂的復(fù)方制劑如骨康膠囊、仙靈骨葆口服制劑等的肝損傷風(fēng)險引起關(guān)注[2-3]。合理配伍使用是其臨床應(yīng)用安全有效的重要手段。武文星等[4]采用數(shù)據(jù)挖掘分析了補骨脂的配伍特點，杜仲是與補骨脂配伍的第4 位高頻藥味，2 味藥物配伍組合中支持度最高的為補骨脂-當(dāng)歸（28.61%）和補骨脂-杜仲（28.44%）。青娥丸為杜仲配伍補骨脂的代表補腎良方，首載于宋代《太平惠民和劑局方》，現(xiàn)收載于《中國藥典》2020年版一部，且未見臨床肝損傷相關(guān)不良反應(yīng)報道，探討補骨脂-杜仲配伍減毒作用對臨床安全用藥具有意義。

課題組前期用斑馬魚高效篩選驗證杜仲為補骨脂配伍減毒的較優(yōu)藥味，并探討了代表成分桃葉珊瑚苷對補骨脂素（psoralen，PS）的減毒作用[5]。補骨脂化學(xué)成分復(fù)雜，主要含香豆素類、黃酮類和單萜酚類，其中香豆素類包括苷元[以PS 和異補骨脂素（isopsoralen，IPS）為代表]及其糖苷[補骨脂苷（psoralenoside，PSS）和異補骨脂苷（isopsoralenoside，IPSS）為代表]，是抗骨質(zhì)疏松的主要活性成分[6-7]，也是補骨脂水煎液中主要成分（約為香豆素類、黃酮類和單萜酚類3 類成分含量之和的90%以上），其中糖苷含量約是苷元的8.2 倍[8]。近年研究表明，香豆素是補骨脂潛在肝損傷風(fēng)險成分之一，PS 和IPS 都能對大鼠的肝臟系數(shù)造成一定負(fù)面影響且會引起丙氨酸代謝、甘氨酸代謝、尿素循環(huán)等通路的混亂，還可能通過抑制膽汁酸在肝臟中的排泄，使得毒素大量堆積在肝細(xì)胞中，引發(fā)肝損傷[9-11]。體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化至關(guān)藥物的效/毒產(chǎn)生，補骨脂糖苷成分可脫糖基轉(zhuǎn)化成苷元使毒性增加[12]。因此，關(guān)注杜仲配伍后補骨脂香豆素類特別是糖苷成分的代謝及效/毒的多模態(tài)變化，對揭示杜仲補骨脂配伍特性與機制具有意義。

中藥成分特別是量微成分的抗骨質(zhì)疏松活性、毒性和代謝的在體、高效評價一直是哺乳動物試驗難以克服的瓶頸。新興的模式動物斑馬魚遺傳生物特性與人類高度保守，并幾乎具備人體所有主要的器官和系統(tǒng)，體型小，繁殖能力較強且易于飼養(yǎng)，適合大規(guī)模篩選[13]。課題組前期建立斑馬魚骨質(zhì)疏松模型和代謝等方法，實現(xiàn)多種壯骨中藥及其量微成分的代謝與效/毒的多模態(tài)高效評價[14-15]。本研究采用斑馬魚進(jìn)行代謝、毒性、抗骨質(zhì)疏松活性的多模態(tài)評價，探討杜仲富含木脂素提取物（lignan extract ofEucommiae Cortex，LEEC）與補骨脂香豆素提取物（coumarin extract ofPsoraleae Fructus，CEPF）配伍以及各自代表成分配伍，對香豆素提取物及代表糖苷的代謝轉(zhuǎn)化及效/毒影響，以揭示二藥配伍的特性。

1 材料

1.1 動物

斑馬魚成魚購自南京堯順禹生物科技有限公司，為德國Tuebingen 品系。

1.2 藥品與試劑

鹽補骨脂（產(chǎn)地為四川，批號201019，南京松齡中藥飲片有限公司）、鹽杜仲（產(chǎn)地為貴州，批號20210902-01，貴州同德藥業(yè)有限公司）由江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院采購，以上藥材經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院韋英杰研究員分別鑒定為豆科植物補骨脂P.corylifoliaL.的干燥成熟果實、杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoidesOliv.的干燥樹皮；對照品PSS（批號210306，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、IPSS（批號200930，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；對照品PS（批號110739-201918，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.6%）、IPS（批號110738-202016，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.4%）購自中國食品藥品檢定研究院；對照品松脂醇二葡萄糖苷（pinoresinol diglucoside，PDG，批號20011401，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.64%）購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；LEEC 為課題組自制，PDG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.02%；CEPF（批號D191021-3）為課題組自制，PS、IPS、PSS、IPSS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和為68.17%；茜素紅（批號K08J9C63243）、依替膦酸二鈉（批號K22A8M34493）購自上海源葉生物科技有限公司；色譜級乙腈（批號20095191、22035238）購自阿拉丁試劑有限公司、美國天地試劑公司；色譜級甲酸（批號G1826012）購自阿拉丁試劑有限公司；潑尼松龍（批號FD050193，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%）購自薩恩化學(xué)技術(shù)上海有限公司；多聚甲醛（批號20140901）購自上海展云化工有限公司。

1.3 儀器

SMZ800N 型顯微鏡（日本Nikon 公司）；SPX-80 型生化培養(yǎng)箱（寧波海曙賽褔實驗儀器廠）；1260型系列高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；NEVAPTM112 型氮吹儀（美國 Origanomation Associates 公司）；KQ3200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；MS105DU 型分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）。

2 方法

2.1 HPLC 分析補骨脂代表香豆素成分

Agilent Zorbax Extend C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0 min，10% A；0～30 min，10%～50% A；30～40 min，50%～60% A。柱溫25 ℃；體積流量1.0 mL/min；檢測波長246 nm；運行時間40 min；進(jìn)樣量20 μL。分析CEPF 配伍LEEC 以及PSS、IPSS 分別配伍PDG（杜仲木脂素代表成分）經(jīng)斑馬魚作用前后的4 個代表香豆素成分（PSS、IPSS、PS、IPS）。

2.2 用斑馬魚評價杜仲對補骨脂香豆素類成分安全性的影響

2.2.1 供試液配制 精密稱取CEPF和LEEC 適量，分別用培養(yǎng)基（2.9% NaCl、0.125 8% KCl、0.485 1%CaCl2·2H2O、0.811 8% MgSO4·7H2O）配制成質(zhì)量濃度分別為100、200、400、600、800 μg/mL（以CEPF計）的CEPF、LEEC、CEPF-LEEC（1∶4）、CEPFLEEC（1∶2）、CEPF-LEEC（1∶1）和CEPF-LEEC（2∶1）供試液。

精密稱取PSS、IPSS 以及PDG 適量，分別用培養(yǎng)基配制成1 mg/mL 的母液，將PSS、IPSS 的母液分別稀釋成質(zhì)量濃度為100、200、300、400、500 μg/mL 的溶液，PDG 的母液稀釋成質(zhì)量濃度為100、200、400、600、800 μg/mL 的溶液，PSS、IPSS 的母液分別與PDG 的母液按5∶2 的比例稀釋成質(zhì)量濃度為100、200、300、400、500 μg/mL 的溶液（分別以PSS 或IPSS 計）。

2.2.2 斑馬魚給藥 胚胎由斑馬魚成魚自由交配產(chǎn)生，將胚胎放置培養(yǎng)基中，在28.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取受精后1 d（one day after fertilization，1 dpf）的斑馬魚胚胎置24 孔板中，每孔10 個胚胎，30 個胚胎/組，分別暴露于不同質(zhì)量濃度的供試液中，每孔2 mL 溶液，用培養(yǎng)基作空白對照。每天記錄死亡魚數(shù)，于顯微鏡下觀察魚的形態(tài)，并于3 dpf 或3～6 dpf 時于顯微鏡下拍照，一直記錄到6 dpf。

2.2.3 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 16.0 軟件計算6 dpf 的斑馬魚亞致死濃度（20% lethal concentration，LC20）和半數(shù)死亡濃度（LC50）。

2.3 用斑馬魚評價杜仲配伍補骨脂對其香豆素類成分代謝的影響

2.3.1 斑馬魚分組與給藥 將1 dpf 的斑馬魚胚胎放于24 孔板中，設(shè)置CEPF（50 μg/mL）組、1CEPF∶2LEEC（50 μg/mL，以CEPF 計）組、LEEC（100 μg/mL）組、PSS（10 μg/mL）組、IPSS（10 μg/mL）組、5PSS∶2PDG（10 μg/mL，以PSS 計）組、5IPSS∶2PDG（10 μg/mL，以IPSS 計）組，另設(shè)置未加魚的相應(yīng)空白藥物組。每孔10 個胚胎，各質(zhì)量濃度設(shè)2 個平行組，每孔給藥液2 mL，放于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至6 dpf。分別于斑馬魚暴露藥液后0、1、2、3、4、5 d 時吸取藥液2 mL，置于-20 ℃冰箱中保存。

2.3.2 樣品處理 將上述給藥后0～5 d 代謝液、空白藥液，室溫空氣吹干，加80%甲醇1 mL 溶解，進(jìn)樣20 μL，進(jìn)行HPLC 分析。

2.4 用斑馬魚評價杜仲配伍補骨脂對其香豆素類成分抗骨質(zhì)疏松活性的影響

2.4.1 溶液配制

（1）潑尼松龍溶液配制：精密稱取潑尼松龍9 mg，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）1 mL 溶解，配制成25 mmol/L 潑尼松龍儲備液。取潑尼松龍儲備液適量，稀釋1000 倍得到25 μmol/L溶液。

（2）依替膦酸二鈉溶液配制：精密稱取依替膦酸二鈉6 mg，加入培養(yǎng)基1 mL 溶解，得6 mg/mL依替膦酸二鈉儲備液。取依替膦酸二鈉儲備液和潑尼松龍儲備液適量，用培養(yǎng)基稀釋得含25 μmol/L潑尼松龍的30 μg/mL 依替膦酸二鈉溶液。

（3）供試液的配制：分別取CEPF、LEEC 和25 mmol/L 潑尼松龍儲備液適量，配制成含25 μmol/L 潑尼松龍的CEPF（0.1、0.5、2.5 μg/mL）、LEEC（0.1、0.5、2.5 μg/mL）及1CEPF∶2LEEC（0.1、0.5、2.5 μg/mL，以CEPF 計），供抗斑馬魚骨質(zhì)疏松作用研究。分別取PSS、IPSS、PDG 和25 mmol/L 潑尼松龍儲備液適量，配制成含25 μmol/L 潑尼松龍的PSS（0.08、0.4、2 μg/mL）、IPSS（0.08、0.4、2 μg/mL）、PDG（0.08、0.4、2 μg/mL）、5PSS∶2PDG（0.08、0.4、2 μg/mL，以PSS 計）及5IPSS∶2PDG（0.08、0.4、2 μg/mL，以IPSS 計），供抗斑馬魚骨質(zhì)疏松作用研究。

2.4.2 斑馬魚分組與給藥 將3 dpf 的斑馬魚胚胎放入24 孔板中，每孔10 個胚胎，每組20 個胚胎，設(shè)置0.4% DMSO 溶媒對照組、模型組（25 μmol/L潑尼松龍）、陽性藥物組（30 μg/mL 依替膦酸二鈉）及各供試液組，每孔加入各質(zhì)量濃度溶液2 mL。將24 孔板放入28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，隔天換1 mL 新溶液，培養(yǎng)至8 dpf。

2.4.3 斑馬魚幼魚的固定、骨骼染色與分析 斑馬魚幼魚培養(yǎng)至8 dpf，用4%多聚甲醛處死固定過夜后，采用1% KOH 配制的含1.5% H2O2漂白劑將魚體漂白后，用茜素紅對斑馬魚幼魚頭部骨骼染色，最后用1% KOH-甘油（1∶1）的透明液清洗，去除多余的染色劑。用Image pro plus 6.0 軟件計算頭骨染色礦化面積和累積吸光度值。

2.4.4 數(shù)據(jù)分析 用Excel 軟件統(tǒng)計分析頭骨染色礦化面積和累積吸光度值數(shù)據(jù)，計算各組數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差以及變異系數(shù)（n＝15～20），以ttest 比較兩組間的結(jié)果差異；運用SPSS 16.0 軟件以單因素方差分析多組間結(jié)果比較，方差齊性時用最小顯著性差異法（LSD）進(jìn)行組間兩兩比較，方差非齊性時用Dunnett’sT3 法進(jìn)行組間兩兩比較。

3 結(jié)果

3.1 杜仲配伍補骨脂對其香豆素提取物/成分的安全性影響

3.1.1 LEEC 配伍CEPF 及二者代表成分配伍對斑馬魚致畸作用的影響 斑馬魚受精3 dpf 后孵化成幼魚，各臟器發(fā)育基本完全，魚體透明，在載玻片上易側(cè)臥，顯微鏡下檢視臟器形態(tài)清晰、直觀。對3 dpf 或3～6 dpf 斑馬魚幼魚進(jìn)行動態(tài)檢視并拍照，如圖1所示，與對照組比較，CEPF（600、800 μg/mL）組魚出現(xiàn)心包腫大，卵黃囊腫大、變黑；LEEC（100～800 μg/mL）組魚未見明顯心包、卵黃囊等形態(tài)畸變；二者不同比例（CEPF∶LEEC 為1∶4～2∶1）配伍后，魚主要器官心包、卵黃囊畸變與CEPF 的劑量相關(guān)，當(dāng)CEPF∶LEEC 為1∶4 和1∶2 時，100～800 μg/mL 給藥組魚未見明顯心包、卵黃囊等形態(tài)畸變；當(dāng)CEPF 所占比例增加，CEPF∶LEEC 為1∶1 和2∶1 時，600、800 μg/mL 給藥組魚出現(xiàn)心包腫大、卵黃囊腫大或變黑，有時魚體彎曲。提示LEEC 在適當(dāng)質(zhì)量濃度時可改善CEPF 引起的斑馬魚主要器官畸變。

圖1 CEPF、LEEC 及二者配伍組3 dpf 斑馬魚幼魚顯微檢視圖Fig.1 Micrograph of zebrafish larvae exposed to CEPF,LEEC and their compatibility groups at 3 dpf

補骨脂香豆素代表成分PSS、IPSS，杜仲木脂素代表成分PDG 及配伍各質(zhì)量濃度組3 dpf 斑馬魚心包、卵黃囊等形態(tài)未見明顯變化（圖2），提示此時各藥物尚未使魚明顯致畸，與此時無魚死亡結(jié)果相對應(yīng)。隨著給藥時間增加到5～6 dpf 時，400～500 μg/mL PSS、IPSS 及配伍組魚出現(xiàn)死亡，且500 μg/mL PSS 或IPSS 組魚產(chǎn)生明顯畸變，如魚身體彎曲，魚鰾消失；配伍PDG 后，魚形態(tài)均明顯改善，與培養(yǎng)基組魚相當(dāng)。

3.1.2 LEEC 配伍CEPF 及二者代表成分配伍對斑馬魚死亡率的影響 LEEC 配伍CEPF 致斑馬魚的死亡率與給藥質(zhì)量濃度和時間基本呈相關(guān)性，其給藥時間-劑量-死亡率關(guān)系見圖3。根據(jù)死亡率曲線得出6 dpf斑馬魚死亡率為20%時各給藥組的LC20[16]，LC20從小到大依次為 CEPF（159.8 μg/mL）＜2CEPF∶1LEEC（222.2 μg/mL）＜1CEPF∶1LEEC（552.3 μg/mL）＜1CEPF∶2LEEC（650.2 μg/mL）＜1CEPF∶4LEEC（696.9 μg/mL）＜LEEC（726.4μg/mL）。LC20越高，安全性越好，可見LEEC 安全性最好，CEPF 安全性最差，二者配伍后，隨著CEPF所占比例增加，安全性相應(yīng)變差。

圖3 LEEC 配伍CEPF 及二者代表成分配伍致魚死亡的時間-劑量-死亡率Fig.3 Time-dose-mortality of zebrafish death caused by compatibility of LEEC with CEPF and coumarin representative components of Psoraleae Fructus

如圖3所示，CEPF 單獨給藥48 h 后，各質(zhì)量濃度組魚在2 dpf 和3 dpf 死亡率都小于20%，在72～120 h 后，200～800 μg/mL 組魚死亡率隨著給藥時間增加而增加，于6 dpf 達(dá)43.3%～100.0%，100.0%死亡最低質(zhì)量濃度為400 μg/mL；LEEC 單獨給藥，除800 μg/mL 組6 dpf 魚死亡率達(dá)33.3%，其他各質(zhì)量濃度組魚給藥期間死亡率均低于20%；二者配伍（CEPF∶LEEC 為1∶4～1∶1）給藥72 h（4 dpf）后，除1CEPF∶4LEEC（800 μg/mL）組魚死亡率為33.3%，其他各質(zhì)量濃度組魚死亡率均小于20%，在120 h 后，600～800 μg/mL 給藥組魚死亡率增加大于20%，100.0%死亡最低質(zhì)量濃度為600 μg/mL，但當(dāng)CEPF∶LEEC 為2∶1 時，魚死亡的時間-劑量關(guān)系與CEPF 單獨給藥基本相當(dāng)。提示二者配伍在一定比例（CEPF∶LEEC 為1∶4～1∶1）時，致魚死亡質(zhì)量濃度提高，死亡時間延遲，具有減毒作用。

補骨脂香豆素代表成分PSS 和IPSS 與杜仲木脂素代表成分PDG 分別配伍的6 dpf 斑馬魚LC20從小到大依次為：PSS（268.8 μg/mL）＜IPSS（304.7μg/mL）＜5PSS∶2PDG（512.3 μg/mL）＜5IPSS∶2PDG（538.6 μg/mL）。PDG 各質(zhì)量濃度組魚給藥期間幾乎無死亡（死亡率＜6.7%）?？梢奝SS 和IPSS配伍PDG 后，LC20值增加近1 倍。

PSS、IPSS 及分別配伍PDG，給藥96 h（5 dpf）后，各質(zhì)量濃度組斑馬魚死亡率均低于20%；給藥120 h 后，PSS（400、500 μg/mL）組死亡率上升為46.7%、66.7%，分別比配伍PDG 組高6.7%、13.4%；IPSS（400、500 μg/mL）組死亡率上升為46.7%、96.7%，分別比配伍PDG 組高23.4%、56.7%。

3.1.3 LEEC 配伍CEPF 及二者代表成分配伍對斑馬魚LC50的影響 測試藥對斑馬魚的LC50越小，表明其致魚死亡的給藥質(zhì)量濃度越低，毒性越大。如圖4所示，LC50以給藥總量計，CEPF 的LC50值（209.3 μg/mL）最小，毒性最大，配伍LEEC 后，組合物的LC50值隨著CEPF 的比例減小而增加，其中1CEPF∶2LEEC 和1CEPF∶4LEEC 組合物的LC50值大于二藥單用，是CEPF 的LC50值的8.3、14.3倍，提示LEEC 可明顯降低CEPF 的毒性。

圖4 LEEC 配伍CEPF 及二者代表成分配伍對斑馬魚LC50 的影響Fig.4 Effect of compatibility of LEEC with CEPF and coumarin representative components of Psoraleae Fructus on LC50 of zebrafish(6 dpf)

補骨脂香豆素代表成分PSS 與IPSS 單用至6 dpf 魚的LC50值分別為441.7、387.5 μg/mL，配伍杜仲代表木脂素成分PDG 后，LC50值均增加，分別為654.9、809.1 μg/mL，提示配伍PDG 后毒性減小。PDG 單用安全性好，各質(zhì)量濃度致斑馬魚死亡率低（小于10%），未能計算出LC50值。

3.2 LEEC 配伍CEPF 及二者代表成分配伍對斑馬魚代謝的影響

LEEC 與CEPF 及代表成分配伍經(jīng)斑馬魚作用后0～5 d 的HPLC 圖見圖5。以補骨脂香豆素糖苷（PSS、IPSS）及其代謝物（PS、IPS）為指標(biāo)，計算各自占4 種香豆素成分含量總和的百分比計為相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)[12]，結(jié)果見圖6。

圖5 LEEC 配伍CEPF 及二者代表成分配伍經(jīng)斑馬魚作用0～5 d 的HPLC 圖Fig.5 HPLC chromatogram of LEEC,CEPF,representative components and their respective combination after exposing to zebrafish for 0—5 d

圖6 斑馬魚作用后補骨脂香豆素代表成分(PSS、IPSS、PS、IPS)含量變化Fig.6 Changes in contents of representative components of Psoraleae Fructus coumarin(PSS,IPSS,PS,IPS)after zebrafish treatment

CEPF 單獨給予1 dpf 斑馬魚1～3 d（2～4 dpf）后，少部分PSS（約12.9%）和IPSS（約1.0%）緩慢脫糖基分別轉(zhuǎn)化為PS 和IPS，至給藥后4 d（5 dpf）后代謝速率明顯增加，PSS 和IPSS 全部轉(zhuǎn)化為PS 和IPS，其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為67.0%和33.0%；至給藥后5 d（6 dpf），PS、IPS 含量相對穩(wěn)定不變。配伍LEEC 后，PSS 和IPSS 代謝速率明顯減慢，至給藥后4 d（5 dpf），僅少部分PSS（約20.9%）和IPSS（約2.9%）轉(zhuǎn)化為PS 和IPS，直至給藥后5 d（6 dpf）才全部轉(zhuǎn)化為PS 和IPS。

補骨脂香豆素糖苷代表成分PSS 和IPSS，分別單獨給予1 dpf 斑馬魚2 d（3 dpf）或3 d（4 dpf）后均相對穩(wěn)定，相應(yīng)代謝物PS 或IPS 檢測不到或很少（小于5.0%）。PSS 在給藥后3～4 d（4～5 dpf）代謝速率加快，相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別降至65.1%和0.0%，其代謝物PS 的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)相應(yīng)增加至34.9%和100.0%，配伍PDG 后，PSS 代謝速率減慢，在給藥后4 d 的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)仍為84.0%，直至給藥后5 d（6 dpf）才降至8.3%；IPSS 在給藥后5 d（6 dpf）代謝速率加快，相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)由4 d（5 dpf）的92.3%降至32.1%，其代謝物IPS 的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)由7.7%增加至67.9%，配伍PDG 后，IPSS代謝速率亦減慢，給藥后5 d（6 dpf）相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅降至89.9%，較單獨給藥高出57.8%。

3.3 杜仲配伍補骨脂對其香豆素提取物/成分的抗骨質(zhì)疏松活性影響

各組斑馬魚幼魚（8 dpf）頭骨茜素紅染色的顯微成像結(jié)果見圖7，圖像分析軟件所得結(jié)果見圖8。與溶媒對照組比較，模型組的斑馬魚頭骨染色礦化面積和累積吸光度值明顯降低（P＜0.05、0.001），表明25 μmol/L 潑尼松龍造模成功；與模型組比較，依替膦酸二鈉組礦化面積或累積吸光度值顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001），CEPF（0.1 μg/mL）組、LEEC（0.5 μg/mL）組以及二者配伍（0.5、2.5 μg/mL）組礦化面積顯著增加（P＜0.05），CEPF、LEEC 及二者配伍1CEPF∶2LEEC 各質(zhì)量濃度（0.1、0.5、2.5 μg/mL）組累積吸光度值均顯著增加（P＜0.01、0.001），CEPF 配伍LEEC（0.5、2.5 μg/mL）組的礦化面積和累積吸光度值高于相同質(zhì)量濃度CEPF、LEEC 單獨給藥，其中2.5 μg/mL 配伍組的累積吸光度值顯著高于CEPF 或LEEC 單獨給藥（P＜0.05），0.5 μg/mL 配伍組的累積吸光度值顯著高于CEPF 單獨給藥（P＜0.05）。

圖7 斑馬魚幼魚頭骨(8 dpf)茜素紅染色顯微成像圖(×120)Fig.7 Ventral view of alizarin red whole-mount preparations of juvenile zebrafish cranium(8 dpf,× 120)

PSS（0.4、2.0 μg/mL）組、PDG（2.0 μg/mL）組以及0.4、2.0 μg/mL 二者配伍（5PSS∶2PDG）組礦化面積較模型組顯著增加（P＜0.05、0.01），PDG及其與PSS 配伍（0.4、2.0 μg/mL）組累積吸光度值均顯著增加（P＜0.05、0.01、0.001），且配伍組累積吸光度值高于二者相同質(zhì)量濃度單獨給藥，其中0.4、2.0 μg/mL 配伍組累積吸光度值顯著高于PSS單獨給藥（P＜0.05）。

IPSS（0.08、0.4 μg/mL）組、PDG 各質(zhì)量濃度組以及0.4、2.0 μg/mL 二者配伍（5IPSS∶2PDG）組礦化面積較模型組均顯著增加（P＜0.05、0.01），除IPSS（2.0 μg/mL）組外，各質(zhì)量濃度（0.08、0.4、2.0 μg/mL）的IPSS、PDG 及二者配伍組累積吸光度值均顯著增加（P＜0.05、0.01），且配伍組累積吸光度值高于二者相同質(zhì)量濃度單獨給藥，其中2.0μg/mL 配伍組累積吸光度值顯著高于IPSS 單獨給藥（P＜0.05）。

4 討論

近年來，含補骨脂相關(guān)制劑引起的肝損傷不良反應(yīng)受到關(guān)注，配伍減毒是其臨床安全用藥的有效手段。源于宋代《太平惠民和劑局方》的青娥丸以杜仲-補骨脂藥對為君藥和臣藥，臨床用藥安全有效，故研究杜仲配伍補骨脂的減毒作用具有代表性，為補骨脂臨床安全配伍用藥提供參考。

藥物的毒/效產(chǎn)生與其在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化緊密相關(guān)，故綜合考慮代謝-效/毒的變化能更好體現(xiàn)藥物配伍的整合作用。而采用活體動物實驗是確定藥物的有效性與安全性的必需環(huán)節(jié)。如何實現(xiàn)高效、規(guī)?；脑u價至關(guān)重要，近年來斑馬魚因遺傳特性與人類高度保守等優(yōu)點而被廣泛用于探索藥物藥理、毒理及代謝等研究，此外斑馬魚易于飼養(yǎng)，繁殖能力較強，體外受精卵發(fā)育迅速，主要器官在受精后5 d 均已基本形成，頭骨在受精后8～9 d 也已發(fā)育完整，幼魚全身透明，適合顯微鏡下實時動態(tài)觀察，體小適合微板中實驗，實現(xiàn)大規(guī)模篩選[17-18]。

廣義上講，模態(tài)是指通過不同渠道和媒介獲得的模式數(shù)據(jù)或符號系統(tǒng)，包括文字、圖像、視頻、聲音甚至知識圖譜。而2 種以上模態(tài)的交叉或者一種模態(tài)下多類測量指標(biāo)的融合均可稱為多模態(tài)。多模態(tài)在藥物篩選、多模態(tài)影像、多模態(tài)單細(xì)胞組學(xué)等方興未艾[19]。張伯禮院士團隊[19]從中醫(yī)藥整體觀出發(fā)，提出中藥藥效物質(zhì)多模態(tài)辨識，指綜合運用化學(xué)分析、影像學(xué)、多組學(xué)以及信息學(xué)等學(xué)科技術(shù)，在微觀、介觀、宏觀等多個尺度辨析中藥化學(xué)組成與生物效應(yīng)間的相關(guān)性，并運用模式識別、機器學(xué)習(xí)等智能計算方式融合多模態(tài)信息，從而辨識中藥藥效物質(zhì)及其整合調(diào)節(jié)作用。斑馬魚模型具有活體成像優(yōu)勢，對1 個或多個圖像指標(biāo)進(jìn)行觀測，結(jié)合分子生物學(xué)變化，越來越多地用于多模態(tài)水平開展中藥藥效物質(zhì)研究[20]。本研究整合斑馬魚活體成像，頭骨染色圖像、致死量、成分轉(zhuǎn)化等多指標(biāo)分析，實現(xiàn)反應(yīng)代謝-毒/效的多模態(tài)評價。

以糖苷（PSS 和IPSS）為代表的補骨脂香豆素類成分是其傳統(tǒng)水煎液的主要成分，故本研究探討LEEC 配伍CEPF 及二者代表成分配伍后的代謝、毒性及抗骨質(zhì)疏松活性變化，以期揭示二藥配伍的機制。斑馬魚毒性評價發(fā)現(xiàn)，CEPF 單獨用藥致斑馬魚的死亡率和致心包、卵黃囊等形態(tài)畸變均大于LEEC，200～800 μg/mL CEPF 致魚死亡主要在給藥72～120 h（4～6 dpf）逐漸增加，二者不同比例組合后，隨著LEEC 的占比增加（50%～80%），致魚死亡質(zhì)量濃度（600～800 μg/mL）較CEPF 單用提高，死亡時間延遲約24 h，死亡率也相應(yīng)降低，且6 dpf 斑馬魚的LC50值相應(yīng)逐步提高，提示具減毒作用。杜仲木脂素代表成分PDG 配伍補骨脂香豆素代表糖苷PSS 和IPSS 致斑馬魚死亡具有相似減毒結(jié)果，給藥120 h 后，明顯降低PSS 或IPSS（400、500 μg/mL）組魚死亡率（最高降低56.7%），6 dpf的LC50值也分別增加。

斑馬魚代謝研究發(fā)現(xiàn)，CEPF 單獨給予1 dpf 斑馬魚，主要成分PSS 和IPSS 在給藥后4 d（5 dpf）代謝速率明顯增加，分別全部脫糖基轉(zhuǎn)化為PS 和IPS，配伍LEEC 后，PSS 和IPSS 代謝速率明顯減慢，直至給藥后5 d（6 dpf）才全部轉(zhuǎn)化為PS 和IPS。同樣杜仲木脂素成分PDG 配伍可減慢PSS 和IPSS 的代謝速度。PS 和IPS 是補骨脂肝損傷相關(guān)成分[21-23]，補骨脂CEPF 及PSS 和IPSS 致魚死亡或畸變與代謝物PS 和IPS 的產(chǎn)生密切相關(guān)，杜仲LEEC 及PDG 配伍使PS 和IPS 產(chǎn)生減慢，是減毒的重要因素。

用潑尼松龍誘導(dǎo)斑馬魚骨質(zhì)疏松模型評價，以8 dpf 斑馬魚頭骨礦化面積和累積吸光度值為指標(biāo)，結(jié)果表明，LEEC 配伍CEPF（0.5、2.5 μg/mL）組的累積吸光度值顯著高于相同質(zhì)量濃度CEPF 和/或LEEC 單獨給藥。PDG 配伍PSS 或IPSS（0.4、2.0 μg/mL）組累積吸光度值顯著高于PSS 或IPSS 單獨給藥。斑馬魚頭骨累積吸光度值相當(dāng)于骨質(zhì)疏松評價金指標(biāo)“骨密度”，可見上述配伍組合有一定增強抗骨質(zhì)疏松活性的作用。

綜上，用斑馬魚評價發(fā)現(xiàn)杜仲配伍對補骨脂香豆素類成分的代謝、毒性及抗骨質(zhì)疏松活性的多模態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)配伍使糖苷轉(zhuǎn)化為毒性苷元的速度減慢與減毒作用相關(guān)，配伍尚能增強抗骨質(zhì)疏松活性。該方法對中藥配伍的效/毒作用起到了快速與精準(zhǔn)的辨識，為評價壯骨中藥配伍組合的減毒增效作用提供了有意義的方法與構(gòu)想。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突