朱文文，肖葛瓊

(紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，浙江 紹興 312000)

原發(fā)性肝癌是癌癥致死的第2大原因，其中肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占90%以上[1]。HCC是全球第5大最常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型，并且其發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)[2]。許多HCC患者到了疾病晚期才被確診，錯(cuò)過(guò)了手術(shù)和治療的最佳時(shí)機(jī)，并且 HCC患者的五年生存率并不理想[3]。因此實(shí)現(xiàn)HCC的早期診斷是臨床研究的重點(diǎn)之一。

既往研究挖掘了和HCC組織惡性發(fā)展相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因，包括細(xì)胞周期蛋白B1(cell cycle-related proteins cyclin B1, CCNB1)、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶1(cyclin-dependent kinase 1,CDK1)[4-5]。CCNB1、CDK1在HCC中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[6-8]，但目前相關(guān)的臨床研究還比較少。本研究分別從診斷、預(yù)后以及與臨床病理分期的相關(guān)性上，分析CDK1和CCNB1表達(dá)水平在HCC中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年6月—2015年6月紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科收治的HCC患者112例。男性72例、女性40例，60歲以上39例、60歲及以下73例；病理分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期37例，Ⅲ期54例，Ⅳ期12例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)影像學(xué)和術(shù)后病理學(xué)檢查確診為HCC；②術(shù)前未接受過(guò)放化療；③臨床資料完整；④對(duì)本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①轉(zhuǎn)移性肝癌；②嚴(yán)重心、肺、腎等器官功能不全；③合并其他惡性腫瘤；④合并免疫性疾病；⑤合并血液系統(tǒng)疾病。在患者手術(shù)過(guò)程中獲取其HCC組織以及配對(duì)的癌旁正常組織。本研究已獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)CDK1與CCNB1的相對(duì)表達(dá)量 通過(guò)Trizol試劑(Invitrogen，USA)從組織中提取總RNA，然后使用Superscript Ⅱ試劑盒(Invitrogen，USA)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用DBIBestar?SybrGreen qPCR試劑盒，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR(Stratagene Mx3000P)對(duì)mRNA的水平進(jìn)行定量。在SYBR Green Supermix(Bio-Rad，USA)和ABI Prism 7700系統(tǒng)(Applied Biosystems，USA)構(gòu)建下進(jìn)行PCR。一式3份分析樣品，并用2-ΔΔCt方法分析。GAPDH用于內(nèi)部對(duì)照。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 引物序列表

1.3 隨訪 手術(shù)后對(duì)患者進(jìn)行為期5年的隨訪，隨訪截止時(shí)間為2020年6月。記錄患者的無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival, PFS)和總生存期(overall survival, OS)。隨訪期間無(wú)病例脫落。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS和GraphPad Prism進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2組間計(jì)數(shù)資料比較采用t檢驗(yàn)，診斷價(jià)值通過(guò)ROC曲線進(jìn)行分析，通過(guò)Pearson線性和Spearman秩相關(guān)性分析分別評(píng)估正態(tài)資料和等級(jí)資料的相關(guān)性，log-rank test和Gehan-Breslow-Wilcoxon test對(duì)生存曲線進(jìn)行差異分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC組織中CDK1和CCNB1的表達(dá)水平 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，HCC患者癌組織中的CDK1、CCNB1表達(dá)水平均高于配對(duì)的癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

A.正常組織和HCC組織中CDK1的表達(dá)水平；B.正常組織和HCC組織中 CCNB1的表達(dá)水平；** P<0.01。

2.2 HCC組織中CDK1和CCNB1二者間及與HCC病理分期的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明，HCC組織中CDK1和CCNB1的表達(dá)水平顯著正相關(guān)(r=0.769，P<0.01)，見(jiàn)圖2 A。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CDK1和CCNB1的表達(dá)水平均與HCC病理分期顯著正相關(guān)(r=0.828、0.726，均P<0.01)，見(jiàn)圖2 B、2 C。

A. CDK1與CCNB1表達(dá)水平的相關(guān)性；B. CDK1表達(dá)水平和病理分期相關(guān)性；C. CCNB1表達(dá)水平和病理分期相關(guān)性。

2.3 CDK1、CCNB1在HCC中的診斷價(jià)值 將癌旁正常組織中CDK1和CCNB1的表達(dá)水平作為對(duì)照組，進(jìn)行ROC分析，結(jié)果顯示：CDK1診斷HCC的AUC為0.817，敏感度和特異性分別為87.5%、71.4%，cut-off值為1.377；CCNB1診斷HCC的AUC為0.810，敏感度和特異性分別為92.0%、64.3%，cut-off值為1.395；CDK1和CCNB1聯(lián)合診斷HCC的AUC為0.837，敏感度和特異性分別為83.0%、77.7%。見(jiàn)圖3。

A.單獨(dú)診斷HCC；B.聯(lián)合診斷HCC。

2.4 CDK1與CCNB1在HCC中的預(yù)后價(jià)值 分別以HCC癌組織中CDK1、CCNB1表達(dá)的中位值，將患者分為CDK1高表達(dá)組、CDK1低表達(dá)組、CCNB1高表達(dá)組以及CCNB1低表達(dá)組，隨訪5年，統(tǒng)計(jì)患者的PFS和OS。結(jié)果表明， CDK1和CCNB1高表達(dá)的HCC患者的PFS和OS均短于低表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 CDK1(A、B)與CCNB1(C、D)不同表達(dá)水平的HCC患者生存分析曲線

3 討論

盡管關(guān)于HCC的外科手術(shù)技術(shù)、綜合治療和針對(duì)性療法都在不斷發(fā)展，但目前HCC患者的總生存率仍然不理想[9]。因此實(shí)現(xiàn)HCC的早期診斷是臨床研究的重點(diǎn)之一。目前甲胎蛋白(AFP)是臨床上用于診斷HCC最常用的一項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物，但其診斷的敏感度不夠理想，存在一定的局限性[10]。CDK1是一種重要的周期調(diào)節(jié)蛋白，也是CDK家族中唯一可以獨(dú)立調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白[11]。已有研究報(bào)道表明，二甲雙胍通過(guò)上調(diào)miR-378和下調(diào)CDK1來(lái)發(fā)揮對(duì)HCC的抑制能力[6]，而上調(diào)CDK1基因的表達(dá)能夠促進(jìn)HCC的發(fā)生和惡性發(fā)展[12]。此外，CCNB1和CCNB2可以與CDK1形成復(fù)合物，進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞周期過(guò)程[7]。Gu等[8]的研究報(bào)道通過(guò)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-144負(fù)調(diào)節(jié)CCNB1并抑制瘤體生長(zhǎng)。因此，本研究希望通過(guò)探究CDK1和CCNB1在HCC中臨床價(jià)值，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)全新的生物標(biāo)志物。

之前的研究表明，CDK1和CCNB1在橫紋肌肉瘤中均顯著高表達(dá)，且其高表達(dá)有一定的臨床診斷價(jià)值[13]，與本研究結(jié)果一致。這種表達(dá)失調(diào)是否具有診斷價(jià)值目前也尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)臨床文獻(xiàn)，在本研究中我們通過(guò)ROC分析得知CDK1和CCNB1表達(dá)水平均具有較好的臨床診斷價(jià)值，CDK1的診斷價(jià)值和特異性要優(yōu)于CCNB1，且二者聯(lián)合診斷更進(jìn)一步提升了診斷價(jià)值和診斷的特異性。相關(guān)文獻(xiàn)[14-16]表明，CDK1和CCNB1的表達(dá)水平二者間存在很高的相關(guān)性，并且分別和不同腫瘤的臨床病理特征存在一定的相關(guān)性。本研究中， HCC患者的癌組織中CDK1和CCNB1的表達(dá)水平顯著正相關(guān)，CDK1表達(dá)水平、CCNB1表達(dá)水平均和HCC病理分期顯著正相關(guān)，其中CDK1和HCC病理分期的相關(guān)性更高一些。相比于CCNB1，CDK1在獨(dú)立診斷和病理分期相關(guān)性分析上均具備一定的優(yōu)勢(shì)。

Zhu等[17]發(fā)現(xiàn)CDK1高表達(dá)促進(jìn)5-氟尿嘧啶耐藥的結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展，且與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后不良相關(guān)。也有報(bào)道[18-19]表明，CCNB1在乳腺癌和胃癌中是潛在的預(yù)后標(biāo)志物。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CDK1、CCNB1低表達(dá)組HCC患者的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期均顯著長(zhǎng)于CDK1、CCNB1高表達(dá)組。可見(jiàn)，CDK1、CCNB1的低表達(dá)與HCC患者較好的預(yù)后顯著相關(guān)，CDK1和CCNB1對(duì)HCC患者的預(yù)后評(píng)估有一定價(jià)值。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CDK1和CCNB1在HCC中具有較高的診斷價(jià)值和預(yù)后價(jià)值，與病理分期呈顯著正相關(guān)，兩者都具備較高的臨床價(jià)值。此外本研究還發(fā)現(xiàn)HCC患者組織中的CDK1和CCNB1表達(dá)水平間存在相關(guān)性，表明兩者之間或許存在調(diào)控關(guān)系，在今后的研究中可就此進(jìn)行深入探究。