駱鍇冉，劉 岸

(1.紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院 普外科，浙江 紹興 312000；2.湖南理工學(xué)院 化工學(xué)院，湖南 岳陽 414000)

胰腺癌組織中的血管分布密度與胰腺癌的惡性生物學(xué)行為存在明顯相關(guān)性，胰腺癌血供豐富[1]，已有諸多抗血管生成靶向藥物如多靶點酪氨酸激酶抑制劑(索拉非尼)、VEGF/VEGFR單抗(阿西替尼)等應(yīng)用于胰腺癌臨床化療，但胰腺癌患者對此類靶向藥物多存在一定的毒性反應(yīng)和耐藥現(xiàn)象，使得胰腺癌患者的預(yù)后不理想[2]。抗糖尿病雙胍類藥物——苯乙雙胍(phenformin)是一種高效的線粒體抑制劑[3]，在多種惡性腫瘤[4-5]中均表現(xiàn)出一定的抗癌活性，其抗腫瘤作用強(qiáng)于二甲雙胍[6]。目前正在進(jìn)行的一期臨床試驗(NCT03026517)旨在確定苯乙雙胍聯(lián)合小分子靶向藥物(達(dá)拉非尼和曲美替尼)治療黑色素瘤患者的最佳劑量，而苯乙雙胍對惡性腫瘤血管生長的影響尚未探明。本研究觀察苯乙雙胍對體內(nèi)外胰腺癌血管生成的抑制作用，并對其抗腫瘤的具體作用機(jī)制進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑 HUVECs、人胰腺正常導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE6-C7和胰腺癌細(xì)胞系PANC-1購于美國模式培養(yǎng)物保存中心(ATCC)，苯乙雙胍購自江蘇千勝醫(yī)藥科技有限公司，VEGFA和Drabkin 525試劑盒購自美國Sigma公司，DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自杭州四季青生物科技有限公司，含EDTA胰蛋白酶購自中國吉諾公司，Matrix膠購自美國BD公司，細(xì)胞計數(shù)-8(CCK-8)試劑盒購自上海Biyuntian 公司，VEGFA、phospho-VEGFR2、Total-VEGFR2、phospho-ERK、Total-ERK和β-actin抗體均購自美國Epitomics公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 所有細(xì)胞株均在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中和環(huán)境為37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，按照1∶3的比例進(jìn)行傳代。

1.3 CCK-8法 96孔板中每孔加入2×104個細(xì)胞，添加藥物后37 ℃放置4 h，隨后每孔添加10 μL CCK-8試劑，采用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光值。

1.4 小管形成實驗 將DMEM培養(yǎng)液和Matrigel膠分別于4 ℃放置12 h，成膠凍狀后將DMEM培養(yǎng)液和Matrigel膠以1∶2的比例混合。24孔板中每孔加入250 μL混合后的Matrigel膠，37 ℃放置1 h待Matrigel膠凝結(jié)成塊后，每孔加入0.1 mL密度為3×106/mL的HUVECs懸液。于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用光學(xué)顯微鏡(200×)觀察小管形成狀況。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法 采用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，總蛋白經(jīng)勻漿、離心、變性等操作后，電泳分離后同時轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉進(jìn)行封閉操作，整體實驗環(huán)境為4 ℃，維持12 h，硝酸纖維素膜分別經(jīng)過一抗和二抗孵育(一抗和二抗體積稀釋比例分別為 1∶1 000和1∶5 000)，利用顯影定影試劑盒完成最后的顯色和曝光操作。

1.6 裸鼠胰腺癌原位移植模型構(gòu)建 參照文獻(xiàn)[6]復(fù)制裸鼠胰腺癌原位移植模型。3～7周的BALB/c雌性小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXY(京)2016-0011)放置于層流凈化屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)。將0.2 mL 密度為3×105/mL的胰腺癌PANC-1細(xì)胞懸液皮下注射到裸鼠的右下肢。注射2周后，處死裸鼠并取出皮下腫瘤組織，在顯微鏡下將腫瘤塊修剪成2 mm×2 mm×2 mm大小。將腫瘤塊原位移植到裸鼠胰尾部，2周后應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將20只胰腺癌原位移植模型裸鼠分為對照組和苯乙雙胍組，每組10只。對照組裸鼠經(jīng)灌胃給予0.2 mL 0.1%DMSO，苯乙雙胍組裸鼠經(jīng)食管插管給予苯乙雙胍(1 mg/kg)，調(diào)整每次給藥體積為0.2 mL，兩組實驗動物均2 d給藥1次，持續(xù)2周，在移植術(shù)后第4周時處死裸鼠并摘除胰腺腫瘤。動物實驗通過紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會審核。

1.7 免疫組織化學(xué)法 樣品用5%甲醛固定過夜，采用梯度乙醇脫水法將腫瘤組織脫水后包埋在石蠟中切片行SP染色。CD34陽性表達(dá)少數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)中，大部分表達(dá)于細(xì)胞膜中；VEGFA陽性表達(dá)大部分在細(xì)胞質(zhì)中。隨機(jī)選擇20個視野并在低倍鏡下拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析VEGFA在樣本中的積分光密度(IOD)值，在200×光學(xué)顯微鏡下選取10個視野，計數(shù)每個視野下CD34陽性細(xì)胞，取平均值。

1.8 血管造影 參照文獻(xiàn)[6]對胰腺癌原位移植模型裸鼠實施明膠-氧化鉛造影。采用腹腔注射10%水合氯醛(35 mg/kg)麻醉裸鼠，開胸后在裸鼠心尖處行長約1 mm切口，隨即將24號留置針導(dǎo)管自切口插入，將明膠-氧化鉛溶液自導(dǎo)管灌入裸鼠全身動脈，待明膠-氧化鉛溶液凝固后取出胰腺腫瘤在X線下攝像。采用Quantity One 4.6.2(BIO-RAD)軟件掃描X膠片中腫瘤內(nèi)血管組織的光密度值，用排水法測定胰腺腫瘤體積。腫瘤組織光密度值與腫瘤體積(cm3)的比值為腫瘤組織平均體積血管密度。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，兩兩比較采用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苯乙雙胍對PANC-1、HPDE6-C7及HUVECs生長的影響 將0、0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L苯乙雙胍分別作用于HPDE6-C7、PANC-1細(xì)胞及HUVECs。24 h后，較低濃度苯乙雙胍(0.001、0.01、0.1 μmol/L)對HPDE6-C7細(xì)胞及HUVECs的生長無明顯抑制作用，10 μmol/L苯乙雙胍作用HPDE6-C7細(xì)胞及HUVECs 24 h后，細(xì)胞存活率從0 μmol/L苯乙雙胍處理(100%)分別降低到(72.58±10.37)%和(79.51±8.96)%。0.01、0.1、1、10 μmol/L苯乙雙胍處理PANC-1細(xì)胞后，細(xì)胞存活率均低于0 μmol/L苯乙雙胍處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 苯乙雙胍對HUVECs小管形成的影響 HUVECs在鋪滿Matrigel基質(zhì)的培養(yǎng)板中生長12 h后，細(xì)胞逐漸向兩端延長呈梭形，同時細(xì)胞延長端開始在Matrigel膠中伸展，相鄰細(xì)胞開始出現(xiàn)聯(lián)接并出現(xiàn)管腔樣結(jié)構(gòu)。0.001、0.01、0.1 μmol/L苯乙雙胍作用HUVECs 12 h后體外小管形成數(shù)分別為25.4±4.8、20.3±3.7和18.6±3.5，均低于0 μmol/L苯乙雙胍處理組(48.3±6.7) ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。20 μg/L VEGFA聯(lián)合0.1 μmol/L苯乙雙胍作用HUVECs，12 h后體外小管形成數(shù)(57.6±6.4)高于0.1 μmol/L苯乙雙胍處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見封三圖1。

2.3 苯乙雙胍對ERK/VEGFA/VEGFR2通路蛋白表達(dá)的影響 0.001、0.01、0.1 μmol/L苯乙雙胍作用PANC-1細(xì)胞24 h后，VEGFA和p-ERK的表達(dá)水平隨苯乙雙胍濃度的升高而下降，見圖2A。0.001、0.01、0.1 μmol/L苯乙雙胍作用HUVECs 24 h后，可呈濃度依賴性抑制HUVECs中p-VEGFR2表達(dá)，見圖2B。

圖2 苯乙雙胍對PANC-1細(xì)胞(A)和HUVECs(B)中ERK/VEGFA/VEGFR2通路蛋白表達(dá)的影響

2.4 苯乙雙胍對胰腺癌原位移植模型裸鼠血管生長的影響 給藥前及實驗結(jié)束時，對照組和苯乙雙胍組裸鼠體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；苯乙雙胍組胰腺腫瘤平均體積血管數(shù)量、腫瘤質(zhì)量均少于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。明膠-氧化鉛血管造影結(jié)果顯示，對照組胰腺腫瘤內(nèi)血管分布較為密集，苯乙雙胍組胰腺腫瘤質(zhì)量較對照組減少，見封三圖2 A、B。HE染色后在鏡下可見對照組為低分化胰腺癌細(xì)胞，腫瘤中血供豐富；苯乙雙胍組腫瘤細(xì)胞血供較為貧乏，可見大量組織壞死，見封三圖2 C。免疫組化結(jié)果顯示，對照組腫瘤組織中CD34、VEGFA陽性表達(dá)均高于苯乙雙胍組，見封三圖2 D。

表1 對照組和苯乙雙胍組裸鼠體質(zhì)量及胰腺腫瘤血管數(shù)量、質(zhì)量的比較

3 討論

苯乙雙胍的抗癌機(jī)制包括抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化等[3-5]。但較高劑量的苯乙雙胍有一定幾率導(dǎo)致乳酸中毒等副作用，從而極大地限制苯乙雙胍在臨床中的使用。為此，本研究首先使用依次增高濃度的苯乙雙胍分別作用體外胰腺癌PANC-1細(xì)胞、胰腺正常導(dǎo)管HPDE6-C7細(xì)胞和HUVECs，發(fā)現(xiàn)較低濃度(0.001～0.1 μmol/L)的苯乙雙胍對體外HPDE6-C7細(xì)胞和HUVECs生長無明顯抑制作用，但該濃度范圍的苯乙雙胍可有效抑制PANC-1細(xì)胞的生長。同時對HUVECs小管形成能力進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，即使使用最低濃度的苯乙雙胍(0.001 μmol/L)也能對體外HUVECs發(fā)揮小管生成抑制作用，從而表明使用較低濃度的苯乙雙胍可在對體外細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒作用的前提下有效抑制血管新生。體內(nèi)實驗也證實，較低劑量苯乙雙胍(1 mg/kg)可在對裸鼠體重?zé)o明顯影響的前提下抑制腫瘤血管新生和腫瘤生長，與體外實驗結(jié)果相仿。從而首次通過體內(nèi)外實驗證實低濃度/劑量的苯乙雙胍不但對正常細(xì)胞無明顯影響，而且還能通過抑制腫瘤新生從而達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞的效果，是一種極具臨床應(yīng)用前景的血管生成抑制劑。

定向靶向腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的治療可有效改善惡性腫瘤患者預(yù)后[7-8]。利用免疫組化檢測CD34及VEGFA的陽性表達(dá)常用于評估組織的血管密度，本研究結(jié)果表明，苯乙雙胍可有效抑制腫瘤組織中CD34及VEGFA的陽性表達(dá)，從而在微觀層面表明苯乙雙胍可有效抑制胰腺癌血管新生。本研究通過明膠-氧化鉛對裸鼠胰腺腫瘤實施血管造影，從而獲得較為直觀的胰腺腫瘤血管灌注影像，X光下可見對照組胰腺腫瘤組織中充盈大量不透光的明膠-氧化鉛，表明其豐富的血管網(wǎng)絡(luò)。而苯乙雙胍組胰腺腫瘤的X光下可見不透光的明膠-氧化鉛大大減少，從而在宏觀層面印證苯乙雙胍可有效抑制體內(nèi)胰腺腫瘤中的血管新生。

ERK信號通路對內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、分化和増殖等多種生理學(xué)功能發(fā)揮調(diào)控作用[9-10]。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)是組織血管新生的有效促進(jìn)因子，但在正常組織中的表達(dá)較為穩(wěn)定，往往在肉芽組織和腫瘤組織等血管新生較為旺盛的組織中表達(dá)增加[11]。而ERK作為VEGFA的上游調(diào)控因子，在多種惡性腫瘤中已經(jīng)證實ERK與VEGFA的密切聯(lián)系[12]。在本研究體外實驗中，苯乙雙胍不僅可下調(diào)ERK的磷酸化水平在胰腺癌PANC-1細(xì)胞中的表達(dá)，還能有效抑制VEGFA的水平；同時在挽救實驗中，添加一定濃度的VEGFA還可以有效逆轉(zhuǎn)苯乙雙胍對HUVECs的生物學(xué)功能；最后在體內(nèi)實驗中，不僅證實苯乙雙胍可以抑制體內(nèi)胰腺腫瘤血管新生，還能拮抗VEGFA在體內(nèi)腫瘤中的表達(dá)水平。因此，本實驗通過體內(nèi)外實驗證實ERK/VEGFA信號通路在苯乙雙胍發(fā)揮腫瘤血管新生抑制作用中發(fā)揮了一定作用。研究表明，腫瘤細(xì)胞分泌VEGFA后需與位于內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGF受體(VEGFR)結(jié)合，才能發(fā)揮血管新生作用[13]，VEGFA/VEGFR2信號軸已被證實在組織血管新生中發(fā)揮極為關(guān)鍵的調(diào)控作用。本研究的體外實驗也證實苯乙雙胍一方面可有效抑制VEGFA在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，另一方面還能拮抗VEGFR2的磷酸化水平在HUVECs中的表達(dá)。從而進(jìn)一步揭示苯乙雙胍抑制胰腺腫瘤中血管新生的作用機(jī)制。

綜上所述，苯乙雙胍在發(fā)揮抑制腫瘤血管新生過程中伴有ERK/VEGFA/VEGFR2通路的失活，本研究結(jié)果有望將苯乙雙胍應(yīng)用于臨床胰腺癌治療，作為臨床胰腺癌化療的“補(bǔ)充選擇”。