張 龍，郝俊光，楊金海，萬瑞杰，梁振榮，葉靜萱，黎 婷，梁婷鈺

（1.北部灣大學 食品工程學院 欽州市食品風味分析與調(diào)控重點實驗室，廣西 欽州 535011；2.廣西天龍泉酒業(yè)有限公司，廣西河池 546400；3.北部灣大學 食品工程學院 廣西高校北部灣海產(chǎn)品高值化利用與預制食品重點實驗室，廣西 欽州 535011；4.羅城仫佬族自治縣科技情報研究所，廣西 河池 546400）

隨著消費者健康意識的提高，飲酒觀念發(fā)生了轉(zhuǎn)變，傳統(tǒng)白酒的轉(zhuǎn)型迫在眉睫，營養(yǎng)型白酒在市場上開始興起[1-2]。營養(yǎng)型白酒是在傳統(tǒng)白酒中適量添加了富含活性成分的草本藥材提取物，酒體微黃，使消費者在享受傳統(tǒng)白酒的同時又能攝入健康因子[3-4]。市售保健酒草藥味濃烈，使消費者感官體驗不佳；而營養(yǎng)型白酒卻與之不同，其風味接近于傳統(tǒng)白酒，因此深受消費者喜愛，如勁酒集團的毛鋪苦蕎酒[14-16]。天龍泉-陶藏酒，是以米香型白酒為基酒，輔以添加廣西富產(chǎn)的葛根、羅漢果、苦蕎麥提取物的一款新產(chǎn)品，一上市就受到消費者的追捧。

葛根是傳統(tǒng)的藥食同源植物，含有葛根素、大豆苷等活性成分[5]；苦蕎麥和羅漢果具有較高藥用價值，含有蘆丁、槲皮素、表兒茶素、羅漢果苷IV、羅漢果苷V等活性成分[6-8]。不同的活性成分在人體內(nèi)發(fā)揮不同的保健功效，如大豆苷能抗氧化、抗癌等[9]；葛根素能降低血糖血脂等[10]，蘆丁具有抗癌、抗炎等功效[11]；兒茶素、表兒茶素能清除自由基等[12]，羅漢果苷V具有保肝、抗癌等作用[13]。目前常見測定活性成分的方法有光譜法[17]，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[18]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法[19]等。光學分析法常用于測定總酚含量，無法檢測單一組分含量；超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高但儀器昂貴、運行維護成本高；高效液相色譜法測定活性成分在國內(nèi)外應用較為廣泛，在單獨檢測葛根、苦蕎麥、羅漢果的組成方面已有報道，如AMAKURA Y等[20]借助HPLC準確測羅漢果提取物羅漢果苷V的含量，QU L M等[21]利用HPLC測定葛根中的葛根素等六種異黃酮，MANSUR A R等[22]通過HPLC測定苦蕎麥中的黃酮類物質(zhì)。高效液相色譜法能同時測定多種單體活性成分含量，具有操作簡單等優(yōu)點，適用于工廠自行檢測，但目前尚無同時檢測天龍泉-陶藏酒中葛根、苦蕎麥、羅漢果提取物活性成分的方法。

本研究通過對天龍泉-陶藏酒中12種活性成分的HPLC檢測條件進行優(yōu)化，建立了HPLC同時測定天龍泉-陶藏酒中12種活性成分的檢測方法，并將其應用于天龍泉-陶藏酒樣品的檢測，以期為天龍泉-陶藏酒功能成分提供有效的檢測手段，為天龍泉-陶藏酒的品質(zhì)控制提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

天龍泉-陶藏酒3A酒樣（酒精度為30%vol，添加了葛根、苦蕎麥提取物）、天龍泉-陶藏酒4A酒樣（酒精度為33%vol，添加了苦蕎麥提取物）、天龍泉-陶藏酒5A酒樣（酒精度為42%vol，添加了羅漢果、葛根提取物）：廣西天龍泉酒業(yè)有限公司。

1.1.2 試劑

乙腈、甲醇、乙醇（均為色譜純）：上海麥克林生化科技公司；槲皮素、大豆苷、山奈酚、蘆丁、葛根素、異槲皮苷、兒茶素、表兒茶素、槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、羅漢果苷IV、羅漢果苷V標準品（純度均＞98%）：四川維克奇生物科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Alliance 高效液相色譜儀（配備2695分離單元、2996光電二極管陣列（photo-diode array，PDA）檢測器、Empower工作站）：美國Waters儀器公司；ME204E電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DK-98-II恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；Waters-AtlantisT3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、SLGP 033RB針頭濾膜（0.22 μm）：美國Millipore公司；XW-80A旋渦混合器：常州萬科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

單個標準工作溶液配制：稱取適量標準品于10 mL容量瓶，用熱乙醇（45 ℃）溶解蘆丁、槲皮素、山奈酚后定容，得到質(zhì)量濃度為100 mg/L單標溶液；用體積分數(shù)為80%甲醇溶解葛根素、大豆苷、兒茶素、表兒茶素、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷、羅漢果苷IV、羅漢果苷V后定容，得到質(zhì)量濃度為100 mg/L單標溶液。

混合標準工作液的配制：適量稱取各物質(zhì)標準品用甲醇溶解后得到質(zhì)量濃度范圍為8 000～17 000 mg/L的單標母液，再吸取適量母液，置于10 mL容量瓶中用甲醇定容混勻，制得質(zhì)量濃度為1 200 mg/L的混合標準儲備液。吸取0.064 mL混合標準儲備液置于10 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為80%甲醇定容，得到質(zhì)量濃度為7.68 mg/L的混合標準工作液用于色譜條件的優(yōu)化。

1.3.2 高效液相色譜條件

根據(jù)保留時間進行定性，采用外標法進行定量。

1.3.3 高效液相色譜條件優(yōu)化

（1）波長的確定

對各活性成分進行二級管陣列掃描（190～400 nm），得到各標準物質(zhì)的光譜圖，確定測定波長，于選定檢測波長分離優(yōu)化混合標樣，以達到最佳效果。

（2）洗脫梯度的確定

本試驗共進行了30余次梯度優(yōu)化，僅選擇4個有代表性的梯度說明優(yōu)化效果，具體洗脫梯度見表1。選取各目標物完全分離、檢測周期短的洗脫梯度作為最優(yōu)色譜條件。通過改變洗脫條件，實現(xiàn)不同活性物質(zhì)的有效分離，達到兩種相鄰的目標活性物質(zhì)分離度≥1.5，分離度的計算公式見式（1）[23]。

表1 洗脫梯度的優(yōu)化Table 1 Optimization of eluent gradients

續(xù)表

式中：tR1為相鄰色譜峰前-峰的保留時間；tR2為相鄰色譜峰后-峰的保留時間；Y1、Y2為相鄰兩色譜峰的峰寬。

1.3.4 方法學考察

（1）標準曲線的建立

適量吸取1.3.1單標母液置于10 mL容量瓶中配制得到含2 500 mg/L的葛根素、大豆苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚，5 000 mg/L山奈酚-3-O-蕓香糖苷、羅漢果苷V、羅漢果苷IV、表兒茶素、兒茶素，3 750 mg/L蘆丁、異槲皮苷的混合標準儲備液，分別吸取混合標準儲備液0.008 mL、0.001 6 mL、0.032 mL、0.064 mL、0.128 mL、0.256 mL置于10 mL容量瓶中用80%甲醇定容，得到6個質(zhì)量濃度梯度的混合標樣，見表2，于優(yōu)化色譜條件下按質(zhì)量濃度由低到高的順序上機檢測。以混合標樣各組分的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，對應峰面積（y）為縱坐標建立標準曲線。

表2 混合標樣質(zhì)量濃度梯度Table 2 Mass concentration gradient of mixed standard solution mg/L

（2）檢出限和定量限

將混合標樣梯度1逐步稀釋檢測，把信噪比（signalnoise ratio，S/N）分別為3和10所對應分析物的質(zhì)量濃度作為方法的檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）。

（3）精密度試驗

精確吸取天龍泉-陶藏酒3A樣品0.5 mL，加入混合標樣梯度三，均勻混合后過0.22 μm針頭濾膜，重復進樣6次，記錄峰面積，計算12種活性成分各自的質(zhì)量濃度及其對應的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），確定方法的精密度。

（4）加標回收率試驗

精確吸取3份天龍泉-陶藏酒3A樣品0.5 mL，分別加入質(zhì)量濃度為2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L 的混合標樣0.5 mL，均勻混合過0.22 μm針頭濾膜后進樣，每個濃度3個平行，計算加標回收率，確定方法的準確度。加標回收率計算公式如式（2）：

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行處理，樣品數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜條件的確定

2.1.1 檢測波長的確定

本試驗采用PDA檢測器對混合標樣梯度三進行紫外二極管陣列掃描，結(jié)果見圖1。

圖1 12種活性成分混合標樣于全波長（190～400 nm）處的HPLC光電二極管陣列光譜圖Fig.1 HPLC photodiode array spectrograms of 12 active components mixed standard solution at full-wavelength (190-400 nm)

由圖1可知，表兒茶素、大豆苷、兒茶素、葛根素、羅漢果苷IV、羅漢果苷V、山奈酚、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、異槲皮苷、槲皮素、蘆丁及槲皮苷對應的最大吸收波長分別為203 nm、192 nm、207 nm、194 nm、192 nm、190 nm、192 nm、266 nm、204 nm、255 nm、204 nm及204 nm。為簡化定量過程，在保證各組分檢測靈敏的前提下，因12種活性成分在波長203 nm處均有吸收，故選擇定性檢測波長為203 nm。

2.1.2 洗脫梯度的確定

對混合標樣進行四個典型梯度的洗脫，其洗脫效果見圖2。

圖2 12種活性成分混合標樣于波長203 nm處的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of 12 active components mixed standard solution at 203 nm

由圖2A可知，采用梯度一進行洗脫，各標準品出峰時間過于集中，表兒茶素（峰2）與兒茶素（峰3）未見分離，與HPLC測定葡萄酒中表兒茶素、兒茶素等9種酚類物質(zhì)的結(jié)果相同[24]，且該洗脫條件下異槲皮苷（峰6）與山奈酚-3-O-蕓香糖苷（峰7）未完全分離；由圖2B可知，采用梯度二洗脫，異槲皮苷（峰6）與山奈酚-3-O-蕓香糖苷（峰7）已分離，分離度為1.54，但其他物質(zhì)分離效果不理想，且蘆丁（峰5）前存在雜峰（峰a）；由圖2C可知，采用梯度三洗脫，表兒茶素（峰2）、兒茶素（峰3）分離效果仍不理想，分離度僅為1.23，基于洗脫梯度二條件下調(diào)整后發(fā)現(xiàn)蘆?。ǚ?）與雜質(zhì)（峰a）融合；經(jīng)多次調(diào)整洗脫梯度，表兒茶素、兒茶素達不到有效分離，且測定目標活性成分蘆丁與雜質(zhì)峰融合，因此需進一步優(yōu)化洗脫梯度，參考測定華佗延壽酒中表兒茶素、兒茶素素等成分的洗脫條件[25]，對試驗洗脫梯度進行調(diào)整，由圖2D可知，采用梯度四洗脫，表兒茶素（峰2）、兒茶素（峰3）分離度達到1.56，同時該梯度條件下，蘆丁（峰5）與雜質(zhì)峰完全分離。通過對測定梯度的優(yōu)化，采用洗脫梯度四洗脫，各活性成分峰形好、12種測定的目標成分分離度高，滿足分析要求，最終確定梯度四為最優(yōu)洗脫梯度，用于后續(xù)的定性定量分析。

2.2 12種活性成分的定性和定量

在上述優(yōu)化條件的基礎上，于203 nm波長下檢測混合標準樣品，其HPLC色譜圖見圖3，保留時間見表3。

圖3 12種活性成分混合標樣在203 nm檢測波長條件下HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of 12 active components mixed standard under detected wavelength 203 nm condition

由圖3可知，在優(yōu)化后色譜條件下，各活性成分峰形好、各相鄰的成分完全分離，即分離度均＞1.5[23]。

2.3 方法學考察

優(yōu)化色譜條件下測定混合標樣，以每種物質(zhì)最大吸收波長處測定得到的色譜峰面積（Y）為縱坐標，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，建立12種活性成分的標準曲線，獲得12種活性成分的標準曲線回歸方程，進行方法學驗證。確定保留時間、線性回歸方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限及定量限，結(jié)果見表3。由表3可知，各活性成分呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)R2為0.993～0.999，方法檢出限為0.018～0.210 mg/L，定量限為0.062～0.701 mg/L。

表3 12種活性成分的保留時間、線性回歸方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 Retention time,linear regression equation,linear range,correlation coefficient,detection limit and quantification limit of 12 active components

方法精密度試驗結(jié)果見表4。由表4可知，精密度試驗結(jié)果相對標準偏差（RSD）為1.11%～4.28%，說明該方法的精密度較高。

表4 精密度試驗結(jié)果Table 4 Results of precision tests

方法加標回收率試驗結(jié)果見表5。由表5可知，平均加標回收率為89.6%～118.1%，回收率試驗結(jié)果的相對標準偏差（RSD）為1.00%～4.53%，表明該方法準確度良好，能滿足分析要求。

表5 加標回收率試驗結(jié)果Table 5 Results of standard recovery rate tests

2.4 天龍泉-陶藏酒樣品中12種活性成分的檢測結(jié)果

采用上述優(yōu)化色譜條件檢測天龍泉-陶藏酒3款產(chǎn)品中12種活性成分，結(jié)果見表6。由表6可知，天龍泉-陶藏酒3A、4A蘆丁含量較高，其對應的含量測定值均＞30 mg/L，陶藏酒5A中含有較多的葛根素，測定值≥14 mg/L，且陶藏酒5A中特有的兩種活性成分羅漢果苷IV、羅漢果苷V的含量分別約為4 mg/L、5 mg/L。實際測得的成分與產(chǎn)品生產(chǎn)中所添加的提取物情況相符，因此該方法適用于測定天龍泉-陶藏酒。

表6 天龍泉-陶藏酒樣品測定結(jié)果Table 6 Determination results of Tianlongquan Taocang Baijiu sample

3 結(jié)論

本研究建立了同時測定天龍泉-陶藏酒中12種活性成分的高效液相色譜方法，通過對試驗條件的優(yōu)化，采用Waters AtlantisT3色譜柱（4.6 mm×25 mm，5 μm），流動相：乙腈-水溶液，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，進樣量5 μL，柱溫32 ℃，檢測波長203 nm，保留時間定性，外標法定量。在此優(yōu)化檢測條件下，其精密度試驗結(jié)果相對標準偏差（RSD）為1.11%～4.28%，平均加標回收率為89.6%～119.7%，方法的檢出限為0.018～0.210 mg/L，定量限為0.062～0.701 mg/L。該方法線性良好、檢出限低、精密度和準確度良好，操作簡單，能滿足對天龍泉-陶藏酒12種活性成分含量的日常監(jiān)控。