江 威，李 強，唐 潔，林 斌，朱麗萍，李 群，陳申習

（勁牌有限公司 勁牌研究院 中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435100）

中藥材制曲具有悠久的歷史，在北魏時期的著作《齊民要術》中便有“制曲入藥”的記載，中藥入曲是我國古代釀酒技術的一大創(chuàng)舉[1]，一直沿用至今。如董酒在其大小曲中加入百余種中藥材進行發(fā)酵，形成了獨特的董香型風格白酒[2-3]，邛崍米曲中也加入了72味中藥材[4]。中藥制曲能夠提升酒曲質量進而提升原酒質量。雷學俊等[5]發(fā)現(xiàn)，黨參、紅景天、白芍的添加對米曲糖化力和液化力的提高具有明顯的促進作用。吳志等[6]在制曲過程中添加3%的石菖蒲、生地黃、白術等藥材的醇提液發(fā)現(xiàn)，添加中草藥酒曲的發(fā)酵力、糖化力、總微生物數(shù)量得到大幅提高。除此之外，中藥制曲還能夠提升白酒的風味。李保國等[7]研究發(fā)現(xiàn)，加入薄荷能夠提升酒的風味物質含量。吳瓊燕[8]在桂皮藥曲中檢測到更多的香氣成分。許必晏[9]確定18種促進釀造微生物生長的中藥材，制曲后釀造的清香型白酒質量得到提升，且降低雜醇油的效果較好。

清香型白酒清香純正，柔和協(xié)調，可以與中藥活性物質風味相融合，是制作配制酒和藥酒重要基酒之一。根據(jù)勁牌有限公司保健酒中藥材配方及相關研究報道[5-13]發(fā)現(xiàn)，茴香、薄荷、桂皮、陳皮、丁香、甘草具有提升白酒風味作用，茯苓、杏仁、人參、丹參、梔子、川芎、當歸具有保健功能，紅景天、白芍、地黃、白術、桑葉、辣蓼、黃芪能夠提升酒曲性能，這些中藥材具有提升原酒質量的潛能。而釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和米根霉（Rhizopus oryzae）是清香型酒曲中的主要釀造微生物[14-15]，分別具有提高出酒率、高產酯、高糖化力的性能。因此，探究清香型酒曲中中藥材的添加對清香型白酒風味及原酒質量的提升具有重要意義，但中藥材的添加對發(fā)酵微生物的生長是否有影響是判斷其能否加入酒曲的前提條件，但目前中藥材對清香型白酒功能微生物生長及品質的影響缺乏研究。

本研究采用微生物培養(yǎng)的方法分別探究20種中藥材對清香型白酒中主要發(fā)酵微生物釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y1、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y29和米根霉（Rhizopus oryzae）G1生長的影響，在綠衣觀音土曲中添加中藥材，模擬清香型白酒工藝進行固態(tài)發(fā)酵小試實驗，對糖化醅中的微生物數(shù)量進行分析，通過氣相色譜（gas chromatography，GC）儀對小試酒樣中的乙酸乙酯、乳酸乙酯、雜醇油含量進行檢測，以期明確中藥材的添加對清香型白酒質量的影響，驗證中藥材在清香型酒曲中添加的可行性，為后續(xù)制曲中添加中藥材提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

綠衣觀音土曲：勁牌公司毛鋪制曲車間；20種中藥材：勁牌有限公司購于各產地的道地藥材。釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）Y1、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y29、米根霉（Rhizopus oryzae）G1：勁牌有限公司勁牌研究院微生物研究室。

1.1.2 試劑

制霉素（分析純）：華北制藥股份有限公司；葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、瓊脂、氯化鈉（均為分析純或生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇（色譜純）：美國SAFC Biosciences公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基：海博生物技術有限公司。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、瓊脂20 g，溶解在1 L蒸餾水中，pH 7.0左右，115 ℃滅菌30 min，冷卻至40 ℃后加入終質量濃度0.3 g/L的制霉素。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，溶解在1 L蒸餾水中，115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-75S蒸汽滅菌鍋、SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司；BCM-1600A潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；WFJ可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；Agilent 7890A型氣相色譜（GC）儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母活化液及米根霉麩皮種的制備

酵母活化液的制備：將菌株Y1和Y29的甘油管保存液接種于YPD培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，經10 mL無菌水試管梯度稀釋至10-5，取10-5梯度稀釋液200 μL均勻涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)2 d后，對酵母菌進行計數(shù)，獲得酵母活化液。

米根霉麩皮種的制備：于100 g麩皮中加入80 mL蒸餾水，115 ℃滅菌30 min，用接種環(huán)從菌株G1保藏斜面中取出菌絲，接入麩皮中，30 ℃培養(yǎng)3 d后，將培養(yǎng)好的G1麩皮種取出放入托盤，在40 ℃烘箱中烘干24 h，常溫下密封保藏備用。

1.3.2 中藥材培養(yǎng)基的制備

分別稱取20種中藥材（桂皮、茴香、杏仁、甘草、當歸、川芎、辣蓼、陳皮、茯苓、薄荷、人參、白術、梔子、桑葉、黃芪、白芍、丹參、地黃、丁香、紅景天）20 g，清洗藥材表面污垢后，置于清水中浸泡30 min后，加入約400 mL水小火煮沸1 h至200 mL容器中趁熱過濾，4 ℃冷藏備用。以制備藥汁替代相應的無菌水，配制成含10 g/L藥汁的孟加拉紅培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基。

1.3.3 中藥材對微生物生長的影響

以不添加藥汁的孟加拉紅培養(yǎng)基為對照，將4～5個大小均勻的米根霉G1麩皮種接種在孟加拉紅培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)48 h，通過與對照比較菌落大小、菌絲蔓延情況及菌絲茂密程度，考察中藥材是否對米根霉的生長有影響。將酵母活化液稀釋至10-5，取200 μL的酵母Y1活化液（約1.2×108CFU/mL）、酵母Y29活化液（約1.0×108CFU/mL）均勻涂布于含藥汁孟加拉紅培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，對酵母菌落進行計數(shù)。通過與對照比較微生物數(shù)量及菌落直徑，考察中藥材對釀酒酵母Y1和異常威克漢姆酵母Y29生長的影響[16]。

1.3.4 清香型白酒的小試生產及試驗設計

在實驗室水平模擬清香型白酒生產工藝[17]。稱取適量糯高粱于65 ℃熱水中浸泡過夜，115 ℃蒸糧10 min，65 ℃水中燜糧5 min，111 ℃復蒸10 min。將熟糧1 kg攤晾至30 ℃左右，對照組加入5.0 g綠衣觀音土曲，實驗組加入5.0 g綠衣觀音土曲和1.0 g中藥材（丁香和紅景天添加量為熟糧的0.05%，即0.5 g），酒曲和熟糧均勻翻拌后于30 ℃糖化24 h。500 g糖化醅與500 g滅菌酒糟進行混合，30 ℃發(fā)酵7 d后，取酒醅小火慢蒸收集前100 mL酒樣。

1.3.5 中藥材對糖化醅中微生物的影響

在無菌條件下，取10 g糖化醅于90 mL無菌水中，置于150 r/min搖床，30 ℃活化30 min，再經10 mL無菌水試管將菌懸液梯度稀釋至10-4，取10-4梯度稀釋液200 μL均勻涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基中，酵母和霉菌在30 ℃下培養(yǎng)2 d，同時取10-4梯度稀釋液200 μL均勻涂布于LB培養(yǎng)基中，細菌在37 ℃下培養(yǎng)1～2 d至單菌落長出，采用菌落記號方式對單菌落進行計數(shù)[17]，測量4～6個菌落直徑，并取平均值。

1.3.6 中藥材對清香型白酒原酒風味物質的影響

采用氣相色譜法檢測酒樣中乙酸乙酯、乳酸乙酯、雜醇油含量[18]。

酒樣預處理：準確移取酒樣1 mL于2 mL樣品瓶中，加入10 μL內標（叔戊醇質量濃度為17 028.1 mg/L，乙酸正戊酯質量濃度為16 864.0 mg/L，2-乙基己醇質量濃度為12 104.2 mg/L），蓋上瓶蓋，搖勻。

氣相色譜條件：載氣為高純氮氣（N2），純度為99.999%，進樣口溫度250 ℃，分流比30∶1；流速為1.0 mL/min，升溫程序為初始溫度35 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升至70 ℃，再以3.5 ℃/min升至190 ℃，保持25 min；檢測器為氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID），溫度260 ℃；尾吹氣流速25 mL/min，氫氣（H2）流速30 mL/min，空氣流速350 mL/min。

定性與定量：采用保留時間定性及內標法定量。

1.3.7 出酒率的計算

出酒率的計算參考文獻[19]，在20 ℃條件下，先將樣品實際酒精度折算酒精度為55時的比值，再計算乙醇質量，其與投糧量百分比值表示出酒率，出酒率計算數(shù)學式如下：

式中：0.92003為20℃條件下，乙醇體積分數(shù)為55%的原酒密度，g/mL；100為接酒體積，mL；225為投糧質量，g。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL2019進行數(shù)據(jù)處理，采用Origin 9.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 中藥材對清香型白酒中主要釀酒微生物生長的影響

2.1.1 中藥材對釀酒酵母Y1和Y29生長的影響

20種中藥材對釀酒酵母Y1和Y29的數(shù)量及菌落直徑的影響見表1。

由表1可知，添加桂皮、茯苓、白芍、丁香、紅景天藥汁的培養(yǎng)基中，菌株Y1菌落直徑均＜2 mm，其中，質量濃度為10 g/L的丁香和紅景天藥汁對菌株Y1的大小抑制作用最明顯，菌落直徑僅0.6 mm。上述藥材對菌落數(shù)量沒有較大影響，說明上述藥材成分對菌株Y1的生長速度起到一定的抑制作用。而添加了茴香、杏仁、甘草、陳皮、梔子、桑葉、黃芪的孟加拉紅培養(yǎng)基中，菌株Y1的菌落直徑相較于對照大，菌落直徑在3.0～4.0 mm，增長了50%～100%，說明上述藥材對釀酒酵母Y1的生長具有促進作用，其藥材中成分能夠被釀酒酵母Y1所利用，促進其增殖。薄荷、杏仁、桂皮的添加對菌株Y1的數(shù)量增長有促進作用，其中添加薄荷使菌株Y1的增長量達到18.72%，白術的添加對菌株Y1的菌落數(shù)量有抑制作用，其余6種藥材對菌株Y1的生長沒有明顯的影響。菌株Y1是清香型白酒酒曲中重要的產醇菌株，茴香、杏仁、甘草等中藥材對菌株Y1的生長具有促進作用，應用于酒曲則有望進一步提升酒曲的發(fā)酵力。

表1 中藥材對釀酒酵母Y1和異常威克漢姆酵母Y29生長的影響Table 1 Effect of Chinese medicinal materials on the growth of Saccharomyces cerevisiae Y1 and Wickerhamomyces anomalus Y29

由表1亦可知，添加了紅景天和白芍的培養(yǎng)基中，菌株Y29的菌落直徑較對照小，均＜2 mm，說明其菌落生長速度慢，其中，白芍僅抑制菌落直徑大小，對菌落數(shù)量沒有明顯影響。質量濃度為10 g/L的丁香汁完全抑制了菌株Y29的生長，平板中未見菌落長出。添加了茴香、杏仁、甘草、辣蓼、陳皮、人參、白術、梔子、桑葉、地黃的培養(yǎng)基中，菌株Y29菌落的直徑大于對照，菌落直徑在2.6～5.6 mm，其中，甘草和杏仁對菌落直徑的促進作用最明顯，分別達到4.0 mm和5.6 mm，說明甘草和杏仁中存在對菌株Y29生長有益的成分。添加桂皮、陳皮、茯苓、薄荷、人參、白術、梔子、黃芪的培養(yǎng)基中菌落數(shù)量少許增加，薄荷對菌株Y29的增殖也起到一定的促進作用，其菌落數(shù)量增長了23.28%。清香型白酒中以乙酸乙酯為主的酯類物質含量是白酒質量的重要指標之一，而菌株Y29是主要的酯化酶產生菌株，茴香、杏仁、甘草等中藥有助于Y29的生長，在后期應用于酒曲中，具有提升原酒酯類風味物質的潛力。

2.1.2 中藥材對米根霉G1生長的影響

20種中藥材對米根霉G1生長的影響見圖1。由圖1可知，質量濃度為10 g/L的丁香和紅景天汁對米根霉的生長具有明顯的抑制作用，且丁香的抑制作用更強，主要表現(xiàn)為菌株G1的菌落較小或菌絲稀疏。茯苓汁對米根霉的生長也具有抑制作用，主要表現(xiàn)為菌落比對照小，但菌絲比對照更長且濃密。20種藥材中對米根霉G1生長具有促進作用的中藥材有桂皮、杏仁、甘草、辣蓼、薄荷、人參、白術、桑葉、黃芪、白芍、丹參、地黃，主要表現(xiàn)為菌絲較蔓延、菌落較大、菌絲較長且相對更加濃密，說明上述藥材對米根霉G1的生長具有促進作用，從而提升與糖化作用相關的酶類含量。將其添加到酒曲中，可促進糖化過程中淀粉轉化為可發(fā)酵糖，進而提高酒曲的糖化力。

圖1 中藥材對米根霉G1生長的影響Fig.1 Effect of Chinese medicinal materials on the growth of Rhizopus oryzae G1

由上述分析可知，丁香和紅景天對菌株Y1、Y29和G1均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，這與丁香中存在丁香酚以及紅景天中富含紅景天甙有關[20-21]，而中藥材中富含糖、蛋白質、氨基酸、微量元素等，也是其他中藥材對微生物增殖抑制不明顯或促進生長的原因[22]。除丁香和紅景天外，其他中藥材可用于白酒的發(fā)酵過程中，丁香和紅景天則需探究最佳添加量，以便于為后續(xù)兩種中藥材在清香型白酒釀造中的添加量提供參考。

2.2 紅景天和丁香質量濃度對清香型白酒中主要釀酒微生物生長的影響

不同丁香質量濃度對菌株Y1、Y29和G1生長的影響見圖2。由圖2可知，隨著丁香質量濃度的減小，對3種微生物的生長的抑制能力減弱，當丁香汁的質量濃度為0.5 g/L時，對酵母的菌落數(shù)量和米根霉的菌落大小、菌絲長度都有一定的促進作用，因此，培養(yǎng)基中的丁香汁最適質量濃度為0.5 g/L。

圖2 丁香汁質量濃度對菌株Y1、Y29和G1生長的影響Fig.2 Effect of mass concentration of clove juice on the growth of strains Y1,Y29 and G1

紅景天汁質量濃度對菌株Y1、Y29和G1生長的影響見圖3。由圖3可知，紅景天汁的質量濃度越低，對3種微生物的抑制效果越小，當質量濃度為1 g/L時，紅景天對釀酒酵母Y1和異常威克漢姆酵母Y29的生長沒有明顯的影響，但對米根霉生長具有一定的抑制作用。當質量濃度為0.5 g/L時，紅景天汁對兩種酵母沒有明顯的抑制作用，且能促進米根霉菌絲生長。因此，培養(yǎng)基中的紅景天汁的最適添加量為0.5 g/L。

圖3 紅景天汁質量濃度對菌株Y1、Y29和G1生長的影響Fig.3 Effect of mass concentration of Rhodiola rosea juice on the growth of strains Y1、Y29 and G1

2.3 中藥材對清香型白酒糖化醅微生物的影響

20種中藥材對糖化醅中微生物數(shù)量的影響見圖4。由圖4可知，大部分中藥材的加入對細菌、酵母和霉菌的數(shù)量均有一定的促進作用。其中，除添加了茯苓和白術的糖化酒醅中細菌數(shù)量分別下降2.08%和4.41%外，其余藥材的加入均對細菌生長有較明顯的促進作用，其中，川芎、甘草、當歸、地黃對細菌生長的促進作用最明顯，細菌數(shù)量分別增加了143.03%、127.55%、96.21%和90.79%。各中藥材對酵母和霉菌生長具有一定促進作用，其中，辣蓼、杏仁和甘草對酵母的菌落數(shù)增加幅度較高，分別增加47.69%、43.07%和40.00%。人參、杏仁和桑葉則能顯著增加糖化醅中霉菌的數(shù)量，分別增加73.47%、32.65%和32.57%?？傮w來看，杏仁、甘草、當歸、川芎、地黃、陳皮、辣蓼、黃芪、人參、桑葉、桂皮、茴香和薄荷對3種微生物的生長均具有一定的促進作用。

圖4 中藥材對糖化酒醅中細菌（a）、酵母（b）及霉菌（c）數(shù)量的影響Fig.4 Effect of Chinese medicinal materials on the number of bacteria (a),yeast (b) and mold (c) in saccharified grains

2.4 中藥材對清香型白酒質量的影響

乙酸乙酯、乳酸乙酯、雜醇油是表征清香型白酒中質量的主要色譜指標[23-26]。20種中藥材對乙酸乙酯、乳酸乙酯、雜醇油的影響見圖5。由圖5a可知，9種中藥材（桂皮、茴香、杏仁、當歸、川芎、辣蓼、陳皮、桑葉、黃芪）可增加乙酸乙酯含量，其中茴香、陳皮和杏仁分別使乙酸乙酯含量增加32.44%、17.79%和15.09%；由圖5b可知，8種中藥材（桂皮、茴香、杏仁、甘草、當歸、人參、白術、桑葉）可以增加乳酸乙酯含量，杏仁、茴香、桂皮和白術分別使乳酸乙酯含量增加45.14%、42.82%、38.41%和22.56%；由圖5c可知，10種中藥材（甘草、川芎、茯苓、薄荷、人參、白術、梔子、桑葉、黃芪、白芍）可以降低雜醇油含量，其中，茯苓、黃芪和人參在降低雜醇油含量方面作用較明顯，分別降低了9.23%、7.35%和6.14%。由圖5d可知，5種中藥材（甘草、當歸、川芎、辣蓼、陳皮）對出酒率具有少許提升，其中當歸和川芎分別提升4.49%和3.45%，茯苓、人參、白術、薄荷則分別降低了7.51%、5.87%、4.49%和4.40%的出酒率。

圖5 20種中藥材對清香型白酒中乙酸乙酯（a）、乳酸乙酯（b）、雜醇油（c）及出酒率（d）的影響Fig.5 Effect of 20 Chinese medicinal materials on ethyl acetate (a),ethyl lactate (b),fusel oil (c) and liquor yield (d) in light-flavor Baijiu

3 結論

本研究探究了20種中藥材對清香型白酒主要微生物生長和原酒質量的影響，結果顯示，大部分藥材對釀酒微生物的生長具有一定的促進作用，丁香和紅景天則對微生物的生長具有較明顯的抑制作用，其藥汁添加質量濃度應控制在0.5 g/L左右。20種藥材中，杏仁、甘草和當歸等中藥材具有促進釀造微生物增殖的作用；杏仁、茴香、當歸和桂皮對原酒具有較好的提高乙酸乙酯和乳酸乙酯的效果，而茯苓、黃芪和人參則具有較好的降低雜醇油的效果。由于不同的藥材其作用不同，在實際生產中應結合不同的酒質提升需求，設置不同的中藥材添加種類以及添加比例，在避免中藥材帶來的負面影響的基礎上提升清香型白酒酒質。