任 愛，沈丹陽，王源寧，陳 磊，孫 琳，周義發(fā)，程海榮

(東北師范大學 生命科學學院，長春 130024)

目前, 結(jié)直腸癌已成為世界第三大常見癌癥，平均每年新增病例約200萬[1].治療結(jié)腸癌的方法主要有手術(shù)、放療、化療和免疫療法.其中免疫療法因其高效、副作用低等優(yōu)勢已引起人們廣泛關(guān)注[2].巨噬細胞在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，既作為固有免疫應(yīng)答細胞，又作為免疫調(diào)節(jié)細胞，可誘導(dǎo)、抑制或調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，參與器官發(fā)育、宿主防御、急慢性炎癥、感染和代謝等各種生理病理過程[3].腫瘤組織中浸潤大量的巨噬細胞，稱為腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs).巨噬細胞具有較強的可塑性，有兩種常見亞型： 1) M1型巨噬細胞即經(jīng)典激活巨噬細胞，具有較強的抗原提呈能力，可促進炎癥反應(yīng)、產(chǎn)生大量促炎因子，如TNF-α，IL-6和IL-1β等，上調(diào)M1型巨噬細胞標志物表達如CD80,CD86,iNOS等[4]；2) M2型巨噬細胞, 是選擇性活化巨噬細胞，能抑制炎癥反應(yīng)，促進血管生成[5]，可產(chǎn)生大量的抑炎因子，如TGF-β,IL-4,IL-10等，以及上調(diào)M2型巨噬細胞標志物表達，如Arg-1,Ym-1，F(xiàn)izz-1和CCL18等.在腫瘤微環(huán)境中，TAMs主要表現(xiàn)為M2型.研究表明，M2和M1 的比值與腫瘤的愈后呈明顯相關(guān)性.因此，誘導(dǎo)M2型巨噬細胞向M1型極化對抑制腫瘤生長具有重要意義.

多糖具有調(diào)節(jié)免疫[6]、抗腫瘤[7]、抗病毒[8]、抗炎[9]和抗氧化[10]等多種生物活性.多糖可促進促腫瘤生長的M2型巨噬細胞向抑制腫瘤生長的M1型巨噬細胞極化.其中，酵母β-葡聚糖可促進TAMs轉(zhuǎn)化為M1型巨噬細胞，并已應(yīng)用于神經(jīng)母細胞瘤患者的Ⅰ期臨床試驗中[11]；姬松茸多糖可提高M2型巨噬細胞中TNF-α，NOS2，IL-12和IL-6的表達，即向M1表型轉(zhuǎn)化[12]；豬苓多糖可顯著增加炎癥相關(guān)因子的表達，將M2型巨噬細胞轉(zhuǎn)化為M1型巨噬細胞[13].

蜜環(huán)菌(Amillariellamellea)屬擔子菌門傘菌目泡頭菌科，是一種在我國分布廣泛的食用菌.文獻[14]從蜜環(huán)菌子實體中通過乙醇分級醇沉分離得到一種β-1,6-葡聚糖并命名為 AAMP-A70，其分子量為5 600.研究表明，AAMP-A70能夠上調(diào)小鼠單核巨噬細胞RAW264.7中NO，ROS，IL-1β，TNF-α和IL-6的表達，同時也可將小鼠單核巨噬細胞RAW264.7從M2型轉(zhuǎn)化為M1型, 進而抑制結(jié)腸癌細胞HCT116的增殖[15].在此基礎(chǔ)上，本文采用人源單核巨噬細胞THP-1研究AAMP-A70對M2型巨噬細胞極化的影響，并分析該極化作用對人源結(jié)腸癌細胞DLD-1增殖和凋亡的影響.研究結(jié)果可豐富β-1,6-葡聚糖誘導(dǎo)巨噬細胞極化的研究，同時為β-1,6-葡聚糖作為抗腫瘤藥物的開發(fā)提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗材料

人源單核細胞THP-1和人源結(jié)腸癌細胞DLD-1均購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC).蜜環(huán)菌均一級分AAMP-A70，參考文獻[13]制備.

1.1.2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；IL-4,IL-13和IFN-γ購于美國MCE公司；脂多糖(LPS)和佛波酯(PMA)購于美國Sigma公司；PARP,Pro-casepase-3和Cleaved-Casepase-3抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；胎牛血清購于浙江天杭生物科技股份有限公司；ELISA試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；胰酶、二甲亞砜(DMSO)和結(jié)晶紫購于北京索萊寶科技有限公司；TRNzol試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司；磺胺和萘胺購于天津光復(fù)精細化工研究所.

1.1.3 主要實驗儀器

多功能酶標儀(SPARK 10M型，瑞士Tecan公司); NanoDrop微量分光光度計(ND-ONE-W型，美國Thermo Fisher Scientific公司); 實時熒光定量PCR儀(聚合酶鏈式反應(yīng)，qRT-PCR, LightCycler480Ⅱ型，瑞士Roche公司)；電泳儀(JY600E型，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；垂直電泳槽(VE-180型)、轉(zhuǎn)移電泳槽(VE-186型)和化學發(fā)光分析系統(tǒng)(4600型)均購于上海天能科技有限公司.

1.2 方 法

1.2.1 巨噬細胞極化實驗

圖1 THP-1細胞誘導(dǎo)為M1和M2型巨噬細胞及 AAMP-A70處理M2型巨噬細胞示意圖Fig.1 Schematic diagram of induction of THP-1 cells into M1 and M2-like macrophages and AAMP-A70 treatment of M2-like macrophages

THP-1按1.6×106個/孔鋪于6孔板中，采用100 ng/mL PMA處理THP-1細胞24 h即可將其誘導(dǎo)為M0型巨噬細胞.向該M0型巨噬細胞中加入20 ng/mL的 IL-4和IL-13再誘導(dǎo)24 h，即可誘導(dǎo)為M2型巨噬細胞.在THP-1細胞培養(yǎng)基中加入100 ng/mL PMA孵育 48 h后，再加入20 ng/mL的IFN-γ和100 ng/mL 的LPS，即可誘導(dǎo)為M1型巨噬細胞.AAMP-A70處理組(M2+AAMP-A70組)在將THP-1細胞誘導(dǎo)為M2型巨噬細胞24 h后，加入200 μg/mL AAMP-A70，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，其示意圖如圖1所示.

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實驗

取細胞上清液按1∶100(體積比，下同)稀釋后按100 μL/孔加入酶標板中，于37 ℃孵育90 min后，棄去液體；每孔加入 100 μL稀釋后的抗體，37 ℃孵育60 min后，棄去液體；用洗滌液洗滌5次，每次1 min.每孔加入 100 μL 稀釋后的ABC抗體，37 ℃孵育30 min后，棄去液體，用洗滌液洗滌5次，每次1 min.每孔加入90 μL的3,3′，5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液，充分顯色后，加入100 μL終止液.采用酶標儀在 450 nm 處檢測各孔吸光值，TNF-α及VEGF相對釋放量=(AM1組,M2組或M2+AAMP-A70組/AM1組)×100%.

1.2.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

向每組細胞中加入1 mL TRNzol試劑提取mRNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對mRNA進行反轉(zhuǎn)錄，使用NanoDrop分光光度計測定cDNA濃度和純度.根據(jù)qRT-PCR試劑盒的說明書進行實時定量PCR擴增.反應(yīng)程序為： 95 ℃，5 min；反應(yīng)40個循環(huán)，每個循環(huán)為95 ℃，10 s；58 ℃，10 s；72 ℃，10 s.引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成，合成引物序列如下：

TNF-α，F(xiàn)orward: 5′-TGGAGCTGGCCGAGGAG-3′，

Reverse: 5′-AGCAGGCAGAAGAGCGTGG-3′；

Arg-1，F(xiàn)orward: 5′-TGGACAGACTAGGAATTGGCA-3′，

Reverse: 5′-CCAGTCCGTCAACATCAAAACT-3′；

IL-1β，F(xiàn)orward: 5′-AATCTGTACCTGTCCTGCGTGTT-3′，

Reverse: 5′-TGGGTAATTTTTGGGATCTACACTCT-3′；

TGF-β，F(xiàn)orward: 5′-CCCTGGACACCAACTATTGC-3′，

Reverse: 5′-GCAGAAGTTGGCATGGTAGC-3′；

CCR7，F(xiàn)orward: 5′-AGTCTTCCAGCTGCCCTACA-3′，

Reverse: 5′-TCGTAGGCGATGTTGAGTTG-3′.

1.2.4 結(jié)晶紫染色實驗

采用1.2.1的方法給藥后，取誘導(dǎo)后的M2組、M2+AAMP-A70組和M1組THP-1細胞，棄去培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h.收集細胞培養(yǎng)上清液，并加入胎牛血清調(diào)整至終體積分數(shù)為5%.將體積分數(shù)為75%的培養(yǎng)上清液(conditioned medium，CM)加至DLD-1細胞中，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，棄培養(yǎng)上清液，每孔加入500 μL無水甲醇，于室溫中靜置5 min后，再加入500 μL結(jié)晶紫試劑，于室溫中染色5 min.棄染色液后流水沖洗，去除多余染色液，室溫晾干后拍照.

1.2.5 MTT實驗

將DLD-1細胞按1×104個/孔鋪于96孔板中.按1.2.4方法收集的各組上清液以不同濃度加至DLD-1中培養(yǎng)72 h后，棄去上清液.每組加入0.5 mg/mL MTT溶液100 μL，于37 ℃孵育4 h后，每組加入含0.04 mol/L HCl的質(zhì)量分數(shù)為20%的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液50 μL，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，采用酶標儀于570 nm處測各孔吸光值.

1.2.6 Western-blot實驗

提取各上清液處理后的DLD-1細胞中的總蛋白，并進行蛋白定量.采用質(zhì)量分數(shù)為12%丙烯酰胺凝膠分離蛋白樣品，先將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，再用脫脂牛奶封閉后，采用磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌.加入按1∶1 000稀釋的一抗工作液，置于4 ℃搖床中孵育過夜.洗滌后加入按1∶5 000稀釋的二抗工作液，室溫孵育1 h，采用PBST洗滌.將增強型化學發(fā)光劑(ECL)均勻滴于PVDF膜上，采用化學發(fā)光儀檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達.

1.2.7 統(tǒng)計學分析

所有實驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果均以平均值±標準差的形式(SD)表示.兩組數(shù)據(jù)的顯著性用t檢驗進行比較.當p<0.05時，表示差異顯著，表明該結(jié)果具有統(tǒng)計學意義.*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001.

2 結(jié)果與討論

2.1 AAMP-A70對M2型人源巨噬細胞極化的影響

2.1.1 AAMP-A70對M2型人源巨噬細胞TNF-α和VEGF釋放量的影響

M1型巨噬細胞高表達促炎因子(如TNF-α和IL-6等)，產(chǎn)生的VEGF量較低；而M2型巨噬細胞則相反.研究表明，當AAMP-A70質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，其誘導(dǎo)RAW264.7小鼠單核巨噬細胞活化的能力較強[14-15].因此，本文采用200 μg/mL 的AAMP-A70處理THP-1細胞誘導(dǎo)的M2型巨噬細胞，并采用ELISA方法檢測TNF-α和VEGF的相對含量.結(jié)果表明，M2型巨噬細胞TNF-α分泌量較低，VEGF分泌量較高，即已誘導(dǎo)出M2型巨噬細胞.采用AAMP-A70處理M2型巨噬細胞后，TNF-α分泌量顯著增加(p<0.001)，VEGF含量顯著降低，表明AAMP-A70可促進M2型巨噬細胞向M1型極化，如圖2所示.

2.1.2 AAMP-A70對M2型人源巨噬細胞特異性標志蛋白mRNA表達的影響

研究表明, M1型巨噬細胞高表達TNF-α,IL-1β和CCR7的mRNA，低表達Arg-1和TGF-β的mRNA，M2型巨噬細胞相反.本文采用qRT-PCR方法在轉(zhuǎn)錄水平上檢測AAMP-A70對M2型人源巨噬細胞特異性標志蛋白的mRNA表達的影響，結(jié)果如圖3所示.由圖3可見，M2型巨噬細胞低表達TNF-α，IL-1β和CCR7的mRNA，高表達Arg-1和TGF-β的mRNA.AAMP-A70處理的M2型巨噬細胞具有 M1型巨噬細胞的特征，即TNF-α，IL-1β和CCR7的mRNA表達量顯著增加，Arg-1和TGF-β的mRNA表達量顯著降低.因此AAMP-A70可顯著促進M2型巨噬細胞向M1型極化.

2.2 AAMP-A70通過促進M2型巨噬細胞向M1型極化抑制結(jié)腸癌細胞的增殖

研究表明，AAMP-A70對人結(jié)腸癌細胞DLD-1、人結(jié)腸癌細胞HCT116及小鼠結(jié)腸癌細胞CT26的增殖均無直接抑制作用.本文采用結(jié)晶紫染色實驗和MTT實驗檢測AAMP-A70促進M2型巨噬細胞向M1型極化是否能夠抑制結(jié)腸癌細胞的增殖.通過鏡下觀察和結(jié)晶紫染色，結(jié)果分別如圖4和圖5所示.由圖4和圖5可見，M1型巨噬細胞培養(yǎng)液可顯著抑制DLD-1細胞的增殖，M2型巨噬細胞培養(yǎng)液處理組的DLD-1細胞無明顯變化，AAMP-A70處理的M2型巨噬細胞培養(yǎng)液的DLD-1細胞增殖明顯減少.

***表示p<0.001.圖2 AAMP-A70對M2型人源巨噬細胞TNF-α(A)和VEGF(B)釋放量的影響Fig.2 Effects of AAMP-A70 on TNF-α (A) and VEGF (B) production released by human M2-like macrophages

**表示p<0.01; ***表示p<0.001.圖3 AAMP-A70對M2型人源巨噬細胞極化相關(guān)特異性標志蛋白mRNA表達的影響Fig.3 Effects of AAMP-A70 on expression of polarization related specific marker protein mRNA of M2 human macrophages

圖4 DLD-1細胞形態(tài)Fig.4 DLD-1 cell morphology

圖5 結(jié)晶紫染色實驗結(jié)果Fig.5 Experimental results of crystal violent staining

采用MTT實驗檢測各組不同濃度的巨噬細胞培養(yǎng)液對DLD-1細胞增殖的影響，結(jié)果如圖6所示.由圖6可見，不同體積分數(shù)的M1型巨噬細胞培養(yǎng)液均可顯著抑制DLD-1細胞的增殖(p<0.001)，不同體積分數(shù)的M2型巨噬細胞培養(yǎng)液對DLD-1細胞的增殖均無影響(p>0.05)，AAMP-A70處理的M2型巨噬細胞培養(yǎng)液隨濃度的增加對DLD-1細胞增殖的抑制作用逐漸增強.因此AAMP-A70可通過促進M2型巨噬細胞向M1型極化，從而抑制結(jié)腸癌細胞DLD-1的增殖.

2.3 AAMP-A70通過促進M2型巨噬細胞向M1型極化促進結(jié)腸癌細胞的凋亡

將M1,M2和M2+AAMP-A70組巨噬細胞培養(yǎng)上清液與結(jié)腸癌細胞DLD-1共培養(yǎng)72 h后，提取細胞總蛋白，并采用Western-blot實驗檢測凋亡相關(guān)蛋白PARP和Caspase-3的表達情況，結(jié)果如圖7所示.由圖7可見： M1型巨噬細胞培養(yǎng)液可顯著促進凋亡相關(guān)蛋白PARP和Caspase-3水解，即cleaved-PARP和 cleaved-Caspase-3表達；M2型巨噬細胞培養(yǎng)液處理DLD-1對凋亡相關(guān)蛋白無明顯影響；AAMP-A70處理M2型巨噬細胞的培養(yǎng)液可顯著上調(diào)PARP和Caspase-3水解.因此AAMP-A70可通過促進M2型巨噬細胞向M1型轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)DLD-1發(fā)生明顯細胞凋亡.

*表示p<0.05; **表示p<0.01; ***表示p<0.001.圖6 MTT實驗結(jié)果Fig.6 Experimental results of MTT

圖7 AAMP-A70處理的M2型巨噬細胞 培養(yǎng)液對結(jié)腸癌細胞DLD-1凋亡 相關(guān)蛋白表達的影響Fig.7 Effect of M2-like macrophage culture medium treated with AAMP-A70 on expressions of apoptotic- related proteins DLD-1 in colon cancer cells

綜上所述，AAMP-A70可促進由THP-1誘導(dǎo)的M2型巨噬細胞高表達M1型特異性標志分子TNF-α,IL-1β和CCR7，并抑制M2型特異性標志分子Arg-1,VEGF和TGF-β的表達，表明AAMP-A70可抑制M2型巨噬細胞向M1極化.此外，AAMP-A70可通過促進巨噬細胞極化抑制結(jié)腸癌細胞DLD-1的增殖，誘導(dǎo)其凋亡.