李璟依,張慧云,何韶衡,孫健

特應性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一種與過敏相關的常見慢性復發(fā)性皮膚病。根據血清總IgE水平和是否具有特異性IgE，AD可以分成內源性AD(iAD)和外源性AD(eAD)兩種類型。嗜堿性粒細胞通過抗原呈遞、Th2型免疫反應的啟動和維持以及分泌細胞因子等多種途徑參與過敏性疾病的發(fā)生。有研究[1-2]發(fā)現，在特應性皮炎患者的病變組織尤其是斑貼試驗測試部位，存在著嗜堿性粒細胞浸潤，且AD患者皮膚中嗜堿性粒細胞數量顯著升高[3]。另外，AD患者外周血中存在特異性IgE介導的嗜堿性粒細胞激活[4]，這些研究提示嗜堿性粒細胞參與了AD的發(fā)生發(fā)展。

CD63是一種溶酶體相關膜蛋白(LAMP)，早在1991年CD63就被發(fā)現與嗜堿性粒細胞激活有關，且可以作為嗜堿性粒細胞激活的標記物[5]。CD203c是一種糖基化Ⅱ類跨膜分子，又稱為外核苷酸焦磷酸酶磷酸二酯酶3(NPP3)，常表達于肥大細胞、嗜堿性粒細胞表面[6]。作為嗜堿性粒細胞的激活標記物，CD203c具有比CD63更高的敏感性[7]。FcεRI即高親和力IgE受體，在肥大細胞和嗜堿性粒細胞上表達，通過抗原交聯特異性IgE誘導細胞活化[8]。流式細胞術分析時常用的指標有百分比和平均熒光強度(mean fluorescence intensity,MFI)，與傳統(tǒng)的百分比門控策略相比，使用MFI進行分析是一種更敏感和可靠的方法[9]。目前，對于特應性皮炎患者外周血嗜堿性粒細胞上CD63、CD203c和FcεRI表達的研究較少，且尚未有研究對于內、外源性AD嗜堿性粒細胞表達水平進行比較。本研究運用CCR3+CD123+HLA-DR-標記嗜堿性粒細胞，采用流式細胞術檢測內源性AD(intrinsic atopic dermatitis,iAD)、外源性AD(extrinsic atopic dermatitis,eAD)嗜堿性粒細胞表面CD63、CD203c和FcεRI的表達，探討外周血嗜堿性粒細胞尤其是其表面CD63、CD203c和FcεRI表達與不同類型特應性皮炎的關系，希望能為AD的診斷和治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1實驗試劑及儀器 APC偶聯抗人CCR3抗體、FITC偶聯抗人CD123抗體、APC/Cy7偶聯抗人HLA-DR抗體、PE/Cy7偶聯抗人CD63抗體、PE偶聯抗人CD203c抗體、PerCP偶聯FcεRI抗體、FcR阻斷劑、紅細胞裂解液、FACSVerse流式細胞儀等購自美國Biolegend公司。PBS緩沖液購自美國Solarbio公司。

1.2研究對象 選取2021年4月-2021年12月在錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院確診的AD患者36例(表1)，其中內源性AD患者18例、外源性AD患者18例，并招募20例健康人(healthv control,HC)作為對照組。AD患者診斷符合特應性皮炎Williams診斷標準，且要求所有AD患者至少2周前停止服用抗過敏藥物。本研究獲得了錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準，志愿者均簽訂了知情同意書。

表1 志愿者的一般資料Tab.1 General information of the volunteers

1.3研究方法 對每位研究對象采集4 mL外周血，置于含EDTA抗凝劑的采血管中。1 200 r/min離心血液10 min，抽出血漿后補充1640培養(yǎng)基。加入5 μL FITC-CD123、APC-CCR3、APC/Cy7-HLA-DR標記嗜堿性粒細胞，實驗管加入5 μL PE/Cy7-CD63、PE-CD203c和PerCP-FcεRI，同型管加入相應的同型抗體；室溫避光孵育15 min；加入1.5 mL紅細胞裂解液，吹打混合，室溫下避光孵育12 min；1 200 r/min離心6 min，棄去紅色上清液；加入1 mL 1×PBS，混合后再次以1 200 r/min離心6 min，棄去上清液；加入200 μL PBS，使用流式細胞儀檢測，FlowJo軟件分析結果。使用流式細胞術檢測AD患者嗜堿性粒細胞富集群(設門方法見圖1)。

圖1 嗜堿性粒細胞富集群的設門方法Fig.1 Gating strategies of basophil-enriched cells

1.4統(tǒng)計學處理 使用統(tǒng)計軟件SPSS23.0分析數據。本研究數據屬于非正態(tài)計量資料，采用中位數(M)和四分位間距(IQR)表示，使用非參數檢驗Manner-Whitney進行檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，統(tǒng)計學界值為1.96。

2 結果

2.1AD患者外周血嗜堿性粒細胞表達結果 AD患者粒細胞群中嗜堿性粒細胞MFI較健康對照組增加了2.5倍(Z=-6.156，P<0.01，圖2a)，內源性AD組與外源性AD組的嗜堿性粒細胞MFI差異無統(tǒng)計學意義。各型AD患者嗜堿性粒細胞比例與健康組比較差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

MFI expression in granulocyte population of basophils between groups；MFI expression in granulocyte population of CD63+ basophils between groups；Percentage of CD63+ basophils in the mononuclear cell population between groups圖2 各組間嗜堿性粒細胞和CD63+嗜堿性粒細胞在粒細胞群和單個核細胞群中的表達比較Fig.2 Comparison of the expression of basophils and CD63+ basophils in the granulocyte population and the mononuclear cell population between groups

表2 各組嗜堿性粒細胞表達水平比較 [M(IQR)]Tab.2 Comparison of basophil expression levels between groups [M (IQR)]

2.2AD患者外周血CD63+嗜堿性粒細胞表達水平 AD患者粒細胞群中CD63+嗜堿性粒細胞MFI較對照組升高了34%(Z=-2.249，P<0.05，圖2b)，且AD患者單個核細胞群中CD63+嗜堿性粒細胞比例較健康對照組增加了23%(Z=-3.688，P<0.01，圖2c)，不同分型AD患者間CD63+嗜堿性粒細胞的比例和MFI差異均無統(tǒng)計學意義，見表3。

表3 各組CD63+嗜堿性粒細胞比較 [M(IQR)]Tab.3 Comparison of CD63+ basophils between groups [M(IQR)]

2.3AD患者外周血CD203c+嗜堿性粒細胞表達水平 與健康對照組相比，AD患者的CD203c+嗜堿性粒細胞MFI在粒細胞群中升高了23%(Z=-2.112，P<0.05，圖3a)、在單個核細胞群中升高了2%(Z=-2.061，P<0.05，圖3b)，且AD患者外周血粒細胞群中CD203c+嗜堿性粒細胞比例升高了4.8倍(Z=-4.925，P<0.01，圖3c)，但內、外源性AD患者之間在外周血CD203c+嗜堿性粒細胞的比例和MFI上差異均無統(tǒng)計學意義，見表4。

MFI expression in granulocyte population of CD203c+ basophils between groups；Percentage of CD203c+ basophils in the granulocyte population between groups；MFI expression in mononuclear cell population of CD203c+ basophils between groups圖3 各組間CD203c+嗜堿性粒細胞在粒細胞群和單個核細胞群中的表達比較Fig.3 Comparison of the expression of CD203c+ basophils in the granulocyte population and themononuclear cell population between groups

表4 各組CD203c+嗜堿性粒細胞比較 [M(IQR)]Tab.4 Comparison of CD203c+ basophils between groups [M(IQR)]

2.4AD患者外周血FcεRI+嗜堿性粒細胞表達水平 AD患者外周血粒細胞群FcεRI+嗜堿性粒細胞比例較健康對照組升高了6.3倍(Z=-4.694，P<0.01，圖4)，AD及其不同分型FcεRI+嗜堿性粒細胞MFI差異均無統(tǒng)計學意義，且內、外源性AD患者外周血FcεRI+嗜堿性粒細胞比例差異無統(tǒng)計學意義，見表5。

表5 各組FcεRI+嗜堿性粒細胞比較 [M(IQR)]Tab.5 Comparison of FcεRI+ basophils between groups [M(IQR)]

圖4 各組FcεRI+嗜堿性粒細胞在粒細胞群中百分比的流式代表圖Fig.4 Flow cytometric representation of the percentage of FcεRI+ basophils in each group of granulocyte populations

3 討論

特應性皮炎可分為外源性AD和內源性AD兩種類型，其中內源性AD血清IgE水平正常且沒有特異性IgE致敏，外源性AD則表現為血清總IgE水平升高且具有特異性IgE致敏[10]。外源性AD患者常表達高水平的Th2型細胞因子，如IL-4、IL-5和IL-13[11]，并且具有更明顯的嗜酸性粒細胞升高傾向[12]。而內源性AD更傾向于表達高水平的Th17和 Th22 型細胞因子[13]。另外，在血漿氨基酸代謝方面，急性發(fā)作期外源性AD與內源性AD在組氨酸代謝通路上具有顯著差異，具體體現為內源性AD的組氨酸代謝水平低[14]。在本研究中，并未發(fā)現內、外源性AD在外周血嗜堿性粒細胞及其激活物標志上有差異，這提示嗜堿性粒細胞作為過敏反應的初級效應細胞，在內源性AD和外源型AD的發(fā)病過程中都起作用。

目前認為，AD與免疫失衡、皮膚屏障功能紊亂、皮膚菌群異常等因素密切相關。嗜堿性粒細胞在AD的免疫失衡中發(fā)揮重要作用，在特應性皮炎小鼠模型中，IL-4表達水平升高[15]，嗜堿性粒細胞是皮膚中IL-4的初始和主要來源[16-17]，嗜堿性粒細胞來源的IL-4對ILC2的增殖至關重要，它可以誘導ILC2激活和AD樣皮膚炎癥[2]。

CD63和CD203c是目前評估嗜堿性粒細胞活化的常用標志物[18-19]。CD203c和CD63在嗜堿性粒細胞活化早期就可以受到FcεRI介導的反應上調，在嗜堿性粒細胞活化晚期也受細胞因子介導從而發(fā)揮作用[20]。在20世紀90年代早期，CD63的發(fā)現促進了利用流式細胞術監(jiān)測嗜堿性粒細胞的過敏原特異性激活技術的發(fā)展[21]。在嗜堿性粒細胞活化時，處于胞內顆粒中的CD63會隨著胞吐作用高表達于細胞表面，這一特性使CD63可以表示嗜堿性粒細胞脫顆粒。本研究發(fā)現，AD患者外周血嗜堿性粒細胞CD63的表達增強，這提示嗜堿性粒細胞脫顆粒參與了AD發(fā)病。在血細胞中，CD203c只在嗜堿性粒細胞上恒定表達，這使它可以作為嗜堿性粒細胞的激活標記物。本研究發(fā)現，AD患者CD203c+嗜堿性粒細胞的表達上調，與Wang等[22]的研究結果一致，進一步驗證了激活的嗜堿性粒細胞參與AD發(fā)病這一假設。FcεRI在肥大細胞和嗜堿性粒細胞上表達，受到抗原刺激時，細胞表面的FcεRI會與IgE交聯形成復合物導致細胞活化[23]，可作為細胞致敏的標記物，已有研究[24]發(fā)現表現出特應性的慢性蕁麻疹患者其FcεRI水平顯著升高。本研究觀察到，AD患者FcεRI+嗜堿性粒細胞比例較健康對照升高，提示處于致敏狀態(tài)的嗜堿性粒細胞在AD發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。

總之，AD發(fā)病原因復雜，本研究發(fā)現AD嗜堿性粒細胞及其表面CD63、CD203c和FcεRI表達上調，提示活化的嗜堿性粒細胞及其表面CD63、CD203c和FcεRI參與AD的進程，檢測嗜堿性粒細胞及其相關分子對診斷AD具有一定意義，未來可考慮研發(fā)嗜堿性粒細胞活化的阻斷劑從而治療AD。