王小虎，賀愉嵐，朱綺霞，周禮芹*

1.廣西科學(xué)院，廣西 南寧 530007；2.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004

凌云白毫茶屬有性系繁殖品種，樹型比較高大，樹姿直立、分枝較稀，略加修剪，形如傘狀[1]。其芽葉肥壯，持嫩性好，制得凌云白毫茶以色翠、毫多、香醇、味濃、耐泡五大特色成為我國名茶中的新秀[2]，加之具有助消化、降血壓、抗衰老等保健功效，深得消費(fèi)者青睞，故以凌云白毫茶鮮葉原料所制茶葉在國內(nèi)外獲得多項(xiàng)殊榮[3]。此外，凌云白毫茶是廣西特有的國家級優(yōu)良茶樹品種[4]。

如今，栽培的凌云白毫茶采用種子進(jìn)行繁殖，但由于各地凌云白毫茶園逐漸混雜大葉青等外來品種，故出現(xiàn)了多個(gè)性狀混雜的品系，導(dǎo)致雜交后代性狀不純，影響制成品的一致性[5]。鮮葉的質(zhì)量直接決定了成品的品質(zhì)，因此建立凌云白毫茶鮮葉品質(zhì)的快速檢測方法有助于凌云白毫茶成品品質(zhì)提高，促進(jìn)桂茶產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。有研究表明，利用傅里葉變換紅外光譜，結(jié)合主成分分析法（PCA）以及聚類分析法可以對不同茶葉進(jìn)行鑒定，并取得了較為滿意的成果[6-11]。

本文利用傅里葉變換紅外光譜對廣西凌云不同地域的白毫茶進(jìn)行紅外光譜測定，根據(jù)相應(yīng)的特征吸收峰，并通過PCA 以及聚類分析，將不同產(chǎn)地的凌云白毫茶鮮葉進(jìn)行區(qū)分，克服了傳統(tǒng)分析方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力的弊端，同時(shí)可為茶葉的品質(zhì)評價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集不同地域的凌云白毫野生古茶樹和栽培型古茶園中的一芽一葉后，再分單芽和單葉（芽下等一葉）分別進(jìn)行測試分析。

試驗(yàn)材料分別采集自白馬村野生古茶樹（aa）、岑王老山栽培古茶園（ba）、大楞野生古茶樹（ca）、風(fēng)香坪野生古茶樹（da）、國營栽培古茶園（ea）、浪伏栽培古茶園（fa）、先鋒嶺野生古茶樹（ga）、小毛坪野生古茶樹（ha）、玉洪栽培古茶園（ia）。

1.2 儀器設(shè)備和測試條件

紅外光譜儀為Thermo Scientific 公司Nicolet iS10 型傅立葉變換紅外光譜、Millipore 超純水儀器、SPS402 電子天平、高速粉碎機(jī)。光譜范圍為400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)為32次。

1.3 樣品處理

將采集的鮮葉樣品，經(jīng)冷藏送往實(shí)驗(yàn)室。將樣品烘干，分別取單芽或單葉進(jìn)行磨碎，過80 目篩，取適量干燥的茶粉，隨后置于傅立葉變換紅外光譜儀進(jìn)行光譜信息的采集。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用OMNIC 9.0 將采集的紅外光譜信息進(jìn)行自動(dòng)基線校準(zhǔn)、平滑、頻率標(biāo)準(zhǔn)化，保存為SPA和CSⅤ格式。將處理后的單芽或單葉的SPA 格式光譜圖整合進(jìn)行原始紅外光譜分析，根據(jù)能夠指示茶多酚、蛋白質(zhì)、咖啡堿、多糖等影響茶葉品質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)，將處理后的單芽和單葉的CSⅤ格式數(shù)據(jù)選取波峰差異最大區(qū)域750～2 000 cm-1和2 750～3 850 cm-1，利用PAST 3.0軟件進(jìn)行PCA分析以及聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始紅外光譜分析

2.1.1 9種凌云白毫茶單芽、單葉紅外光譜圖分析

從9種不同地域采集的凌云白毫茶單芽的紅外光譜圖（圖1）可以看出，雖然野生和栽培的凌云白毫茶單芽在波形上非常相似，但仍然存在很大差距，如栽培古茶園fa和ia在3 373 cm-1附近呈現(xiàn)1個(gè)巨大但不尖銳的吸收峰，在1 633 cm-1附近呈現(xiàn)1個(gè)大而尖銳的吸收峰，而其他幾種卻與之不同。

圖1 9種凌云白毫茶單芽光譜的比對分析

從9種不同地域采集的凌云白毫茶鮮葉單葉的紅外光譜圖（圖2）同樣可見，前4 種為栽培的凌云白毫茶，后5種為野生的凌云白毫茶，從圖2可以看出，栽培的凌云白毫茶單葉，fa和ia與其他幾種茶樹單葉存在顯著差異，其在3 380 cm-1附近有1個(gè)非常明顯的吸收峰，在1 631 cm-1處有1 個(gè)尖銳的吸收峰，且在1 030 cm-1附近不形成尖銳的吸收峰，此外，ia在2 913 cm-1和2 842 cm-1處的吸收峰更明顯；其他兩種栽培的凌云白毫茶單葉在2 900 cm-1和2 800 cm-1處的吸收峰相比野生茶都比較小，在1 030 cm-1附近，ba 出現(xiàn)1 個(gè)尖銳的吸收峰，但ea在此處的吸收峰卻非常平緩，其他5種野生白毫茶的吸收峰介于這兩種栽培的白毫茶之間。

圖2 9種凌云白毫茶單葉光譜比對分析

2.1.2 9 種凌云白毫茶單芽和單葉的特征峰及其峰位歸屬

根據(jù)不同地域的凌云白毫茶單芽和單葉的紅外光譜部分特征峰及其峰位歸屬，將紅外光譜范圍分為5個(gè)區(qū)域并對9種凌云白毫茶鮮葉的吸收峰進(jìn)行分析。

I區(qū)（2 800～3 700 cm-1）：3 200～3 400 cm-1波數(shù)處寬大的吸收峰為-OH 伸縮振動(dòng)吸收峰[12]，2 900 cm-1、2 850 cm-1附近為茶多酚-CH 的反對稱與對稱伸縮振動(dòng)峰。

Ⅱ區(qū)（1 500～1 700 cm-1）：1 730 cm-1附近為茶多酚、茶多糖、茶蛋白中C=O 伸縮振動(dòng)吸收峰；1 630 cm-1附近為蛋白質(zhì)中肽鍵（-CONH-）的酰胺I帶，即C=O伸縮振動(dòng)峰[13]；1 510～1 550 cm-1為蛋白質(zhì)肽鍵酰胺Ⅱ帶，即N-H的彎曲振動(dòng)和C-N-H 基的C-N伸縮振動(dòng)的偶合峰。

Ⅲ區(qū)（1 200～1 500 cm-1）：1 452 cm-1附近吸收峰為羧酸類或酯類物質(zhì)的特征吸收峰，可能包含C-H彎曲振動(dòng)吸收以及C-O伸縮振動(dòng)；1 370 cm-1附近為C-H 變形振動(dòng)吸收峰，1 200～1 300 cm-1附近的譜帶為酚類C-O以及咖啡堿和蛋白質(zhì)中C-N伸縮振動(dòng)峰；1 236 cm-1附近的吸收峰歸屬為酰胺Ⅲ帶中C-O伸縮振動(dòng)吸收峰[14]。

Ⅳ區(qū)（1 000～1 200 cm-1）：為多糖的特征光譜區(qū)，1 147 cm-1附近為C-O-C 反對稱伸縮振動(dòng)峰，1 037 cm-1附近為C-O-C對稱伸縮振動(dòng)峰。

Ⅴ區(qū)（400～900 cm-1）：750～900 cm-1為多糖特征譜。

由以上分析可知，9種凌云白毫茶鮮葉均含有茶多酚、蛋白質(zhì)、咖啡堿、多糖等影響茶葉品質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)，但光譜圖中吸收峰的大小不同，故不同地域的凌云白毫茶鮮葉品質(zhì)成分有所差異。

2.2 PCA分析凌云白毫古茶樹光譜數(shù)據(jù)

主成分分析是將多個(gè)變量通過線性變換以選出較少個(gè)數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法，能將各組樣本光譜數(shù)據(jù)之間的差異降維至PC1 和PC2兩個(gè)維度上[15]，用于減少數(shù)據(jù)集的維數(shù)，同時(shí)保持?jǐn)?shù)據(jù)中對方差貢獻(xiàn)最大的特征，達(dá)到簡化數(shù)據(jù)的目的，并以圖形的方式直觀地給出數(shù)據(jù)的分布散點(diǎn)圖，可對不同種群之間關(guān)系遠(yuǎn)近進(jìn)行判斷，也可以考察不同樣本間的相似性[16]。本文利用PAST 3.0軟件對來自9個(gè)不同地域的凌云白毫茶單芽和單葉共18 種樣品進(jìn)行主成分分析，根據(jù)主成分分析得到的主成分得分能較好地代表茶葉信息的主成分?jǐn)?shù)。圖3和圖4分別代表凌云白毫茶單芽和凌云白毫茶單葉的主成分分析。

圖3 9種凌云白毫茶單芽PCA分析圖

圖4 9種凌云白毫茶單葉PCA分析圖

由圖3 可知，栽培古茶園fa、ia 均處于第一象限，距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)，并且兩者相距很遠(yuǎn)；野生古茶樹ha、ca 處于第四象限，距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)，并且兩者相距很遠(yuǎn)；野生古茶樹ga 位于第三象限；國營茶廠栽培古茶園ea、白馬村古茶樹aa、岑王老山栽培古茶園ba、風(fēng)香坪野生古茶樹da 處于第二象限，它們的距離相對集中。其中主成分1的貢獻(xiàn)率為61.483%，主成分2 的貢獻(xiàn)率為35.508%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為96.991%，說明以主成分1 和主成分2為代表進(jìn)行主成分分析是真實(shí)可靠的。

由圖4可知，栽培古茶園fa處于第一象限，且距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)；栽培古茶園ia處于第四象限，距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)；野生古茶樹da、aa、ca 處于第二象限，它們的相對位置分散，容易區(qū)分；栽培古茶園ea、ba 和野生古茶樹ga、ha 處于第三象限，它們所處的位置相對比較分散，到原點(diǎn)的距離明顯不同。其中主成分1 的貢獻(xiàn)率為92.812%，主成分2的貢獻(xiàn)率為5.677%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為98.489%，說明以兩者為代表進(jìn)行主成分分析是真實(shí)可靠的。

總體來說，利用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)結(jié)合PCA 分析技術(shù)，根據(jù)分析結(jié)果所處的象限以及距離原點(diǎn)距離的不同，可以快速地將不同地域的凌云白毫茶鮮葉進(jìn)行區(qū)分，說明了這種技術(shù)能夠快速應(yīng)用于古茶樹鮮葉檢測。

2.3 系統(tǒng)聚類分析

系統(tǒng)聚類分析是一種無監(jiān)督模式識別分類法，它能對研究對象的特征進(jìn)行分析，從而對其進(jìn)行分類。它主要是根據(jù)類和類間的距離來定義各樣品之間的相近性，然后以類間距為依據(jù)從小到大進(jìn)行聚類。圖5、圖6 分別是凌云白毫茶單芽和凌云白毫葉茶單葉的聚類分析結(jié)果。

圖5 凌云白毫茶單芽聚類分析

圖6 凌云白毫茶單葉聚類分析

從圖5 可以看出，當(dāng)距離為0.4 時(shí)，aa、ba、da、ea 便已經(jīng)聚為一類；當(dāng)距離為0.8 時(shí)，ha、ca已經(jīng)聚為一類；當(dāng)距離為1.2時(shí)，ha、ca與ga聚為一類，fa 與ia 聚為一類；當(dāng)距離為2.0 時(shí)，aa、ba、da、ea、ha、ca、ga 聚為一類；當(dāng)距離為2.7時(shí)，所有的單芽均聚為一類。

從圖6 可知，當(dāng)距離為0.4 時(shí)，aa、da、ha 聚為一類，ea、ga 也聚為一類；當(dāng)距離為1.0 時(shí)，fa和ia聚為一類，其他7種鮮葉聚為一類；當(dāng)距離為3.7左右時(shí)，所有的鮮葉均聚為一類。

3 小結(jié)與討論

對9個(gè)不同地域的凌云白毫茶單芽和單葉的原始紅外光譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)栽培型的浪伏和玉洪2個(gè)古茶園鮮葉在波形、吸收峰上與其他幾個(gè)茶園存在顯著差異，可能原因是栽培型凌云白毫茶鮮葉中化學(xué)物質(zhì)含量有所不同。栽培型茶園中岑王老山古茶園和國營茶廠古茶園采集的樣品在2 900 cm-1和2 800 cm-1兩處的吸收峰相比野生茶都比較小，而且在1 030 cm-1附近；岑王老山古茶園樣品出現(xiàn)一個(gè)尖銳的吸收峰，但國營茶廠古茶園樣品的吸收峰卻非常平緩，而其他5種野生白毫茶的吸收峰介于這兩種栽培的白毫茶之間。

利用PCA 對凌云白毫茶單芽進(jìn)行分析時(shí)，可以明顯地看出浪伏、玉洪2個(gè)栽培古茶園均處于第一象限；小毛坪、大楞2個(gè)野生古茶樹處于第四象限，存在明顯的差異。對單葉進(jìn)行分析時(shí)，風(fēng)香坪、白馬村、大楞3 個(gè)野生古茶樹處于第二象限；國營茶廠栽培古茶園、岑王老山栽培古茶園、先鋒嶺野生古茶樹、小毛坪野生古茶樹處于第三象限，根據(jù)所處的象限也可以將其區(qū)分出來。

對凌云白毫茶單芽進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)距離為1.2 時(shí)，小毛坪、大楞、先鋒嶺3 個(gè)野生古茶樹聚為一類，浪伏、玉洪兩個(gè)栽培古茶園聚為一類。對凌云白毫茶單葉進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)距離為0.4 時(shí)，白馬村、風(fēng)香坪、小毛坪3 個(gè)古茶樹聚為一類。

總而言之，運(yùn)用傅立葉變換紅外光譜、主成分分析法以及聚類分析法可以快速、無損地測定野生和栽培的凌云白毫茶鮮葉之間的差異，并能快速地將它們進(jìn)行分類。由于這幾種方法具有專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、靈敏度高等特點(diǎn)，故利用這幾種方法對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可作為快速、準(zhǔn)確、高效檢測凌云白毫茶古茶樹鮮葉的手段。