穆小婷，廖偵成*，凌彩金，鄭溪，林建勇，何建平，江麗冰

1.清遠(yuǎn)市農(nóng)業(yè)科技推廣服務(wù)中心（清遠(yuǎn)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所），廣東 清遠(yuǎn) 511500；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所廣東省茶樹(shù)資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640

種質(zhì)資源的研究和開(kāi)發(fā)是茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要基礎(chǔ)。目前，茶樹(shù)種質(zhì)資源研究主要集中在遺傳多樣性[1-2]、生化成分多樣性[3-5]、形態(tài)多樣性或表型多樣性[6-8]、根系土壤微生物群落多樣性[9-11]、抗性研究[12]等方面，遺傳多樣性分析主要從分子水平上對(duì)茶樹(shù)資源進(jìn)行研究，包括SSR[13-14]、ISSR[15-17]、RAPD[18]、SRAP[19]、AFLP[20-21]、SRAP[22-23]、SNP[24]等分析方法。其中，SSR分子標(biāo)記技術(shù)作為一種以特定引物的PCR 擴(kuò)增為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的第二代分子標(biāo)記技術(shù)，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性遺傳、操作簡(jiǎn)單快速、數(shù)量豐富等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于茶樹(shù)的遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系分析[25-27]。

清遠(yuǎn)市位于粵北山區(qū)，境內(nèi)野生茶樹(shù)資源豐富，種類繁多，品質(zhì)各異。通過(guò)對(duì)清遠(yuǎn)本土野生茶樹(shù)資源的野外調(diào)查和資源采集，對(duì)清遠(yuǎn)8 個(gè)縣（市、區(qū)）的55份代表性野生茶樹(shù)資源葉片樣品進(jìn)行了SSR 位點(diǎn)多態(tài)性分析、群體遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系分析，并對(duì)不同來(lái)源地的樣品進(jìn)行了遺傳一致度和遺傳距離分析，綜合分析了清遠(yuǎn)野生茶樹(shù)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系情況，可為進(jìn)一步開(kāi)展本土茶樹(shù)種質(zhì)資源的研究和開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料

研究所用茶樹(shù)資源樣品來(lái)源于廣東省清遠(yuǎn)市的清城區(qū)、清新區(qū)、英德市、連州市、佛岡縣、連山縣、連南縣、陽(yáng)山縣等8 個(gè)縣（市、區(qū)），樣品共55份，對(duì)應(yīng)編號(hào)見(jiàn)表1，資源均為當(dāng)?shù)乇就练敝车拇硇砸吧铇?shù)，包括自然野生茶樹(shù)和本土茶樹(shù)種子繁殖的老茶樹(shù)，茶樹(shù)葉片有大葉、中葉和小葉等，葉片色澤以綠色和深綠色為主，部分葉片有紫色、紫紅色或黃綠色，當(dāng)?shù)刂饕谱骶G茶、紅茶。樣品采集方法為隨機(jī)采摘茶樹(shù)芽下第三至第五片葉，每份資源采集10 片以上完整、無(wú)病蟲(chóng)害、長(zhǎng)勢(shì)正常的葉片樣品，采下后擦拭干凈，放入樣品袋并登記編號(hào)，立即用液氮或干冰速凍，并及時(shí)運(yùn)送至－80 ℃冰箱中保存。在野外調(diào)查中如不能及時(shí)對(duì)葉片進(jìn)行低溫保存，則先剪取茶樹(shù)枝條，將枝條剪口浸泡在盛有清水的瓶中，或用有濕布的袋子包好，或?qū)⒅l切口直接插入新鮮蘿卜中，保持葉片新鮮，并及時(shí)帶回有條件保存的地方。帶回后立即采集葉片放入樣品袋，登記編號(hào)，置于－80 ℃冰箱中保存。對(duì)保存的樣品及時(shí)開(kāi)展提取和分析。

表1 55份茶樹(shù)種質(zhì)資源樣品來(lái)源及對(duì)應(yīng)編號(hào)

1.2 研究方法

SSR 分析主要包括樣品基因組DNA 提取、SSR 引物篩選及引物PCR 擴(kuò)增、電泳檢測(cè)、數(shù)據(jù)分析等步驟。

1.2.1 基因組DNA的提取

采用由生工生物工程（上海）股份有限公司提供的Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒對(duì)55份茶樹(shù)材料DNA 進(jìn)行提取，利用柱式植物基因組DNA 抽提試劑盒，通過(guò)Buffer PCR 裂解茶樹(shù)葉片樣品，釋放出基因組DNA，采用特殊吸附膜選擇性吸附核酸分子，去除其他雜質(zhì)，得到高質(zhì)量的基因組DNA，提取后及時(shí)放入－20 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR引物的篩選

SSR引物的篩選由生工生物工程（上海）股份有限公司負(fù)責(zé)，經(jīng)篩選，選用TM241、TM262、TM341、TM345、TM369、TM442、TM426、TM428、TM440、TM442、TM447、TM461、TM499、TM513、TM569、TM601 共計(jì)16 對(duì)SSR引物，引物序列信息見(jiàn)表2。

表2 16對(duì)多態(tài)性引物序列信息

1.2.3 SSR-PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)

主要操作步驟包括：（1）取96 孔反應(yīng)板，用記號(hào)筆標(biāo)明板名、試驗(yàn)日期。（2）制作電子版SSR檢測(cè)表，并自動(dòng)生成上機(jī)表。（3）使用連續(xù)加樣器，吸取990 μL HIDI 和10 μL LIZ500 的混合物，加入到96 孔反應(yīng)板中，每孔10 μL。（4）將96 孔板置于平板離心機(jī)中，用1 200 r/min 離心15 s。（5）使用12 排10 μL 排槍，對(duì)照SSR 檢測(cè)表，在96 孔板對(duì)應(yīng)的孔中加入1 μL樣品。（6）將96 孔板置于平板離心機(jī)中，1 200 r/min 離心15 s。（7）使用封板膜密封96孔板，振蕩，將96孔板置于平板離心機(jī)中，1 200 r/min 離心30 s，置于PCR 儀。（8）變性。變性程序?yàn)闇囟?8 ℃，時(shí)間5 min。變性程序結(jié)束后立即將96 孔板置于冰水混合物上急速冷卻。（9）將96 孔板置于平板離心機(jī)中，用1 200 r/min離心15 s。（10）使用3730 ⅩL測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)SSR 樣本。PCR 反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件見(jiàn)表3、表4。

表3 SSR-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系

表4 SSR-PCR擴(kuò)增條件

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用Gnemapper v4.0軟件進(jìn)行序列分析，通過(guò)PopGen32 軟件計(jì)算觀測(cè)等位基因（Na）、有效等位基因（Ne）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）、Shannon多樣性指數(shù)（I）、遺傳分化系數(shù)（Fst）、基因流（Nm）等指標(biāo)，用MEGA 5.1軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR位點(diǎn)多態(tài)性分析

通過(guò)16 對(duì)SSR 引物對(duì)8 個(gè)縣（市、區(qū)）共55份樣品進(jìn)行位點(diǎn)多態(tài)性分析（表5），16 對(duì)SSR 引物共擴(kuò)增出189 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，每對(duì)引物為3～20個(gè)，平均每對(duì)引物11.812 5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。

表5 16對(duì)SSR引物的遺傳多樣性參數(shù)

Ne 是反映群體遺傳變異大小的指標(biāo)，其數(shù)值越接近Na 的絕對(duì)數(shù)，表明該等位基因在群體中分布越均勻；Ne和Na差異越大，說(shuō)明等位基因在群體中分布越不均勻。16對(duì)SSR引物的Ne值范圍為1.100 1～11.237 0，均值為5.826 4。

PIC 是評(píng)價(jià)引物位點(diǎn)多態(tài)性的重要指標(biāo)，當(dāng)PIC＞0.50 時(shí)，表明該位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn)；當(dāng)0.25＜PIC≤0.50 時(shí)，表明該位點(diǎn)為中度多態(tài)位點(diǎn)，當(dāng)PIC≤0.25時(shí)，表明該位點(diǎn)為低度多態(tài)位點(diǎn)。

16對(duì)引物的PIC值范圍為0.305 5～0.904 2，均值為0.698 7，其中有13 對(duì)引物的PIC 值大于0.50，說(shuō)明引物絕大多數(shù)為高度多態(tài)性SSR標(biāo)記。

2.2 群體遺傳多樣性分析

Ho 指隨機(jī)抽取的兩個(gè)樣本等位基因不相同的概率；He指理論計(jì)算得出的雜合度，He的范圍從0（說(shuō)明無(wú)多態(tài)性）到1（說(shuō)明無(wú)限多個(gè)等位基因具有相同的頻率，是個(gè)極限值）。一般常用He來(lái)衡量群體的遺傳多樣性高低，He 越高，反映群體的遺傳一致性越低，其遺傳多樣性越豐富。Ho 小于He，說(shuō)明位點(diǎn)純合子偏多；Ho大于He，說(shuō)明位點(diǎn)雜合子偏多；Ho 等于He，說(shuō)明位點(diǎn)處于平衡狀態(tài)。由表5 可知，16 對(duì)SSR 引物Ho 為0.056 6～0.836 4，均值為0.539 1；He 為0.091 8～0.919 5，均值為0.723 8，且16 對(duì)引物中，有12 對(duì)的He 均在平均值以上，說(shuō)明55 份資源的遺傳多樣性豐富；但是，Ho 平均值明顯低于He 平均值，且16對(duì)引物的Ho均低于He，說(shuō)明幾乎所有位點(diǎn)都出現(xiàn)了純合子偏多的現(xiàn)象，這可能是因?yàn)樵谇暹h(yuǎn)境內(nèi)屬小群體分布模式，容易引起近交，從而導(dǎo)致群體內(nèi)純合子數(shù)量增加。

I也叫香農(nóng)指數(shù)，是比He更能反映遺傳多樣性程度的指標(biāo)，I 越大，表明群體離散度越高，遺傳多樣性越豐富。16對(duì)SSR引物I值0.221 8～2.635 6，均值為1.796 8，其中，有8對(duì)引物的I大于2.0，進(jìn)一步說(shuō)明55份資源的遺傳多樣性比較豐富。

遺傳分化是指遺傳多樣性在群體內(nèi)和群體間的分布，F(xiàn)st代表不同群體間的遺傳分化水平，F(xiàn)st值在0～1 之間。一般來(lái)說(shuō)，F(xiàn)st 值小于0.05，說(shuō)明物種群體間的遺傳分化水平很低；Fst 值在0.05～0.15之間，說(shuō)明群體間的遺傳分化水平處于中等程度；Fst 值在0.15～0.25 之間，說(shuō)明群體間的遺傳分化水平處于中等偏高的程度；當(dāng)Fst 值大于0.25，說(shuō)明群體間的遺傳分化水平處于較高程度。55個(gè)樣品的Fst平均值為0.128 8，說(shuō)明55份清遠(yuǎn)野生茶樹(shù)資源的遺傳分化水平中等，同時(shí)也說(shuō)明有87.12%的遺傳分化來(lái)自群體內(nèi)，12.88%的遺傳分化來(lái)自群體間。

Nm是指生物個(gè)體從其發(fā)生地分散出去而導(dǎo)致不同種群之間基因交流的過(guò)程，可發(fā)生在同種或不同種的生物種群之間。基因的交流會(huì)削弱種群間的遺傳差異，是影響種群遺傳結(jié)構(gòu)的重要因子。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)Nm＞1時(shí)，表明群體間的Nm水平較高，能足以防止遺傳漂變導(dǎo)致種群遺傳分化的發(fā)生；Nm＜1，則表明是由遺傳漂變導(dǎo)致群體間的遺傳分化。55個(gè)樣品的Nm平均值為1.917 0，說(shuō)明55份資源群體間的Nm水平較高，遺傳分化不是由遺傳漂變產(chǎn)生的。

2.3 群體親緣關(guān)系分析

不同種質(zhì)資源的親緣關(guān)系與其遺傳背景有直接關(guān)系，遺傳背景越近，則相似程度就越高。根據(jù)SSR標(biāo)記計(jì)算55份樣品的遺傳相似系數(shù)介于0～0.834 1之間，遺傳距離介于0～3.827 7之間，通過(guò)MEGA 5.1軟件對(duì)55個(gè)樣品進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，以遺傳距離0.53為閾值，55份茶樹(shù)資源被聚為7個(gè)類群，其中，第一類群共30 份種質(zhì)資源，第二類群共6份資源，第三類群共10份資源，第四類群共1份資源，第五類群共1份資源，第六類群共6份資源，第七類群共1 份資源。以遺傳距離0.40 為閾值，第一類群又可以分為4個(gè)亞群，第二類群和第三類群也分別分為3個(gè)亞群。另外，從樣品來(lái)源地角度分析，英德市的4個(gè)樣品聚類在一起，說(shuō)明英德市的4 個(gè)樣品親緣關(guān)系近；連南縣12 個(gè)樣品在遺傳距離為0.50 處主要分為兩大類群，其中序號(hào)25、26、29、30、31 聚類在一起，序號(hào)21、22、23、24 聚類在一起，其余幾個(gè)樣品沒(méi)有形成明顯聚類；其他6 個(gè)縣（市、區(qū)）的樣品，整體來(lái)看，尚未發(fā)現(xiàn)明顯聚類（圖1）。

圖1 55個(gè)樣本Nei's遺傳距離聚類分析樹(shù)狀圖

2.4 各縣（市、區(qū)）樣品遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系分析

2.4.1 各縣（市、區(qū)）樣品遺傳多樣性分析

遺傳多樣性對(duì)于種群或物種的長(zhǎng)期存活及凈化潛力至關(guān)重要，分析物種遺傳多樣性的空間分布有助于識(shí)別不同的遺傳群體。由表6 可以看出，以I 值計(jì)，清新區(qū)的遺傳多樣性指數(shù)最高，I 值為1.548 2，He值也最高（0.741 5）；陽(yáng)山縣（1.471 4）排名第二，清城區(qū)（1.374 6）排名第三，對(duì)應(yīng)He也排名前列；英德市的遺傳多樣性水平最低，I、He值也在8個(gè)縣（市、區(qū)）中最低，分別為0.994 1、0.598 2。

Hardy-Weinberg 遺傳偏離指數(shù)D（Ho－He）主要反映Ho 和He 之間的平衡關(guān)系，D 值越接近0，基因型分布就越接近于平衡狀態(tài)，D 值大于0，說(shuō)明存在雜合子過(guò)剩；D 值小于0，說(shuō)明存在雜合子缺失現(xiàn)象。由表6 可以看出，8 個(gè)縣（市、區(qū)）的群體Ho 均小于He，說(shuō)明均表現(xiàn)出雜合子缺失、純合子偏多的現(xiàn)象。其中，英德市的遺傳偏離指數(shù)D為－0.0513，最接近于平衡狀態(tài)。陽(yáng)山縣的遺傳偏離指數(shù)D為－0.2349，最遠(yuǎn)離平衡狀態(tài)，純合子最多，近交程度也最高。

表6 各縣（市、區(qū)）遺傳多樣性分析

2.4.2 各縣（市、區(qū)）樣品一致度和遺傳距離分析

遺傳一致度越高，表明供試茶樹(shù)品種間遺傳距離越近，親緣關(guān)系越近。通過(guò)對(duì)8 個(gè)不同來(lái)源地，即8個(gè)縣（市、區(qū)）樣品遺傳一致度和遺傳距離分析，結(jié)果（表7）顯示，8 個(gè)群體的遺傳一致度范圍為0.554 3～0.842 7，遺傳距離范圍為0.171 1～0.590 0。陽(yáng)山縣和清城區(qū)群體間遺傳一致度最大（0.842 7），遺傳距離最?。?.171 1），說(shuō)明陽(yáng)山縣和清城區(qū)2個(gè)群體的遺傳背景較相似，親緣關(guān)系較近；清新區(qū)和連南縣的遺傳一致度次之（0.836 4）；而連南縣和英德市的遺傳一致度最小（0.554 3），遺傳距離最大（0.590 0），說(shuō)明連南縣和英德市材料的遺傳背景有較大差異，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。總體來(lái)說(shuō)，8 個(gè)縣（市、區(qū)）樣品的遺傳一致度都在0.55以上，遺傳分化程度較低。

表7 不同來(lái)源地材料遺傳一致度（對(duì)角線以上）和遺傳距離（對(duì)角線以下）

此外，從群體聚類分析樹(shù)狀圖（圖2）也可以看出，在遺傳距離為0.20處，8個(gè)縣（市、區(qū)）的樣品可聚類為兩大類，其中群體5（英德市）單獨(dú)聚類，其余群體聚類在一起，說(shuō)明英德市群體與其余群體的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；而在遺傳距離為0.1 處，陽(yáng)山縣和清城區(qū)聚類在一起，清新區(qū)和連南縣聚類在一起，其余4個(gè)縣（市、區(qū)）分別聚類，這和表7中關(guān)于遺傳相似系數(shù)和遺傳距離的分析一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了各縣（市、區(qū)）的親緣關(guān)系情況。

圖2 各縣（市、區(qū)）Nei's遺傳距離聚類分析樹(shù)狀圖

3 小結(jié)與討論

茶樹(shù)資源是茶樹(shù)品種創(chuàng)新和新品種選育開(kāi)發(fā)的重要基礎(chǔ)，對(duì)實(shí)現(xiàn)茶葉優(yōu)質(zhì)高效發(fā)揮著重要作用[28]，遺傳多樣性作為生物所攜帶遺傳信息的總和，對(duì)分析重要性狀和輔助育種起著不可替代的作用[29-30]，因此，通過(guò)遺傳多樣性分析對(duì)茶樹(shù)種質(zhì)資源及遺傳育種進(jìn)行研究，越來(lái)越受到廣大學(xué)者的關(guān)注。本研究的55 份清遠(yuǎn)野生茶樹(shù)種質(zhì)資源的Ho 平均值為0.539 1、He 平均值為為0.723 8、I 平均值為1.796 8、PIC平均值為0.698 7，一定程度說(shuō)明清遠(yuǎn)種質(zhì)資源的遺傳多樣性比較豐富[31-32]；55份資源的Fst 為0.128 8、Nm 為1.917 0，說(shuō)明群體間存在一定的遺傳分化，但遺傳分化不是由遺傳漂變引起，可能與不同來(lái)源地海拔高度或地域差距所處各種生態(tài)因子（如氣候、溫度、土壤等）的差異性有關(guān)。

通過(guò)聚類分析，55 份茶樹(shù)資源可聚為7 個(gè)類群，其中，來(lái)自陽(yáng)山縣的資源19 號(hào)、來(lái)自佛岡縣的資源49號(hào)、來(lái)自連州市的資源37號(hào)分別單獨(dú)聚類，可作為進(jìn)一步分析的目標(biāo)樹(shù)種。本研究中，來(lái)自8 個(gè)縣（市、區(qū)）的55 份茶樹(shù)種質(zhì)資源在遺傳水平上的分類結(jié)果與其資源來(lái)源地分類結(jié)果并不完全一致，分析可能是清遠(yuǎn)本土茶樹(shù)資源在清遠(yuǎn)市域內(nèi)自然雜交和引種頻繁，導(dǎo)致區(qū)域內(nèi)部茶樹(shù)群體種相互混雜。從分布地域來(lái)看，清新區(qū)的遺傳多樣性水平最高，陽(yáng)山縣次之，英德市最低；8 個(gè)縣（市、區(qū)）的Ho 均小于He，即存在純合子偏多的現(xiàn)象，其中英德市最接近于平衡狀態(tài)，陽(yáng)山縣最遠(yuǎn)離平衡狀態(tài)。同時(shí)，清新區(qū)、陽(yáng)山縣的遺傳多樣性水平相對(duì)豐富，具有足夠的更新能力，但陽(yáng)山縣的近交程度最高，這也說(shuō)明，部分群體可能具有較高的遺傳多樣性，但由于近交增加，可能導(dǎo)致群體衰退，所以，可以考慮創(chuàng)造更多的條件使群體內(nèi)充分異交，以維持群體較高的遺傳多樣性。英德市的近交程度最低，但遺傳多樣性水平也最低，因此，也可以考慮創(chuàng)造條件增加群體異交，以提高群體遺傳多樣性?？傮w來(lái)說(shuō)，清遠(yuǎn)野生茶樹(shù)資源間的遺傳差異較大，遺傳基礎(chǔ)較寬，具有比較豐富的遺傳多樣性。這為今后進(jìn)一步挖掘、利用清遠(yuǎn)野生茶樹(shù)種質(zhì)資源，篩選培育茶樹(shù)新品種，開(kāi)發(fā)茶葉新產(chǎn)品提供參考。