張惠芳，張婉瑩，周索，周業(yè)皓，譚瑩，孫君珂，柯濤*，胡凡

（1.南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南省生物質(zhì)資源化高校工程中心，河南南陽 473000）

（2.賒店老酒股份有限公司，河南南陽 473000）

（3.自然資源部第三海洋研究所海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心，福建廈門 361005）

濃香型白酒中己酸乙酯的含量要遠(yuǎn)比其他香型白酒中含量高，是濃香型白酒區(qū)別于其他香型白酒的主體香成分[1,2]。窖泥己酸菌（以下簡(jiǎn)稱己酸菌）是以醇、乳酸、葡萄糖、D-半乳糖等為碳源，發(fā)酵積累己酸的微生物的統(tǒng)稱，是關(guān)鍵性功能菌，在己酸或己酸乙酯的積累過程中起著決定性作用。通過發(fā)酵體系中微生物酶的催化作用使己酸與乙醇縮合生成己酸乙酯，這是濃香型酒窖內(nèi)發(fā)酵的主要生香途徑[3]。在這一途徑中，己酸是形成己酸乙酯的前體物質(zhì)，而己酸菌是窖泥中產(chǎn)生己酸的土壤細(xì)菌，因此篩選培養(yǎng)己酸菌是濃香型白酒生產(chǎn)中關(guān)鍵一環(huán)[4-7]。目前文獻(xiàn)中已報(bào)道的己酸菌主要來自于梭菌綱梭菌屬等菌屬，近年來研究發(fā)現(xiàn)有越來越多的菌屬也可以產(chǎn)己酸，多種不同菌屬的菌群可能有共生或者互生的關(guān)系[8-15]。董蔚等[16]考察濃香型基酒中負(fù)責(zé)“烤香”和“窖香”的關(guān)鍵香氣化合物及其交互作用，結(jié)果表明，己酸、丁酸、4-甲基苯酚、3-甲基吲哚和3-甲硫基丙醛5種香氣化合物為負(fù)責(zé)“窖香”和“烤香”的關(guān)鍵香氣化合物，證明在濃香型基酒中負(fù)責(zé)“烤香”與“窖香”的關(guān)鍵化合物間存在掩蓋或加成作用。因此制作人工窖泥過程中應(yīng)盡量引入多種可產(chǎn)生不同香氣物質(zhì)的菌種，而不是單一菌種，可豐富濃香型基酒的香氣物質(zhì)種類。為考察賒店老酒老窖池中產(chǎn)己酸菌的組成情況及篩選出更多的產(chǎn)己酸的菌種，本研究從賒店老酒老窖池中取窖池黃水和窖池窖泥作分離樣品，分離篩選出己酸產(chǎn)量較高的己酸菌株，經(jīng)過多輪篩選和優(yōu)化，研究不同條件對(duì)己酸菌產(chǎn)酸量的影響，并通過分子鑒定獲得產(chǎn)己酸和丁酸菌株的多樣性情況，為窖泥人工培養(yǎng)和賒店老酒濃香型大曲酒的質(zhì)量提高打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品來源于賒店老酒酒廠1號(hào)車間的窖池，窖齡均為50年左右。采樣為窖底泥和窖池黃水。

1.2 培養(yǎng)基的配制

分離及富集培養(yǎng)基（巴氏合成培養(yǎng)基，m/m）[17]：乙酸鈉0.5%，硫酸鎂0.02%，磷酸氫二鉀0.04%，硫酸銨0.05%，酵母膏0.1%，瓊脂2%，乙醇2%，碳酸鈣1%（碳酸鈣干熱滅菌，乙醇和碳酸鈣在接種時(shí) 加入）。

發(fā)酵培養(yǎng)基（m/V）：乙酸鈉0.5%，酵母膏0.1%，磷酸氫二鉀0.04%，硫酸銨0.5%，硫酸鎂0.02%，碳酸鈣1%，鮮酒糟10%，酒尾3%，乙醇2%。

1.3 試劑

DNA Maker（DL2000）、Taq酶、10× PCR buffer、dNTP、通用引物27F、1492R、細(xì)菌16S rDNA細(xì)菌基因組提取試劑盒，上海生工生物工程有限公司；正己酸、正丁酸、己酸乙酯、丁酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品，天津市精細(xì)化工研究所。其余所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.4 窖泥微生物的富集培養(yǎng)與己酸菌的初篩

窖泥己酸菌大多能生成芽孢，其孢子具有耐熱性，而其營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞不耐熱。取5 g老窖泥或黃水85 ℃加熱處理10 min，淘汰較弱的芽孢，并同時(shí)殺滅營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和其它雜菌，以達(dá)到純化窖泥己酸菌的目的。冷卻后加入富集培養(yǎng)基35 ℃厭氧培養(yǎng)7 d后，挑選出產(chǎn)氣較早、較多的試管，對(duì)富集菌液再次進(jìn)行熱處理，冷卻后按15%（V/V）的接種量接種于裝有新鮮富集液體培養(yǎng)基的試管中，35 ℃厭氧培養(yǎng)7 d，選取產(chǎn)氣泡好的富集液經(jīng)適當(dāng)稀釋，在分離培養(yǎng)基上，采用夾層法厭氧培養(yǎng)[4,18,19]，觀察菌落形態(tài)。

1.5 己酸菌的復(fù)篩

挑選平板上的單個(gè)菌落移入發(fā)酵培養(yǎng)基試管中厭氧培養(yǎng)14 d，并結(jié)合發(fā)酵液的感官、硫酸銅顯色、產(chǎn)氣情況和渾濁度等指標(biāo)，確定復(fù)篩菌株。對(duì)被確定為復(fù)篩的菌株再次進(jìn)行單菌落分離，并對(duì)各單菌落進(jìn)行 發(fā)酵試驗(yàn)（35 ℃，14 d），然后選取有酯香味、產(chǎn)氣較多的渾濁發(fā)酵液進(jìn)行己酸的氣相色譜測(cè)定，選取己酸產(chǎn)量高的菌株。復(fù)篩后菌株經(jīng)革蘭氏染色后微分干涉顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)鑒定、保存。

1.6 硫酸銅顯色法

取己酸發(fā)酵液2.0 mL，然后依次加入2.0 mL的2%硫酸銅溶液和1.0 mL的乙醚，充分振蕩，使之反應(yīng)分層，此時(shí)觀察乙醚層呈現(xiàn)的藍(lán)色（深淺程度），顏色越深，己酸含量就越高[20]。

1.7 氣相色譜法測(cè)定丁酸和己酸

吸取10 mL培養(yǎng)成熟的己酸菌液樣品于25 mL具塞比色管中，加0.5 mL色譜純甲酸進(jìn)行酸化，加乙醇至25 mL，在12 000 r/min、4 ℃條件下進(jìn)行冷凍離心 5 min，取上清液，過0.2 μm微孔濾膜。進(jìn)樣前將樣品和內(nèi)標(biāo)1:1混勻。色譜儀為安捷倫公司7820A型氣相色譜儀，色譜柱為安捷倫CP-Wax 58 FFAP CB毛細(xì)管色譜柱，載氣為高純氮?dú)?，燃燒氣為H2。內(nèi)標(biāo)為以25%（V/V）乙醇配制的1 000 mg/L的2-乙基丁酸。柱溫初始溫度70 ℃保持2.5 min后，以10 /min℃ 程序升溫至180 ℃，保持3 min。進(jìn)樣口溫度210 ℃，檢測(cè)器溫度210 ℃，柱前壓0.06 MPa，尾吹6 mL/min，分流比35:1，進(jìn)樣量為0.5 μL，N2000色譜工作站，采用保留時(shí)間定性，內(nèi)標(biāo)法定量。

1.8 乙酸鈉濃度對(duì)產(chǎn)酸的影響

從篩選到的產(chǎn)丁酸和己酸的菌株中挑選8株菌株分別接種到乙酸鈉濃度為0.5%、1.0%、1.5%（m/V）的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過丁酸和己酸總量比較分析乙酸鈉濃度對(duì)菌株產(chǎn)丁酸和己酸總量的影響。

1.9 氧氣對(duì)產(chǎn)酸的影響

從篩選到的產(chǎn)丁酸和己酸的菌株中挑選己酸含量高的38株菌株，分別在厭氧培養(yǎng)箱和普通培養(yǎng)箱中，35 ℃條件下培養(yǎng)14 d，發(fā)酵液離心去除菌體后，經(jīng)過過濾處理后，氣相色譜法檢測(cè)其丁酸和己酸含量，計(jì)算厭氧條件下和好氧條件下丁酸和己酸總量的比值，研究氧氣對(duì)菌株產(chǎn)丁酸和己酸總量的影響。

1.10 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酸的影響

從上述篩選的38株菌株中挑選己酸含量高的30株菌株，分別在30 ℃條件下和37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)14 d，發(fā)酵液離心去除菌體后，經(jīng)過過濾處理后，氣相色譜法檢測(cè)其丁酸和己酸含量，計(jì)算不同溫度條件下丁酸和己酸總量的比值，比較培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)丁酸和己酸總量的影響。

1.11 PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

挑取單菌落于巴氏合成培養(yǎng)基中，35 ℃條件下培養(yǎng)3 d，10 000 r/min高速離心1 min，收集菌體沉淀。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，以其為模板，利用16S rRNA基因通用引物27F（5'-AGAGTTTG ATCCTGGCTCA-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（94 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，60 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)）。利用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至公司測(cè)序（上海生工）。將測(cè)得的細(xì)菌16S rRNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并將測(cè)定菌株的 16S rRNA基因序列與其同源性最高的序列采用Mega 5.0軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.12 菌株拮抗對(duì)峙實(shí)驗(yàn)

將不同菌株在巴氏合成培養(yǎng)基平板兩兩交叉劃線，35 ℃條件下培養(yǎng)2 d，觀察交叉處是否正常生長(zhǎng)，判定兩菌株是否有拮抗關(guān)系。

1.13 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酸及細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

從篩選到的產(chǎn)丁酸和己酸菌株中挑選5株高產(chǎn)菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，逐級(jí)擴(kuò)大接種到生產(chǎn)用的 1 000 L大缸中厭氧培養(yǎng)，35 ℃培養(yǎng)18 d，每隔3 d取樣，通過氣相色譜法檢測(cè)乙酸、丁酸、己酸含量，研究不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)己酸菌產(chǎn)酸的影響。取樣進(jìn)行梯度稀釋涂平板法計(jì)細(xì)胞數(shù)。每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)3次后取平均值[14]。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果繪制生長(zhǎng)曲線。

1.14 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019進(jìn)行整理，采用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析、皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析，采用Origin 2019b進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種篩選

把經(jīng)過富集后的培養(yǎng)液稀釋涂布平板，根據(jù)涂布平板的菌落形態(tài)，挑取疑似己酸菌的菌落劃線純化培養(yǎng)，通過CuSO4顯色法初篩共獲得118株疑似己酸菌。對(duì)初篩獲得的菌株進(jìn)行半固體穿刺培養(yǎng)，觀察己酸菌的厭氧情況。厭氧性試驗(yàn)結(jié)果顯示，其中有9株為好氧菌，只在接觸空氣的表面生長(zhǎng)；有1株為厭氧菌，只在培養(yǎng)基內(nèi)部生長(zhǎng)，接觸空氣的位置不生長(zhǎng)；其余均為兼性厭氧菌。菌落形態(tài)主要有圓形，規(guī)則或不規(guī)則邊緣，顏色多為白色或乳白色。多數(shù)為長(zhǎng)桿狀和短桿狀兩種形態(tài)，并有鼓槌狀的芽孢，大部分都具有良好的游動(dòng)性，符合己酸菌的基本形態(tài)。將篩選出的菌株接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，發(fā)酵液過濾后經(jīng)過處理，采用氣相色譜法測(cè)定丁酸、己酸含量，計(jì)算己酸和丁酸的總和，共有96株菌株可產(chǎn)己酸和丁酸。其中有8株己酸與丁酸的比大于1，總酸含量最高可達(dá)到7.8 g/L。另外有3株菌株完全不產(chǎn)己酸，只產(chǎn)丁酸。不同菌株所產(chǎn)己酸及總酸的相對(duì)頻率分布圖如圖1。

圖1 不同菌株產(chǎn)己酸、總酸的相對(duì)頻率分布圖Fig.1 Relative frequency distribution of caproic acid and total acid productions of different species

由己酸相對(duì)頻率分布圖可知，大部分菌株產(chǎn)己酸量集中在0.2~0.6 g/L，相對(duì)頻率達(dá)到80.21%，最高產(chǎn)量為1.69 g/L，相對(duì)頻率為1.04%。由總酸相對(duì)頻率分布圖可知，總酸量集中在1~3 g/L，相對(duì)頻率達(dá)到63.54%，產(chǎn)總酸量3~6 g/L的相對(duì)頻率為29.17%，最高產(chǎn)量7.8 g/L。

2.2 乙酸鈉濃度對(duì)產(chǎn)酸的影響

在產(chǎn)己酸和丁酸菌株中選取其中8株菌株，分別在乙酸鈉濃度為0.5%、1.0%、1.5%（m/V）的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，氣相色譜法檢測(cè)丁酸與己酸產(chǎn)量，通過丁酸與己酸的總酸含量，考察培養(yǎng)基中乙酸鈉濃度對(duì)總酸的影響（圖2）。結(jié)果表明，8個(gè)菌株均在乙酸鈉濃度達(dá)到1.0%時(shí)總酸量最高，乙酸鈉濃度為1.5%時(shí)，總酸含量降低。不同乙酸鈉濃度對(duì)產(chǎn)總酸量影響顯著（P＜0.01），說明合適的乙酸鈉濃度影響丁酸和己酸的產(chǎn)量。乙酸鈉作為己酸菌生長(zhǎng)過程中必需的物質(zhì)，是以乙酸根的形式參與反應(yīng)，與丁酸一起合成己酸。當(dāng)乙酸鈉濃度小于1.0%時(shí)，乙酸根不足，導(dǎo)致己酸合成量下降。同時(shí)，乙酸鈉還是己酸菌生長(zhǎng)的重要碳源。乙酸鈉濃度小于1.0%，碳源不足，限制了己酸菌生物量的增加，影響了己酸菌代謝產(chǎn)酸，導(dǎo)致丁酸、己酸產(chǎn)量減少。當(dāng)乙酸鈉濃度大于1.5%時(shí)，培養(yǎng)基pH過低，影響細(xì)菌的生長(zhǎng)，因此產(chǎn)酸量降低，所以合適的乙酸鈉濃度為1%。

圖2 乙酸鈉濃度對(duì)總酸的影響Fig.2 Effect of sodium acetate concentration on acid production

2.3 氧氣對(duì)產(chǎn)酸的影響

從96個(gè)菌株中挑選己酸含量高的38株菌，分別在普通培養(yǎng)箱及厭氧培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)14 d，檢測(cè)丁酸和己酸產(chǎn)量并將二者之和記為總酸量，以厭氧條件培養(yǎng)時(shí)總酸量與好氧條件培養(yǎng)時(shí)總酸量之比為縱坐標(biāo)作圖，觀察氧氣條件對(duì)產(chǎn)酸的影響（圖3）。實(shí)驗(yàn)表明38株菌中，28株菌厭氧條件產(chǎn)酸量與好氧條件產(chǎn)酸量之比大于1，即74%的菌株在厭氧條件下產(chǎn)總酸量要高于好氧條件下產(chǎn)總酸量，26%的菌株厭氧條件下產(chǎn)總酸量低于好氧條件下產(chǎn)總酸量。其中，14株菌厭氧條件產(chǎn)酸量達(dá)到好氧條件產(chǎn)酸量的2倍及以上，4株 菌兩者比值可以達(dá)到4倍及以上，最高為6.4倍，說明大部分菌株在厭氧條件下更有利于丁酸和己酸的產(chǎn)生，這與多數(shù)研究結(jié)果一致。在窖池發(fā)酵過程中，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的馴化，窖池內(nèi)形成獨(dú)特的厭氧環(huán)境，微生物類群以細(xì)菌為主，且以厭氧及兼性厭氧菌為主，厭氧條件下更有利于多數(shù)菌代謝產(chǎn)酸。

圖3 氧氣對(duì)產(chǎn)酸的影響Fig.3 Effect of anaerobic conditions on acid production

2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酸的影響

從上述38株菌株中挑選己酸含量高的30株菌，分別在30 ℃和37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)14 d，檢測(cè)丁酸和己酸產(chǎn)量并將二者之和記為總酸量，以30 ℃培養(yǎng)時(shí)總酸量與37 ℃培養(yǎng)時(shí)總酸量的比值為縱坐標(biāo)作圖，觀察溫度對(duì)產(chǎn)酸的影響（圖4）。結(jié)果表明30株菌中，19株菌30 ℃產(chǎn)酸量與37 ℃產(chǎn)酸量之比大于1，即63%的菌株在低溫時(shí)產(chǎn)總酸量高于高溫時(shí)的總酸量，33%的菌株37 ℃時(shí)產(chǎn)總酸量高于30 ℃條件下產(chǎn)總酸的量。其中，8株菌兩者之比達(dá)到2倍及以上，最高為4.4倍，表明大部分菌株適合低溫條件下產(chǎn)酸。多項(xiàng)研究表明，較低的溫度有利于窖池中產(chǎn)酸產(chǎn)酯的代謝過程，特別是有利于己酸、丁酸、己酸乙酯、丁酸乙酯及總酯的增加。30 ℃下，更適合多數(shù)窖泥己酸菌的生長(zhǎng)、繁殖及代謝，使產(chǎn)酸量提高，白酒質(zhì)量提高。

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酸的影響Fig.4 Effect of temperature conditions on acid production

2.5 分離菌株分子生物學(xué)鑒定及形態(tài)學(xué)觀察

在30株菌株中挑取己酸含量高的10株菌株進(jìn)行分子鑒定。提取總DNA后PCR擴(kuò)增16S rRNA基因并測(cè)序。將測(cè)定細(xì)菌的16S rRNA基因序列提交NCBI進(jìn)行在線比對(duì)分析及系統(tǒng)發(fā)育樹分析（見表1），其中包括3株賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus），3株芽孢桿菌屬（Bacillus），2株寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas），1株棒桿菌屬（Corynebacterium），1株拉梅爾芽胞桿菌屬（Rummeliibacillus）。在巴氏合成培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)3 d，光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。10個(gè)菌株除了寡養(yǎng)單胞菌屬，大部分為革蘭氏陽性菌，桿狀，單個(gè)或鏈狀排列，有芽孢（圖5）。產(chǎn)酸主要包括丁酸、己酸和少量的乙酸。10個(gè)菌株均為兼性厭氧的菌屬，兼性厭氧菌種更容易培養(yǎng)，在人工窖泥培養(yǎng)過程中，可節(jié)約培養(yǎng)成本，降低培養(yǎng)難度，提高窖泥培養(yǎng)效果。拮抗對(duì)峙實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明10個(gè)菌之間均無拮抗作用，因此都可以進(jìn)行混合培養(yǎng)。

圖5 菌株細(xì)胞形態(tài)Fig.5 Cell morphology of strains

2.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酸及細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

從以上菌株中選取5株高產(chǎn)己酸菌株，分別為3-4、8-8、11-5、13-7、5-2，逐級(jí)擴(kuò)大接種到生產(chǎn)用的1 000 L大缸中，在35 ℃的條件下厭氧發(fā)酵培養(yǎng) 18 d，每隔3 d取樣一次。發(fā)酵液經(jīng)過濾處理后氣相色譜法檢測(cè)己酸和丁酸含量，同時(shí)做梯度稀釋平板計(jì)數(shù)，取平均值，計(jì)算菌濃度，研究其產(chǎn)酸及細(xì)胞生長(zhǎng)隨培養(yǎng)時(shí)間的變化規(guī)律（圖6）。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酸及細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of fermentation time on acid production and cell concentration

5個(gè)菌株的變化趨勢(shì)基本相似，在發(fā)酵周期18 d內(nèi)，菌濃度逐步增加，而總酸量則隨著培養(yǎng)時(shí)間逐漸降低。主要原因?yàn)橐宜岷恐鸩浇档停核岷縿t隨著培養(yǎng)時(shí)間逐漸增加。丁酸含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，在7~10 d時(shí)達(dá)到最高，隨后則隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而降低。說明在培養(yǎng)過程中乙酸和丁酸作為合成己酸的底物會(huì)逐步轉(zhuǎn)化，己酸是在培養(yǎng)后期逐步增加的。各菌株發(fā)酵時(shí)間與菌株產(chǎn)酸及細(xì)胞生長(zhǎng)的相關(guān)性分析見表2。

表2 發(fā)酵時(shí)間與菌株產(chǎn)酸及細(xì)胞生長(zhǎng)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of fermentation time with acid production and cell growth

續(xù)表2

雙變量Pearson檢驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株3-4發(fā)酵時(shí)間與己酸產(chǎn)量呈極顯著相關(guān)（r=0.971，P=0.001＜0.01），與己酸菌數(shù)呈極顯著相關(guān)（r=0.943，P=0.005＜0.01）；菌株8-8發(fā)酵時(shí)間與己酸產(chǎn)量呈極顯著相關(guān)（r=0.979，P=0.001＜0.01），與己酸菌數(shù)呈極顯著相關(guān)（r=0.953，P=0.003＜0.01）；菌株13-7發(fā)酵時(shí)間與己酸產(chǎn)量呈極顯著相關(guān)（r=0.957，P=0.003＜0.01），與己酸菌數(shù)呈極顯著相關(guān)（r=0.947，P=0.004＜0.01）；菌株11-5發(fā)酵時(shí)間與己酸產(chǎn)量呈極顯著相關(guān)（r=0.979，P=0.001＜0.01），與己酸菌數(shù)呈極顯著相關(guān)（r=0.923，P=0.009＜0.01）；菌株5-2發(fā)酵時(shí)間與己酸產(chǎn)量相關(guān)性不顯著（r=0.707，P=0.116＞0.05），與己酸菌數(shù)呈極顯著相關(guān)（r=0.926，P=0.008＜0.01）。菌株3-4、13-7、11-5、5-2發(fā)酵時(shí)間與總酸產(chǎn)量呈高度負(fù)相關(guān)（P＜0.01），菌株8-8發(fā)酵時(shí)間與總酸產(chǎn)量相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。

3 結(jié)論

窖池窖泥對(duì)濃香型白酒的重要性不言而喻，究其原因是窖泥中微生物的代謝與微生物之間的相互作用，菌種分離是目前獲得高產(chǎn)己酸菌的最常用手段。本研究經(jīng)過初篩、復(fù)篩，從118株菌中篩選出96株可產(chǎn)己酸和丁酸的菌株，經(jīng)部分條件優(yōu)化后己酸產(chǎn)量最高達(dá)到3 g/L。10株菌株的分子生物學(xué)菌種鑒定結(jié)果表明，篩選出的菌株包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，均為兼性厭氧菌，大部分菌株可產(chǎn)芽孢，有較強(qiáng)的抗逆性。其中產(chǎn)量最高的5株菌株分別屬于棒桿菌屬（Corynebacterium）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）和芽孢桿菌屬（Bacillus），均被報(bào)道過在酒廠不同環(huán)境中存在。本研究?jī)?yōu)化了培養(yǎng)基中的乙酸鈉濃度，乙酸鈉最佳濃度為1%，且不同乙酸鈉濃度對(duì)總酸產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01）。氧氣條件和溫度條件對(duì)己酸和丁酸的產(chǎn)量有較顯著的影響。在篩選的產(chǎn)己酸和丁酸菌株中，74%的菌株在厭氧條件下產(chǎn)總酸量要高于好氧條件下產(chǎn)總酸量，63%的菌株在低溫時(shí)產(chǎn)總酸量高于高溫時(shí)的產(chǎn)酸量。本研究篩選的高產(chǎn)己酸菌種的己酸發(fā)酵變化趨勢(shì)基本相似，己酸均在培養(yǎng)后期逐步增加。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，乙酸量逐漸減少，丁酸產(chǎn)量高峰期要早于己酸，在7~10 d出現(xiàn)；隨后丁酸產(chǎn)量逐漸降低，己酸產(chǎn)量逐漸增加，14 d后逐漸達(dá)到高峰期；而總酸量逐漸降低，說明己酸菌產(chǎn)己酸是一個(gè)相對(duì)緩慢而漫長(zhǎng)的過程，乙酸、丁酸等逐漸合成己酸。

研究表明，復(fù)合菌液發(fā)酵較純種發(fā)酵更能在香味成分、酒質(zhì)方面凸顯出優(yōu)勢(shì)。本研究篩選出的多種不同己酸菌拮抗對(duì)峙實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明10個(gè)菌株之間均無拮抗作用，因此都可以進(jìn)行混合培養(yǎng)。這些菌來自不同菌屬，產(chǎn)酸的代謝途徑不同，可以利用多種不同底物如乳酸、氨基酸、甲醇等為電子供體進(jìn)行產(chǎn)酸，建立一個(gè)可協(xié)同作用的，穩(wěn)定的微生物生態(tài)混合培養(yǎng)體系。其中，拉梅爾芽胞桿菌屬（Rummeliibacillus）并沒有被廣泛應(yīng)用到人工窖泥的培養(yǎng)。除在這10株菌間探尋最佳復(fù)配方法外，還可將其與甲烷菌、酵母菌、放線菌復(fù)配發(fā)酵。除此以外，將拉梅爾芽胞桿菌屬（Rummeliibacillus）和球形厭氧桿菌屬引入生物炭，可以建立一個(gè)獨(dú)特的群落結(jié)構(gòu)，利用厭氧菌群將有機(jī)廢棄物利用乙醇，乳酸等底物，顯著提高己酸等中鏈脂肪酸濃度，是一種非常有潛力、可持續(xù)利用的新型能源化和資源化技術(shù)。拉梅爾芽胞桿菌屬（Rummeliibacillus）還可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，耐受毒性作用較強(qiáng)，有很好的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)后期將在掌握已篩選菌株理化性質(zhì)和代謝特征的基礎(chǔ)上，剖析不同菌株之間共生關(guān)系及與其他菌株的共生關(guān)系，在進(jìn)行窖池養(yǎng)護(hù)、豐富新窖池中微生物種類、縮短新窖池向老窖池演變所需時(shí)間、調(diào)整老窖池微生物結(jié)構(gòu)等方面發(fā)揮積極作用。