王玉榮，侯強(qiáng)川，田龍新，周加平，劉菊珍，郭壯*

（1.湖北文理學(xué)院,湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北襄陽(yáng) 441053）（2.襄陽(yáng)市醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北襄陽(yáng) 441053）（3.醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵襄陽(yáng)市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北襄陽(yáng) 441614）

清香、醬香和濃香是中國(guó)白酒三大基礎(chǔ)香型，其中醬香白酒釀造工藝獨(dú)特且復(fù)雜，在長(zhǎng)達(dá)一年的生產(chǎn)周期內(nèi)，需經(jīng)過(guò)二次投料、九次蒸煮、八次發(fā)酵和七次取酒[1,2]?；诟泄偌帮L(fēng)味分析顯示，不同輪次生產(chǎn)的醬香白酒品質(zhì)存在明顯差異，人們普遍認(rèn)為第一輪和第二輪的基酒滋味較澀，醬香味不足；第三輪、第四輪和第五輪的基酒質(zhì)量整體較好，因此也被稱(chēng)為“大回酒”，這三個(gè)輪次亦是醬香白酒釀造過(guò)程中的主要輪次；而第六輪和第七輪基酒品質(zhì)略次之，常帶有焦香或苦澀味[2-4]。因此，不同輪次基酒還需漫長(zhǎng)的陳釀及精確的勾調(diào)，才能釀成醬香濃郁、入口醇厚、空杯留香持久不散的醬香型白酒[5]。

由于開(kāi)放或半開(kāi)放的制作環(huán)境及原料的差異，醬香白酒在高溫制曲、堆積發(fā)酵、入池發(fā)酵等多輪次處理過(guò)程中微生物群落動(dòng)態(tài)變化對(duì)酒醅品質(zhì)有著重要的影響，進(jìn)而影響白酒出酒率及風(fēng)味，因此研究人員對(duì)不同輪次酒醅展開(kāi)了多項(xiàng)研究。崔守瑜等[6]采用純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)貴州醬香白酒下沙、造沙及七個(gè)不同輪次發(fā)酵過(guò)程酒醅微生物多樣性進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)測(cè)定樣本pH值及溫度，結(jié)果顯示不同輪次酒醅微生物存在差異，菌落總數(shù)先降后升且與溫度有關(guān)。張春林等[7]采用高通量測(cè)序技術(shù)，研究了茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒第二輪次酒醅堆積發(fā)酵過(guò)程中微生物群落與理化特性變化，分析顯示理化指標(biāo)與多數(shù)微生物群落間具有明顯相關(guān)性。吳錢(qián)第等[8]的研究顯示四川某醬香白酒廠第四、五輪次酒醅中氨基酸組成和含量不同。此外，醬香白酒酒醅在多輪次加工過(guò)程中均采用“分層起糟”的方式進(jìn)行處理，主要是因?yàn)槠浣殉厣疃雀哌_(dá)2 m以上，發(fā)酵過(guò)程中隨著物料的分解等因素，窖內(nèi)不同深度環(huán)境變化，會(huì)造成酒醅微生物組成及品質(zhì)差異[9,10]。姜明慧等[11]對(duì)山東下沙輪次及窖內(nèi)不同深度酒醅中微生物進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)不同節(jié)點(diǎn)酒醅微生物存在差異。Wang等[12]通過(guò)對(duì)北京第五、六輪次窖池內(nèi)上、中、下層醬香白酒發(fā)酵酒醅的風(fēng)味和微生物分析，揭示了兩輪釀造過(guò)程中基酒的風(fēng)味品質(zhì)差異及微生物對(duì)其影響。以上研究表明不同區(qū)域不同發(fā)酵階段醬香白酒酒醅乃至同一窖池不同深度酒醅微生物及品質(zhì)亦存在差異。

目前針對(duì)湖北地區(qū)醬香白酒第四輪次出窖酒醅，特別是窖池不同分層酒醅研究較少，其微生物與品質(zhì)間的關(guān)系尚不明晰。因此，本研究采用純培養(yǎng)與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的方法測(cè)定湖北地區(qū)醬香白酒第四輪次不同分層出窖酒醅微生物群落組成，同時(shí)使用電子舌和電子鼻等仿生學(xué)技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)分析方法檢測(cè)其感官與理化性質(zhì)，探究微生物對(duì)第四輪次酒醅的影響，為探究不同分層酒醅微生物菌群變化與酒的品質(zhì)、香氣成分及后續(xù)發(fā)酵的關(guān)系提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

MRS培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基采購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、酚酞、氫氧化鈉、葡萄糖、無(wú)水硫酸銅、次甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、鹽酸采購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司。

YP6000電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；Vortex-2旋渦混勻儀，上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-2D雙人單面超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；YXQ-sⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LRH-70生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；DG250厭氧培養(yǎng)箱，英國(guó)DWS公司；SA402B電子舌，日本Insent公司；PEN3.5電子鼻，德國(guó)Airsense公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo公司；K1100凱氏定氮儀，海能未來(lái)技術(shù)集團(tuán)股份有限公司；HR83鹵素水分測(cè)定儀，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；PowerEdge R930架式服務(wù)器，美國(guó)Dell公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集與前處理

本研究中醬香型白酒酒醅樣本來(lái)源于湖北省堯治河楚翁泉酒業(yè)，其窖池長(zhǎng)×寬×深為4.8 m×2.3 m×1.8 m，按照從上到下順序?qū)⒔殉鼐契譃樯蠈樱?7 ℃，距窖池底1.8 m）、中層（33~35 ℃，距窖池底1.2 m）和下層（32 ℃，距窖池底0.6 m），對(duì)同一窖池第四輪次不同分層酒醅進(jìn)行采集，每層采集五個(gè)點(diǎn)：四個(gè)角及對(duì)角線中心交點(diǎn)，上層標(biāo)號(hào)依次為S1、S2、S3、S4、S5；中層為Z1、Z2、Z3、Z4、Z5；下層為X1、X2、X3、X4、X5。采集的酒醅在窖池中的發(fā)酵時(shí)間為28 d，每份樣本采集500 g，將其一式兩份置于無(wú)菌袋中低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 活菌計(jì)數(shù)

分別參照GB 4789.15-2016《霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)》[13]和GB 4789.35-2016《乳酸菌檢驗(yàn)》[14]對(duì)不同分層酒醅中霉菌和酵母菌、細(xì)菌以及乳酸菌總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.3 理化特性分析

蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[15]中凱氏定氮法進(jìn)行處理與分析。

參照DB34/T 2264-2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方 法》[16]酒醅酸度以每1 g酒醅消耗0.1 mol/L NaOH的毫升數(shù)來(lái)表示；還原糖和淀粉含量均采用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液反滴定法測(cè)定。

直接稱(chēng)取酒醅5 g置于樣品盤(pán)中，使用鹵素水分測(cè)定儀測(cè)定水分含量。

1.2.4 感官品質(zhì)分析

酒醅的酸味、苦味、澀味、咸味、鮮味、澀的回味（后味A）、苦的回味（后味B）以及豐度等滋味特征采用電子舌測(cè)定，0號(hào)位對(duì)照為Reference；揮發(fā)性風(fēng)味特征采用電子鼻測(cè)定。

1.2.5 微生物群落結(jié)構(gòu)解析

參照試劑盒說(shuō)明提取酒醅樣本宏基因組DNA，使用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取物濃度及純度，將合格DNA提取物置于-20 ℃?zhèn)溆谩７謩e參照Xu等[17]和White等[18]的方法使用338F（5'-ACTCCTACGGGA GGCAGCAG-3'）/806R（5'-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3'）和ITS1F(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGT AA-3')/ITS2R(5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')對(duì)細(xì)菌16S rRNA和真菌ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增。使用1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。純化產(chǎn)物低溫送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行雙端測(cè)序。

對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)控后使用QIIME（v1.7.1）和架式服務(wù)器進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用兩步UCLUST劃分操作分類(lèi)單元（Operational Taxonomic Units，OTU），使用Greengenes（v165 13.8），Ribosomal Database Project（RDP，Release 11.5）和Sliva（v166 132）對(duì)序列微生物學(xué)分類(lèi)地位進(jìn)行劃分。序列已上傳至MG-RAST數(shù)據(jù)庫(kù)，編號(hào)為mgp102959。

1.3 數(shù)據(jù)分析與可視化

菌落計(jì)數(shù)直方圖以及感官特征分析雷達(dá)圖均使用OriginPro 2021（v9.8.0.200）繪制；使用R（v4.0.0）繪制優(yōu)勢(shì)菌屬堆積柱狀圖、差異直方圖以及不同分層酒醅微生物群落差異主坐標(biāo)分析圖；理化指標(biāo)與優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬、真菌屬的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖使用Cytoscape（v3.7.2）繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同分層酒醅活菌計(jì)數(shù)及理化特性分析

本研究首先采用純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)堯治河第四輪次不同深度酒醅中菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌以及乳酸菌進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，上中下層酒醅中菌落總數(shù)分別為5.91、5.63和5.58 lg CFU/g；霉菌和酵母菌數(shù)分別為5.67、5.57和5.20 lg CFU/g；乳酸菌數(shù)分別為4.79、4.56和 4.18 lg CFU/g，可視化分析結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 酒醅中活菌計(jì)數(shù)直方圖Fig.1 Histogram of viable bacteria count in alcoholic fermentative material

堯治河第四輪次不同深度出窖酒醅中菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌以及乳酸菌活菌數(shù)均為上層＞中層＞下層，這可能是由于在重力、溫度及氧氣濃度差異作用下中下層酒醅密度升高對(duì)部分微生物的生長(zhǎng)不利，導(dǎo)致下層活菌數(shù)少于上層。整個(gè)酒醅中菌落總數(shù)、霉菌和酵母的含量均高于105CFU/g，上層更是接近于106CFU/g，在高溫環(huán)境下酵母菌較難生長(zhǎng)，亦有研究顯示窖池中心、下層酒醅中酵母豐度不及上層[19]。計(jì)數(shù)結(jié)果顯示乳酸菌是酒醅中主要細(xì)菌，窖池不同深度酒醅中乳酸菌量均在104CFU/g以上。

酒醅中水分含量、酸度、淀粉含量等不僅影響微生物的生長(zhǎng)，還能體現(xiàn)微生物對(duì)酒醅的利用度以及酒醅特性，經(jīng)驗(yàn)豐富的釀酒師傅甚至可以通過(guò)酒醅水分、酸度等理化參數(shù)判斷出酒品質(zhì)[20]。故本研究進(jìn)一步對(duì)不同層次酒醅各理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 窖池不同深度酒醅理化特性分析Table 1 Analysis of physical and chemical characteristics of alcoholic fermentative material with different depth in fermentation pit

水分含量不僅影響微生物的生長(zhǎng)繁殖及底物代謝，對(duì)酒醅出酒率及酒體品質(zhì)也有一定的影響[21]。由表1可知，隨著窖池深度加深，酒醅水分含量先降后升，整體差異不明顯，表明第四輪次出窖酒醅水分分布較均勻穩(wěn)定。上層酒醅酸度略高于下層，這是由于上層酒醅中乳酸菌量高于中下層，在窖池密閉發(fā)酵環(huán)境中持續(xù)代謝產(chǎn)酸。第四輪次酒醅中還原糖、淀粉及蛋白質(zhì)含量為上層＜中層＜下層，整體上差異不顯著（P＞0.05）；中層酒醅酒精度高于上層和下層，整體在1.44%vol~ 1.65%vol之間。計(jì)數(shù)結(jié)果顯示下層酒醅細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)量均少于中上層，這可能導(dǎo)致分解淀粉及蛋白質(zhì)能力減弱，還原糖利用度下降，使得窖池下層淀粉、蛋白質(zhì)及還原糖含量高于中層及上層酒醅。

酒醅風(fēng)味直接決定白酒的優(yōu)劣，因此在測(cè)定酒醅理化品質(zhì)的同時(shí)，本研究對(duì)不同層次酒醅的感官特性亦進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同分層酒醅滋味（a）及揮發(fā)性風(fēng)味（b）品質(zhì)雷達(dá)圖Fig.2 Radar chart of taste (a) and volatile flavor (b) quality of different layered alcoholic fermentative material

酒醅滋味特征中除咸味外其余七個(gè)滋味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度較為接近，上層酒醅酸味、苦的回味（后味-B）以及鮮味回味（豐度）相對(duì)強(qiáng)度要高于其他層次酒醅（P＞0.05），且隨著窖池深度加深其酒醅酸味逐漸減弱，這與酸度指標(biāo)測(cè)定結(jié)果一致。三個(gè)分層中，下層酒醅的苦味、澀味、咸味和鮮味相對(duì)強(qiáng)度最高，中層酒醅的澀的回味（后味-A）相對(duì)強(qiáng)度最高。整體上，上層和下層酒醅滋味更為接近。

風(fēng)味方面，堯治河醬香白酒第四輪次出窖酒醅在W1S（甲烷）、W1W（有機(jī)硫化物和萜烯類(lèi)）、W2S（乙醇）和W5S（氮氧化合物）四個(gè)傳感器上的響應(yīng)強(qiáng)度較為凸出。窖池酒醅從上層到下層，W1C（芳香型化合物）、W3C（芳香型化合物）、W5C（烷烴芳香成分）等檢測(cè)芳香類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)的傳感器相對(duì)強(qiáng)度逐漸增大（P＜0.05），其他傳感器呈現(xiàn)相反趨勢(shì)，表明下層酒醅芳香味更濃。這可能是由于在重力作用下，部分有機(jī)物會(huì)向下沉積。此外，理化分析顯示下層酒醅中淀粉及蛋白質(zhì)含量高于中、上層，這些物質(zhì)可作為風(fēng)味物質(zhì)前體物，形成酒體風(fēng)味[22]。

2.2 不同分層酒醅微生物群落組成差異分析

本研究從堯治河醬香白酒第四輪次不同分層出窖酒醅15個(gè)樣本中檢測(cè)出的細(xì)菌和真菌序列數(shù)分別為617 105和935 075條，97%的相似度下可劃分的OTU數(shù)分別為2 716和3 522個(gè)，經(jīng)與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后確定各分類(lèi)水平及相對(duì)含量，細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)組成分析結(jié)果見(jiàn)圖3。

從第四輪次出窖酒醅中共檢測(cè)出50種細(xì)菌屬，其中上中下層檢測(cè)出的種類(lèi)數(shù)分別為27、30和23種。由圖3a可知，不同分層酒醅細(xì)菌群落組成較為相似，Lactobacillus（乳酸桿菌屬，91.59%）、Thermoactinomyces（熱放線菌屬，4.49%）、Bacillus（芽孢桿菌屬，1.12%）和Kroppenstedtia（無(wú)中文名，0.97%）為15份酒醅樣本中均存在的屬（核心細(xì)菌屬），且前三個(gè)屬平均相對(duì)含量均大于1%，是酒醅樣本中的核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，其中Lactobacillus為堯治河第四輪次出窖酒醅中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬。通過(guò)采用高通量測(cè)序技術(shù)，孫利林等[23]發(fā)現(xiàn)Lactobacillus亦是茅臺(tái)鎮(zhèn)某酒廠醬香白酒第四輪次窖內(nèi)發(fā)酵酒醅中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。Lactobacillus在窖池密封發(fā)酵過(guò)程中可產(chǎn)生乳酸，一方面可以調(diào)節(jié)酒醅酸度，另一方面它也是醬香白酒釀造過(guò)程中一種風(fēng)味物質(zhì)。

圖3 窖池不同深度酒醅微生物屬水平柱狀堆積圖Fig.3 Horizontal columnar accumulation diagram of microbes in alcoholic fermentative material at different depths in fermentation pit

從15份樣本中檢測(cè)出的真菌屬有74個(gè)，上中下層檢測(cè)出的種類(lèi)數(shù)分別為34、30和30種。核心真菌屬為T(mén)hermoascus（嗜熱子囊菌屬，33.45%）、Sarocladium（帚枝霉屬，18.84%）、Pichia（畢赤醇母屬，15.69%）、Rasamsonia（羅薩氏菌屬，6.96%）、Aspergillus（曲霉屬，2.66%）、Thermomyces（嗜熱真菌屬，1.28%）、Zygosaccharomyces（接合酵母屬，0.86%）、Candida（念珠菌屬，0.51%）和Purpureocillium（0.35%），優(yōu)勢(shì)真菌屬（相對(duì)含量大于1%）為T(mén)hermoascus、Sarocladium、Pichia、Saccharomyces（酵母菌屬，16.07%）、Rasamsonia、Aspergillus、Torulaspora（有孢圓酵母屬，1.89%）、Thermomyces、Byssochlamys（絲衣霉屬，1.44%）。與貴州茅臺(tái)鎮(zhèn)H和J酒廠第四輪次窖內(nèi)酒醅真菌群落[24]相比，堯治河醬香白酒第四輪次窖內(nèi)酒醅中真菌多樣性更高，優(yōu)勢(shì)真菌種類(lèi)更為豐富。整體上，相較于下層酒醅，上層和中層酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)較為相近，且更為復(fù)雜。下層酒醅中Sarocladium含量明顯增多，而Thermoascus減少。

為更直觀顯示各菌屬含量變化，本研究采用直方圖對(duì)不同分層樣本優(yōu)勢(shì)細(xì)菌、真菌屬相對(duì)含量進(jìn)行了可視化，如圖4所示。

圖4 不同分層酒醅優(yōu)勢(shì)微生物屬差異箱式圖Fig.4 Box diagram of the difference of dominant microbial genera in different layered alcoholic fermentative material

圖4a顯示，堯治河第四輪次出窖酒醅中Lactobacillus相對(duì)含量遠(yuǎn)高于其他細(xì)菌屬，為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，且窖池上層Lactobacillus含量高于中層和下層，隨著窖池加深Thermoactinomyces的含量逐漸升高，中層酒醅中Bacillus的相對(duì)含量最高。整體上，窖池上層不同位置酒醅各優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬相對(duì)含量差異要小于中層和下層。與細(xì)菌相比，第四輪次窖池不同深度出窖酒醅中優(yōu)勢(shì)真菌相對(duì)含量差異更為明顯（圖4b）。隨著窖池深度逐漸加深，酒醅中Thermoascus、Rasamsonia、Aspergillus和Thermomyces平均相對(duì)含量逐漸降低，而Sarocladium和Torulaspora趨勢(shì)相反，其中變化較為明顯的為T(mén)hermoascus平均相對(duì)含量由上層51.70%下降至下層12.69%，Sarocladium由上層0.8%升至下層47.61%。中層酒醅中Pichia、Saccharomyces、Torulaspora和Byssochlamys平均含量較其他層次高。對(duì)于醬香型白酒而言，高溫發(fā)酵工藝使溫度成為影響發(fā)酵質(zhì)量的最重要因素，在窖池發(fā)酵階段，密封發(fā)酵及微生物代謝產(chǎn)生的熱量會(huì)使得一些不適應(yīng)的微生物逐漸消失，而耐熱或嗜熱微生物生長(zhǎng)良好[25,26]。

本研究進(jìn)一步基于細(xì)菌屬和真菌屬相對(duì)豐度距離矩陣對(duì)不同分層酒醅樣本進(jìn)行主坐標(biāo)分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 基于UniFrac距離的不同分層酒醅微生物PCoA分析Fig.5 PCoA analysis of microbes in different layered alcoholic fermentative material based on UniFrac distance

由圖5可知，在不考慮酒醅中各細(xì)菌屬相對(duì)含量情況下，不同分層酒醅樣本圍繞坐標(biāo)軸中心分部，較難區(qū)分開(kāi)；將各細(xì)菌屬相對(duì)含量納入分析時(shí)，樣本區(qū)分度要比非加權(quán)算法要明顯，且PCoA1的貢獻(xiàn)率高達(dá)91.37%，表明考慮相對(duì)含量后PCoA1是導(dǎo)致區(qū)將上中下層酒醅分開(kāi)的主要因素。以上說(shuō)明，窖池不同深度酒醅細(xì)菌種類(lèi)較為相似，但各菌屬在窖池不同部位的豐度存在差異。由圖5c~d可知，不論是否考慮各真菌屬的含量，基于真菌群落結(jié)構(gòu)組成的不同層次酒醅在坐標(biāo)軸上均較易區(qū)分，且較細(xì)菌更為明顯，表明窖池不同深度酒醅真菌種類(lèi)、含量均存在差異。同一深度不同位置酒醅組內(nèi)差異大小為上層＜中層＜下層，整體而言上層酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)與中層更為相似，這與屬水平柱狀堆積圖分析結(jié)果一致。

2.3 微生物與理化性質(zhì)間關(guān)聯(lián)分析

為探究酒醅微生物群落對(duì)酒醅品質(zhì)的影響，本研究對(duì)細(xì)菌、真菌及理化指標(biāo)間的相關(guān)性進(jìn)行了Pearson相關(guān)分析，并對(duì)相關(guān)性系數(shù)絕對(duì)值大于0.40且P＜0.05的指標(biāo)繪制網(wǎng)絡(luò)分析圖，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同分層酒醅理化與優(yōu)勢(shì)屬相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Correlation network diagram of physical and chemical properties and dominant genera of different layered alcoholic fermentative material

由圖6可知，堯治河第四輪次出窖酒醅中微生物與微生物之間以及微生物與理化品質(zhì)間存在較為復(fù)雜的關(guān)系。水分含量與Thermoascus、Thermomyces和Aspergillus顯著正相關(guān)（P＜0.05），而這三個(gè)真菌屬與淀粉含量呈負(fù)相關(guān)；蛋白質(zhì)含量與Thermoactinomyces和Byssochlamys正相關(guān)關(guān)系顯著（P＜0.05）；酒醅還原糖含量及酸度與微生物群落的相關(guān)系較為復(fù)雜，酸度與6個(gè)真菌屬存在明顯相關(guān)性，其中與Thermoascus、Rasamsonia和Aspergillus正相關(guān)，與Torulaspora、Saccharomyces和Pichia負(fù)相關(guān)；還原糖與Torulaspora和Sarocladium正相關(guān)關(guān)系顯著，而與Thermoascus、Thermomyces和Aspergillus負(fù)相關(guān)。

網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(diǎn)屬有12個(gè)，Lactobacillus作為酒醅中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬僅與Saccharomyces呈顯著正相關(guān)，與理化指標(biāo)見(jiàn)無(wú)明顯相關(guān)性；Thermoactinomyces除與Lactobacillus負(fù)相關(guān)外，與Bacillus、Torulaspora和Rasamsonia正相關(guān)。相較于細(xì)菌，真菌菌屬與其他指標(biāo)間的相關(guān)性更為復(fù)雜，優(yōu)勢(shì)真菌屬Thermoascus、Rasamsonia和Aspergillus均與八個(gè)指標(biāo)存在顯著相關(guān)性，表明這些菌屬可能是酒醅發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵物種。各優(yōu)勢(shì)微生物節(jié)點(diǎn)間存在強(qiáng)烈的生態(tài)聯(lián)系，復(fù)雜的微生物組成及相關(guān)性更有利于酒醅群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。因此，堯治河醬香白酒第四輪次出窖酒醅中微生物群落中存在著復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，微生物相互關(guān)系及理化感官品質(zhì)變化受微生物功能的驅(qū)動(dòng)。

3 結(jié)論

本研究基于國(guó)標(biāo)中純培養(yǎng)方法統(tǒng)計(jì)堯治河第四輪次不同深度出窖酒醅中菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌以及乳酸菌活菌數(shù)，結(jié)果均為上層＞中層＞下層，且乳酸菌是酒醅中主要細(xì)菌，整個(gè)酒醅中細(xì)菌、霉菌和酵母的含量均高于105CFU/mL。第四輪次酒醅中還原糖、淀粉及蛋白質(zhì)含量為上層＜中層＜下層，整體上窖池不同深度酒醅中酸度、水分含量、酒精度、還原糖、淀粉及蛋白質(zhì)含量差異不顯著（P＞0.05）。隨著窖池深度加深其酒醅酸味逐漸減弱，上層和下層酒醅滋味更為接近；窖池酒醅從上層到下層，W1C、W3C、W5C等檢測(cè)芳香類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)的傳感器相對(duì)強(qiáng)度逐漸增大，其他傳感器呈現(xiàn)相反趨勢(shì)，表明下層酒醅芳香味更濃。高通量測(cè)序結(jié)果表明，Lactobacillus（乳酸桿菌屬）、Thermoactinomyces（熱放線菌屬）、Bacillus（芽孢桿菌屬）和Kroppenstedtia為酒醅樣本核心細(xì)菌屬，其中Lactobacillus為堯治河第四輪次出窖酒醅中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，平均相對(duì)含量高達(dá)91.59%。樣本中的核心真菌屬為T(mén)hermoascus（嗜熱子囊菌屬）、Sarocladium（帚枝霉屬）、Pichia（畢赤醇母屬）、Rasamsonia（羅薩氏菌屬）、Aspergillus（曲霉屬）、Thermomyces（嗜熱真菌屬）、Zygosaccharomyces（接合酵母屬）、Candida（念珠菌屬）和Purpureocillium，其中優(yōu)勢(shì)真菌屬為T(mén)hermoascus、Sarocladium、Pichia、Saccharomyces（酵母菌屬）、Rasamsonia、Aspergillus、Torulaspora（有孢圓酵母屬）、Thermomyces、Byssochlamys（絲衣霉屬）。整體上，相較于下層酒醅，上層和中層酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)較為相近，且更為復(fù)雜。窖池不同深度酒醅細(xì)菌種類(lèi)較為相似，但各菌屬在窖池不同部位的豐度存在差異，而真菌種類(lèi)和含量均存在差異，同一深度不同位置酒醅組內(nèi)差異大小為上層＜中層＜下層，整體而言上層酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)與中層更為相似。關(guān)聯(lián)分析表明，堯治河第四輪次出窖酒醅中微生物與微生物之間以及微生物與理化性質(zhì)間存在較為復(fù)雜的關(guān)系。優(yōu)勢(shì)真菌屬Thermoascus、Rasamsonia和Aspergillu是酒醅發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵物種，樣本微生物群落中存在著復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。該研究可為后期解析酒醅微生物與薄酒風(fēng)味形成機(jī)理提供依據(jù)。