瑜文美,楊玲艷,劉振華,李 輝,田澤杰,李嘉欣,易小嬋,何 軍,劉運(yùn)美*

(南華大學(xué) a.藥學(xué)院,b.化學(xué)化工學(xué)院,中國(guó) 衡陽(yáng) 421001)

水楊酸是一種單羥基苯甲酸,是從柳樹中提取出來具有抗炎活性的天然產(chǎn)物[1]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)炎癥與癌癥之間有著復(fù)雜多樣的聯(lián)系[2-5]。Kutlu等人[6]通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了水楊酸對(duì)A549細(xì)胞具有抗增殖活性。研究表明,阿司匹林(對(duì)乙酰水楊酸)會(huì)影響多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[7-9],NO-阿司匹林衍生物通過GSH和蛋白硫醇反應(yīng)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[10,11]。一氧化氮(NO)是一種多功能自由基,在體內(nèi)由一氧化氮合酶(NOS)調(diào)節(jié)其水平[12]。NO作為信號(hào)分子,可調(diào)控多種生理過程,近些年研究發(fā)現(xiàn),NO與腫瘤的發(fā)生和增殖相關(guān)[13-15],且呈現(xiàn)出濃度依賴性的特點(diǎn)[16]。NO等氣體療法作為一種新型的腫瘤治療方法也成為研究的熱點(diǎn)。

卟啉是一類雜環(huán)有機(jī)化合物,在植物和哺乳動(dòng)物的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。在20世紀(jì)初,研究者們發(fā)現(xiàn)血卟啉能選擇性地聚集在腫瘤組織中并發(fā)生光敏化[17]。卟啉作為光敏劑應(yīng)用于光動(dòng)力療法(PDT)被廣泛研究。PDT利用可見光與光敏劑的腫瘤定位作用治療惡性腫瘤,使其在不損傷正常組織或器官的情況下選擇性靶向,產(chǎn)生對(duì)癌細(xì)胞具有殺傷性的ROS,最終破壞腫瘤細(xì)胞[18-21]。相對(duì)于傳統(tǒng)的腫瘤治療方法,PDT具有簡(jiǎn)單有效、毒副作用小及無創(chuàng)等多方面的特點(diǎn)[22-25],這對(duì)于傳統(tǒng)治療方法不耐受的患者尤為適用。

雖然光動(dòng)力療法因其毒副作用小及無創(chuàng)等特點(diǎn)而被廣泛關(guān)注,但是單一的PDT無法達(dá)到完全治療的目的。聯(lián)合治療是目前癌癥治療的新趨勢(shì)和新方向之一。為了增強(qiáng)卟啉化合物的抗腫瘤活性,大量研究表明,將卟啉與多種天然抗癌藥結(jié)合能夠得到療效更好、毒性更低的抗腫瘤藥物。為此,本文設(shè)計(jì)并合成含NO供體的卟啉-水楊酸衍生物,并采用MTT法對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行研究,期望得到活性更好、毒副作用小的抗腫瘤藥物。同時(shí),對(duì)其進(jìn)行分子模擬研究,將目標(biāo)化合物與CDK和PI3K靶蛋白進(jìn)行分子模擬對(duì)接,推測(cè)目標(biāo)化合物的體內(nèi)抗腫瘤作用機(jī)制。

1 儀器與試劑

Bruker AVANCE-500兆核磁共振波譜儀(瑞典,德國(guó)),APCI-MS光譜儀(美國(guó)加州),二氧化碳培養(yǎng)箱(賽默飛科技有限公司),酶標(biāo)儀(BIO-TEK 公司)。薄層硅膠G板和0.075—0.154 mm孔徑硅膠粉(安徽良臣硅源材料有限公司)。水楊酸、5-氯水楊酸、吡咯、2-溴乙醇、3-溴丙醇、4-溴-1-丁醇、5-溴-1-戊醇、6-溴-1-己醇、4-羥基苯甲醛及苯甲醛等從阿拉丁試劑有限公司購(gòu)入,均為分析純,無須進(jìn)一步純化。MTT(噻唑藍(lán))試劑(上海麥克林生化科技有限公司)。DEAM Basic (1X),Fetal Bovine Serum (FBS),Trypsin-EDTA(胰蛋白酶)及PBS磷酸鹽緩沖劑等均從Gibco Company購(gòu)入。

2 方法

2.1 合成路線

設(shè)計(jì)合成20個(gè)含NO供體的卟啉-水楊酸化合物。首先將溴代醇(2-溴乙醇,3-溴-1-丙醇,4-溴-1-丁醇,5-溴-1-戊醇,6-溴-1-己醇)分別與濃硝酸進(jìn)行硝化反應(yīng)合成溴代硝酸酯(2a-2e),2a-2e再分別與水楊酸或5-氯水楊酸發(fā)生取代反應(yīng)生成化合物3a-3e和4a-4e,進(jìn)一步酰氯化后與卟啉化合物進(jìn)行反應(yīng)合成了目標(biāo)化合物(7a-10e)?；衔锏暮铣陕肪€如圖1所示。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.2.1 溴代硝酸酯(2a-2e)的合成 量取1.1 mL濃硝酸和2.4 mL濃硫酸加入到圓底燒瓶,在冰浴條件下攪拌10 min,緩慢加10 mmol 2-溴乙醇到反應(yīng)瓶中,繼續(xù)反應(yīng)1 h。將反應(yīng)液倒入冰水中,用CH2Cl2進(jìn)行萃取,萃取得到的有機(jī)相用無水Na2SO4干燥,減壓濃縮,放于真空干燥箱中干燥,得到黃色油狀液體2a。分別以3-溴-1-丙醇,4-溴-1-丁醇,5-溴-1-戊醇,6-溴-1-己醇替代2-溴乙醇,以同樣的方法得到黃色油狀液體2b-2e,收率為89%～98%。

2.2.2 水楊酸衍生物(3a-4e)的合成 精確稱取0.9 mmol水楊酸、4.5 mmol無水K2CO3加入到圓底燒瓶,DMF作溶劑,在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下于室溫下攪拌10 min,加0.9 mmol上一步合成的溴代硝酸酯到反應(yīng)瓶中,繼續(xù)反應(yīng)1 h。反應(yīng)液倒入分液漏斗,用CH2Cl2萃取,并水洗4～5次除去DMF,將有機(jī)相用無水Na2SO4干燥,減壓濃縮,放于真空干燥箱中干燥,得淡黃色油狀粗產(chǎn)物。用二氯甲烷和正己烷作為洗脫劑過硅膠柱純化,干燥后得化合物3a-3e,收率為47%～55%。以5-氯水楊酸替代水楊酸,用相同的合成方法得到化合物4a-4e,收率為47%～53%。

2.2.3 卟啉化合物(5和6)的合成 精確稱取10.2 g苯甲醛、5.3 g對(duì)羥基苯甲醛加入到500 mL三頸燒瓶中,以丙酸作溶劑,于135 ℃油浴鍋加熱至反應(yīng)液回流,用恒壓滴液漏斗緩慢滴4.8 mL新蒸吡咯和丙酸的混合液到反應(yīng)瓶中,繼續(xù)攪拌2 h。反應(yīng)液于室溫下放置冷卻,向其中加入等量的無水乙醇,在4 ℃下冷藏24 h。抽濾,得藍(lán)紫色粗產(chǎn)物,過硅膠柱純化(洗脫劑V(二氯甲烷)∶V(正己烷)=3∶1),收集第二條色帶,得到藍(lán)紫色的晶體5,收率為8%。以對(duì)氯苯甲醛代替苯甲醛,用相同的合成方法得到藍(lán)紫色的晶體6,收率為9%。

2.2.4 卟啉-水楊酸衍生物(7a-10e)的合成 取0.2 mmol3a,0.2 mmol SOCl2和0.2 mmol DMF加入到50 mL圓底燒瓶,用CH2Cl2溶解,于室溫反應(yīng),TLC點(diǎn)板監(jiān)測(cè)至反應(yīng)完全,減壓旋去溶劑,加入CH2Cl2放置備用。精確稱取0.1 mmol晶體5,0.5 mmol無水K2CO3加入到100 mL 圓底燒瓶,以DMF作溶劑,在60 ℃下反應(yīng)30 min,將上述所得的酰氯化合物滴加到反應(yīng)液中,TLC點(diǎn)板監(jiān)測(cè)至反應(yīng)完全。用CH2Cl2萃取,水洗4～5次除去DMF,將有機(jī)相用無水Na2SO4干燥,減壓濃縮,放于真空干燥箱中干燥,得粗產(chǎn)物。用二氯甲烷和正己烷作為洗脫劑過硅膠柱分離純化,收集第一條色帶,再用正己烷和乙醇重結(jié)晶,得到紫色的目標(biāo)化合物7a。分別以3b,3c,3d,3e,4a,4b,4c,4d,4e代替3a,卟啉化合物6代替卟啉化合物5,用相同的合成方法得到目標(biāo)化合物7b-10e。

2.2.5 抗增殖活性測(cè)試 以5-FU為陽(yáng)性對(duì)照組,卟啉化合物母體5和6以及水楊酸化合物為原型藥對(duì)照組,采用MTT法研究合成的目標(biāo)化合物7a-10e對(duì)HCT-116和A549的體外抗增殖活性。將細(xì)胞(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)消化至略微脫落,加入培養(yǎng)基吹打形成細(xì)胞懸浮液,以每孔的細(xì)胞數(shù)目大約為5×103接種至96孔板,于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。按濃度梯度以成倍稀釋的關(guān)系(128,64,…,2,1 μmol·L-1)加入待測(cè)藥物的含藥培養(yǎng)基,各濃度重復(fù)6個(gè)孔,各孔150 μL,同時(shí)設(shè)置A板光照組和B板黑暗組并做相同處置。4 h后,A板棄去原有溶液,各孔加入150 μL PBS,使用12 W紫外燈照射10 min,棄去PBS,往96孔板中重新加入新的培養(yǎng)基,各孔150 μL。培養(yǎng)48 h后,各孔加20 μL配置的MTT溶液,溫育4 h,舍棄所有溶液,各孔加入150 μL DMSO溶液搖床搖晃10 min,酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處的OD值,最終計(jì)算得出藥物的抑制率(IC50值)。

2.2.6 分子對(duì)接 PI3K和CDK是目前研究較為廣泛的靶標(biāo)蛋白。在快速增殖的腫瘤組織中PI3K的活性增強(qiáng),PI3K在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理過程中發(fā)揮重要作用,CDK對(duì)細(xì)胞增殖起關(guān)鍵作用,CDK失活能夠?qū)е掠薪z分裂的停止。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)下載CDK蛋白(PDB: 4y72)和PI3K蛋白(PDB: 1e7u),分別與篩選出的具有較好腫瘤細(xì)胞抑制活性的9b和9c用SYBYL-X 2.0軟件進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)研究。

3 結(jié)果與討論

3.1 目標(biāo)化合物的合成

3.1.1 產(chǎn)率及結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù) 化合物7a:收率為40%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.86 (d,J=7.3 Hz, 8H, pyrrole-β-H), 8.22～8.29(m, 7H, meso-Ph-H), 8.17～8.20(m, 2H, meso-Ph-H),7.73 (q,J=7.5, 6.3 Hz, 10H, meso-Ph-H), 7.16～7.29(m, 4H, Ph-H), 4.61 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 3.83 (t,J=6.1 Hz, 2H, —CH2—), -2.75 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z 理論值(C53H37N5O6+840.898 6[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 840.856 3.

化合物7b:收率為41%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.84～8.88(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.23 (dt,J=7.4, 1.2 Hz, 7H, meso-Ph-H), 8.11～8.14(m, 2H, meso-Ph-H), 7.77 (dqd,J=8.7, 7.2, 1.9 Hz, 10H, meso-Ph-H), 7.24 (s, 4H, Ph-H), 4.84 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 4.33 (t,J=5.8 Hz, 2H, —CH2—), 2.39 (p,J=6.1 Hz, 2H, —CH2—), -2.75 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C54H39N5O6+854.925 2[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 854.904 7.

化合物7c:收率為38%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.88 (d,J=10.7 Hz, 8H, pyrrole-β-H), 8.16～8.32(m, 7H, meso-Ph-H), 8.10～8.15(m, 2H, meso-Ph-H), 7.77 (qd,J=6.6, 3.4 Hz, 10H, meso-Ph-H), 7.22～7.27(m, 4H, Ph-H), 4.66 (td,J=6.1, 2.4 Hz, 2H, —CH2—), 4.24 (q,J=5.9, 5.2 Hz, 2H, —CH2—), 2.10 (dtt,J=13.8, 7.2, 3.5 Hz, 4H, —CH2—), -2.73 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C55H41N5O6+868.951 7[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 868.892 4.

化合物7d:收率為37%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.84～8.91(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.23 (dt,J=7.7, 1.3 Hz, 7H, meso-Ph-H), 8.11～8.14(m, 2H, meso-Ph-H), 7.73～7.82(m, 10H, meso-Ph-H), 7.22～7.30(m, 4H, Ph-H), 4.58 (t,J=6.6 Hz, 2H, —CH2—), 4.24 (t,J=6.1 Hz, 2H, —CH2—), 2.01 (dt,J=15.3, 6.4 Hz, 2H, —CH2—), 1.93 (dq,J=8.5, 6.7 Hz, 2H, —CH2—), 1.75～1.81(m, 2H, —CH2—), -2.75 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C56H43N5O6+882.978 3[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 882.917 5.

化合物7e:收率為39%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.84～8.91(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.23 (dt,J=7.6, 1.3 Hz, 7H, meso-Ph-H), 8.10～8.14(m, 2H, meso-Ph-H), 7.76 (qd,J=6.6, 5.0 Hz, 10H, meso-Ph-H), 7.24～7.30(m, 4H, Ph-H), 4.25 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 3.64 (t,J=6.7 Hz, 2H, —CH2—), 1.98～2.02(m, 2H, —CH2—), 1.91 (q,J= 6.9 Hz, 2H, —CH2—), 1.63～1.70(m, 4H, —CH2—), -2.75 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C57H45N5O6+897.004 9[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 897.923 8.

化合物8a:收率為48%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.78 (d,J=7.3 Hz, 8H, pyrrole-β-H), 8.24～8.31 (m, 7H, meso-Ph-H), 8.19～8.23(m, 2H, meso-Ph-H),7.71 (q,J=7.7, 6.5 Hz, 10H, meso-Ph-H), 7.25 (s, 3H, Ph-H), 4.62 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 4.59 (t,J=6.2 Hz, 2H, —CH2—), -2.76 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C53H36ClN5O6+875.343 6[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 875.302 1.

化合物8b:收率為45%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.86 (d,J=8.3 Hz, 8H, pyrrole-β-H), 8.18～8.28(m, 7H, meso-Ph-H), 8.13 (d,J=8.3 Hz, 2H, meso-Ph-H), 7.77 (qd,J=6.6, 3.6 Hz, 10H, meso-Ph-H), 7.26 (s, 3H, Ph-H), 4.84 (td,J=6.3, 2.3 Hz, 2H, —CH2—), 4.31～4.35(m, 2H, —CH2—), 2.39 (ddt,J=9.3, 6.2, 3.2 Hz, 2H, —CH2—), -2.75 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C54H38ClN5O6+889.370 2[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 889.319 3.

化合物8c:收率為46%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.78 (d,J=7.3 Hz, 8H, pyrrole-β-H), 8.11～8.25(m, 7H, meso-Ph-H), 7.95～8.09(m, 2H, meso-Ph-H), 7.72 (t,J=7.5 Hz, 10H, meso- Ph-H), 7.18～7.21(m, 3H, Ph-H), 4.57 (t,J=6.4 Hz, 2H, —CH2—), 4.39 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 1.83～1.88(m, 4H, —CH2—), -2.75 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C55H40ClN5O6+903.396 8[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 903.337 4.

化合物8d:收率為43%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.87 (d,J= 16.7 Hz, 8H, pyrrole-β-H), 8.18～8.29(m, 7H, meso-Ph-H), 8.12 (d,J=8.3 Hz, 2H, meso-Ph-H), 7.72～7.82(m, 10H, meso-Ph-H), 7.26 (d,J=8.5 Hz, 3H, Ph-H), 4.58 (t,J=6.6 Hz, 2H, —CH2—), 4.25 (t, J=6.1 Hz, 2H, —CH2—), 2.03 (q,J=7.5, 7.0 Hz, 2H, —CH2—), 1.94 (q,J=7.2 Hz, 2H, —CH2—), 1.78 (q,J= 8.5 Hz, 2H, —CH2—), -2.76 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C56H42ClN5O6+917.423 4[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 917.386 2.

化合物8e:收率為40%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.84～8.89(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.21～8.26(m, 7H, meso-Ph-H), 8.13～8.16(m, 2H, meso-Ph-H), 7.74～7.81(m, 10H, meso-Ph-H), 7.32～7.36(m, 3H, Ph-H), 4.30 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 3.67 (t,J=6.6 Hz, 2H, —CH2—), 2.01～2.07(m, 2H, —CH2—), 1.91～1.98(m, 2H, —CH2—), 1.63～1.76(m, 4H, —CH2—), -2.76 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C57H44ClN5O6+931.45[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 931.408 3.

化合物9a:收率為49%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ8.83～8.89(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.17～8.37(m, 9H, meso-Ph-H), 7.77 (d,J=8.1 Hz, 7H, meso-Ph-H), 7.32 (d,J=8.7 Hz, 4H, Ph-H), 4.65 (t,J=6.2 Hz, 2H, —CH2—), 4.57 (t,J=5.9 Hz, 2H, —CH2—), -2.78 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C53H34Cl3N5O6+944.233 8[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 944.203 7.

化合物9b:收率為50%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.81～8.92(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.08～8.16(m, 9H, meso-Ph-H), 7.69～7.78(m, 7H, meso-Ph-H), 7.28 (d,J=8.2 Hz, 4H, Ph-H), 4.40 (t,J=5.8 Hz, 2H, —CH2—), 3.93 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 2.44 (p,J=6.0 Hz, 2H, —CH2—), -2.81 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C54H36Cl3N5O6+958.260 3[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 958.219 5.

化合物9c:收率為46%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.88～8.91(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.16～8.21(m, 9H, meso-Ph-H), 7.95 (dd,J=8.1, 5.7 Hz, 7H, meso-Ph-H), 7.71 (dd,J=8.3, 2.9 Hz, 4H, Ph-H), 4.46 (t,J=5.8 Hz, 2H, —CH2—), 4.15 (t,J=6.2 Hz, 2H, —CH2—), 1.89～1.98(m, 4H, —CH2—), -2.78 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C55H38Cl3N5O6+972.286 9[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 972.225 6.

化合物9d:收率為47%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.84～8.95(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.12～8.18(m, 9H, meso-Ph-H), 7.77 (d,J=8.2 Hz, 7H, meso-Ph-H), 7.30 (d,J=8.8 Hz, 4H, Ph-H), 4.62 (t,J=6.5 Hz, 2H, —CH2—), 4.29 (t,J= 6.1 Hz, 2H, —CH2—), 2.03～2.10(m, 2H, —CH2—), 1.95～2.01(m, 2H, —CH2—), 1.81 (t,J= 7.9 Hz, 2H, —CH2—), -2.78 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C56H40Cl3N5O6+986.313 5[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 986.258 1.

化合物9e:收率為45%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.89 (d,J=4.7 Hz, 2H, pyrrole-β-H), 8.83 (d,J=4.0 Hz, 6H, pyrrole-β-H), 8.06～8.17(m, 9H, meso-Ph-H), 7.71～7.79(m, 7H, meso- Ph-H), 7.28 (d,J=8.5 Hz, 4H, Ph-H), 4.26 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 3.64 (t,J=6.6 Hz, 2H, —CH2—), 2.01 (p,J=6.6 Hz, 2H, —CH2—), 1.93 (p,J=6.8 Hz, 2H, —CH2—), 1.65～1.74(m, 4H, —CH2—), -2.81 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C57H42Cl3N5O6+1 000.340 0[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 1 000.289 3.

化合物10a:收率為53%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.74～8.83(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.17～8.37(m, 9H, meso-Ph-H), 7.75 (d,J=8.3 Hz, 7H, meso-Ph-H), 7.31 (d,J=8.6 Hz, 3H, Ph-H), 4.63 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 4.59 (t,J=6.1 Hz, 2H, —CH2—), -2.81 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C53H33Cl4N5O6+978.678 8[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 978.619 7.

化合物10b:收率為54%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.92 (d,J=4.8 Hz, 2H, pyrrole-β-H), 8.83 (d,J=2.5 Hz, 6H, pyrrole-β-H), 8.07～8.16(m, 9H, meso-Ph-H), 7.71～7.76(m, 7H, meso- Ph-H), 7.24～7.32(m, 3H, Ph-H), 4.40 (t,J=5.8 Hz, 2H, —CH2—), 3.93 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 2.44 (p,J=6.1 Hz, 2H, —CH2—), -2.82 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C54H35Cl4N5O6+992.705 4[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 992.663 1.

化合物10c:收率為48%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.85 (d,J=2.4 Hz, 8H, pyrrole-β-H), 8.21～8.25(m, 9H, meso-Ph-H), 7.89～7.92(m, 7H, meso-Ph-H), 7.56～7.61(m, 3H, Ph-H), 4.57 (t,J=6.4 Hz, 2H, —CH2—), 4.43 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 1.87～1.96(m, 4H, —CH2—), -2.81 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C55H37Cl4N5O6+1 006.732[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 1 006.702 8.

化合物10d:收率為46%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.83～8.95(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.16 (t,J=7.4 Hz, 9H, meso-Ph-H), 7.77 (d,J= 8.1 Hz, 7H, meso-Ph-H), 7.30 (d,J=8.5 Hz, 3H, Ph-H), 4.59 (t,J=6.4 Hz, 2H, —CH2—), 4.31 (t,J=6.5 Hz, 2H, —CH2—), 1.95～2.02(m, 2H, —CH2—), 1.95～2.01(m, 2H, —CH2—), 1.75～1.82(m, 2H, —CH2—), -2.79 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C56H39Cl4N5O6+1 020.759[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 1 020.714 9.

化合物10e:收率為45%,1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.90～8.94(m, 8H, pyrrole-β-H), 8.23 (t,J=7.4 Hz, 9H, meso-Ph-H), 7.71 (dd,J=8.2, 1.7 Hz, 7H, meso-Ph-H), 7.28～7.36(m, 3H, Ph-H), 4.32 (t,J=6.3 Hz, 2H, —CH2—), 3.77 (t,J=6.6 Hz, 2H, —CH2—), 2.01～2.06(m, 2H, —CH2—), 1.92～1.97(m, 2H, —CH2—), 1.66～1.74(m, 4H, —CH2—), -2.82 (s, 2H, pyrrole-NH). MS (MALDI-TOF):m/z理論值(C57H41Cl4N5O6+1 034.785[M+H]+), 實(shí)測(cè)值 1 034.706 9.

3.1.2 合成過程的影響因素 (1)在溴代醇的硝化反應(yīng)中,碳鏈長(zhǎng)的溴代醇反應(yīng)收率略高于碳鏈短的溴代醇反應(yīng)收率,由于溴是吸電子基團(tuán),因此它會(huì)減慢硝化反應(yīng)的反應(yīng)速率,隨著碳鏈長(zhǎng)度的延長(zhǎng),溴原子對(duì)反應(yīng)的影響程度越來越小。(2)在水楊酸或5-氯水楊酸與溴代硝酸酯的取代反應(yīng)中,水楊酸與溴代硝酸酯的反應(yīng)收率略高于5-氯水楊酸與溴代硝酸酯的反應(yīng)收率,這可能是因?yàn)槁仍拥奈娮诱T導(dǎo)效應(yīng)大于給電子共軛效應(yīng),總的來說會(huì)降低苯環(huán)上的電子云密度,不利于進(jìn)行親核反應(yīng)。(3)反應(yīng)最后一步合成目標(biāo)化合物,硝酸酯部分碳鏈短的水楊酸衍生物與卟啉反應(yīng)的產(chǎn)物收率比硝酸酯部分碳鏈長(zhǎng)的水楊酸衍生物與卟啉反應(yīng)的產(chǎn)物收率高一點(diǎn),原因可能是碳鏈長(zhǎng)的位阻大,不利于反應(yīng)的進(jìn)行。

3.2 抗增殖活性特征

采用MTT法對(duì)所有最終產(chǎn)物進(jìn)行抗HCT-116細(xì)胞和A549細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)。經(jīng)典抗腫瘤藥5-FU作為參比化合物。所有目標(biāo)化合物(7a-10e)、卟啉化合物(5和6)及水楊酸單體的抗增殖效果如表1所示。在光照條件下,大部分目標(biāo)化合物對(duì)HCT-116細(xì)胞和A549細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于卟啉母體化合物5和6及水楊酸單體化合物。在黑暗條件下,目標(biāo)化合物對(duì)受試細(xì)胞株的毒性相對(duì)較小。與5-氟尿嘧啶(IC50=60.05 μmol·L-1)相比,化合物9c對(duì)HCT-116細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng),IC50值為37.65 μmol·L-1。相比于5-氟尿嘧啶(IC50=78.24 μmol·L-1),化合物9b和9c對(duì)A549細(xì)胞均有較好的抑制活性,IC50值分別為66.89 和58.36 μmol·L-1。

表1 卟啉-水楊酸化合物的抗腫瘤抑制作用

3.3 分子對(duì)接效應(yīng)

化合物9b和9c的對(duì)接結(jié)果如圖2所示。從圖2(a)和(b)可以看出化合物9b和9c通過多個(gè)位點(diǎn)分別與PI3K靶蛋白進(jìn)行結(jié)合。化合物9b主要通過卟啉母核吡咯環(huán)上的氮?dú)渑c氨基酸殘基 LYS-807 形成1個(gè)氫鍵,水楊酸化合物中的NO供體部分與殘基TYR-867及LYS833形成2個(gè)氫鍵。而在化合物9c中主要通過水楊酸化合物中的含NO供體部分與氨基酸殘基 HIS-288及ARG-257形成2個(gè)氫鍵,卟啉母核與水楊酸結(jié)合處的酯基與殘基LYS-195形成1個(gè)氫鍵。從圖2(c)和(d)化合物9b和9c與CDK對(duì)接活性圖中可以看出,化合物9b和9c主要通過水楊酸化合物中的含NO供體片段與氨基酸殘基PHE147和ASP146形成2個(gè)氫鍵。由此可以看出化合物9b和9c與CDK及PI3K蛋白均具有較好的結(jié)合作用,這可能與其體內(nèi)抗腫瘤作用存在一定相關(guān)性。

4 結(jié)論

通過化學(xué)合成手段成功制備了20個(gè)未見文獻(xiàn)報(bào)道的含NO供體的卟啉-水楊酸化合物,其結(jié)構(gòu)用氫譜及質(zhì)譜進(jìn)行了確證。其中化合物9b和9c對(duì)HCT-116細(xì)胞和A549細(xì)胞均顯示出良好的體外抗增殖效果。分子對(duì)接結(jié)果顯示化合物9b及9c能很好地與CDK及PI3K靶蛋白結(jié)合,9b及9c在體內(nèi)可能通過與CDK及PI3K結(jié)合,阻斷PI3K-AKT-mTOR通路,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,從而實(shí)現(xiàn)抗癌的功效。