肖真儀,鄧 文,楊城城,劉美君,周小輝,彭雨婷,簡(jiǎn)宇軒,李 輝

(吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,中國(guó) 吉首 416000)

由于環(huán)境及生物樣品的復(fù)雜性,常規(guī)分離方法難以高效完成目標(biāo)藥物及生物質(zhì)的分離檢測(cè),迫切需要高選擇性的分離方法[1-3]。分子印跡技術(shù)在分析領(lǐng)域無(wú)疑極具吸引力,因?yàn)檫@種技術(shù)創(chuàng)造了選擇性結(jié)合位點(diǎn),將目標(biāo)分子的特征通過(guò)印跡而保留[4-6]。但該項(xiàng)技術(shù)仍有一些局限性,如高毒物質(zhì)不能用作模板制備印跡材料[7,8],模板泄露則導(dǎo)致無(wú)法正確定量測(cè)定及模板凈化[9,10]。碎片印跡技術(shù)不是采用目標(biāo)分子作模板,而是使用目標(biāo)化合物的部分結(jié)構(gòu)或片段作為模板制備印跡聚合物,這樣就可消除分子識(shí)別中的模板殘留[11-14]。

薯蕷皂苷(Dioscin)是一種具有廣闊生物活性的天然產(chǎn)物[15],常存在于一些藥用植物的根莖中,具有抗骨質(zhì)疏松、抗癌、抗炎、抗神經(jīng)變性、抗感染及抗衰老[16-19]等藥理活性,對(duì)心血管疾病、過(guò)敏性疾病、2型糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、皮膚老化及更年期癥狀有較好的預(yù)防和治療效果[20-22]。從植物中提取并分離薯蕷皂苷是獲取該化合物的主要來(lái)源,但薯蕷皂苷水溶性差[23]、生物利用度低[24,25],大大限制了薯蕷皂苷的提取和應(yīng)用?；诜肿佑≯E材料的高選擇吸附性能,將這種具有特異識(shí)別能力的印跡聚合物作為固相萃取吸附劑以實(shí)現(xiàn)對(duì)薯蕷皂苷的分離和富集是一種低成本、高效率且操作簡(jiǎn)單的分離分析技術(shù)。本工作以葡萄糖及齊墩果酸為模板碎片,采用沉淀法制備印跡聚合物,探討這種碎片印跡聚合物對(duì)目標(biāo)化合物薯蕷皂苷的吸附及提取分離效能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑及材料

薯蕷皂苷(99%,質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)、4-乙烯基吡啶(98%)、N-異丙基丙烯酰胺(98%)及交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(98%)均購(gòu)自河南省萬(wàn)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)中心有限公司;偶氮二異丁腈(98%)購(gòu)自美國(guó)阿拉丁工業(yè)公司;色譜純的正硅酸乙酯、乙腈及甲醇購(gòu)自成都金山化學(xué)試劑有限公司;分析純的乙酸、乙醇及甲苯購(gòu)自天津市永大化學(xué)試劑有限公司。葡萄糖(98%)和齊墩果酸(97%)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥生物制品檢定所。

薯蕷皂苷樣品溶液:稱(chēng)取20 g干燥的盾葉薯蕷莖[26],粉碎,浸入200 mL含30%鹽酸的乙醇-水溶液(體積比7∶3)中,超聲處理2 h,過(guò)濾,濾渣再用同樣的溶劑重復(fù)提取2次,合并提取液。減壓蒸餾除去大部分溶劑后,用少量乙酸-乙腈混合溶液(體積比2∶8)溶解,過(guò)濾除去固體物,所得溶液即為薯蕷皂苷樣品溶液,備用。

1.2 設(shè)備及儀器

S-3400N掃描電鏡(日本);WGH-30A 傅里葉紅外光譜儀(中國(guó)天津儀器有限公司);LC-40D 高效液相色譜儀和UV-2550 紫外可見(jiàn)光譜儀(日本島津公司);TD-3500 X射線(xiàn)衍射儀(上海第二光學(xué)儀器廠);高速臺(tái)式離心機(jī)TGL-16(金壇大地儀器廠);電子天平FA2104N(上海菁海儀器公司);真空干燥箱DZ-1AII(天津泰斯特儀器公司);超聲波清洗器KQ250E(昆山市超聲儀器廠);恒溫水浴鍋GSY-Ⅱ(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)。

1.3 薯蕷皂苷印跡聚合物的制備

將一定量的模板分子加入到10 mL甲苯-甲醇(體積比為4∶1)混合溶劑中,超聲處理5 min,加入0.3 mmol 4-乙烯基吡啶、0.3 mmol N-異丙基丙烯酰胺、10.0 mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯及20.0 mg偶氮二異丁腈。再用超聲波處理5 min,通入氮?dú)馓幚?5 min,密封,反應(yīng)體系置于333 K油浴鍋中反應(yīng)24 h后,將混合物加入到50.0 mL 20%乙酸-甲醇混合溶液中,靜置4 h后,除去上層清液,再用同樣體積的乙酸-甲醇混合溶液重復(fù)浸泡2次,過(guò)濾,固體置于真空干燥箱中干燥12 h,即得薯蕷皂苷印跡聚合物。制備非印跡聚合物(NIP)時(shí),除不加模板分子外,其他步驟與印跡聚合物的制備步驟相同。各印跡聚合物模板的類(lèi)型及用量參見(jiàn)表1。當(dāng)用葡萄糖或齊墩果酸為模板時(shí),分子印跡聚合物的命名為GL-MIP或OL-MIP。

表1 碎片印跡聚合物的制備a

1.4 紅外光譜分析

樣品置于373 K真空干燥箱中干燥4 h,然后測(cè)試分子印跡聚合物和非印跡聚合物的紅外光譜圖。

1.5 電鏡分析

測(cè)試分子印跡聚合物和非印跡聚合物的電鏡圖,觀察顆粒大小和表面形貌。

1.6 吸附測(cè)試

1.6.1 吸附動(dòng)力學(xué) 在20 mL 0.10 g·L-1薯蕷皂苷的乙腈溶液中,加入20 mg分子印跡聚合物,吸附開(kāi)始后,每間隔0.5 h后,取少量上清液,用HPLC測(cè)定上清液中薯蕷皂苷的質(zhì)量濃度,按方程(1)計(jì)算不同時(shí)間下分子印跡聚合物的吸附量Qt(mg·g-1)。平行測(cè)定3次,取其平均值。

(1)

式中,c0和ct分別為薯蕷皂苷的初始質(zhì)量濃度和吸附t時(shí)間后的質(zhì)量濃度,g·L-1;V為溶液的體積,mL;m為吸附劑的質(zhì)量,g。

1.6.2 吸附等溫線(xiàn) 在5.0 mL濃度不同的薯蕷皂苷-乙腈溶液中,分別加入5 mg分子印跡聚合物,吸附4 h后,用HPLC法測(cè)定各溶液中薯蕷皂苷濃度。按方程(2)—(4)計(jì)算(Qe,mg/g)、分布系數(shù)KD(mL·g-1)及選擇因子α。

(2)

(3)

(4)

其中c0和ce分別為薯蕷皂苷的初始濃度和平衡濃度,g·L-1;V為溶劑體積,mL;m為吸附劑質(zhì)量, g。KD(template)和KD(analogue)分別為模板及類(lèi)似物的分布系數(shù)。

1.7 分子印跡固相萃取

1.7.1 萃取柱的制備 取一根底端裝有篩板的萃取用空柱管,用甲醇和去離子水洗凈,晾干,稱(chēng)取1.5 g薯蕷皂苷印跡聚合物,均勻裝填到柱中,在裝填過(guò)程中邊裝填邊輕輕敲打柱管,使聚合物填充均勻、緊實(shí)。然后,依次用10 mL甲醇及10 mL乙腈溶液流過(guò)固相萃取柱,去除聚合物中雜質(zhì),使萃取柱活化,備用。

1.7.2 上樣和洗脫 取3.0 mL樣品溶液上樣,下端用真空抽吸,收集流出液。上樣后依次用2×1 mL 乙腈、2×1 mL 乙酸乙酯、5×1 mL H2O-C2H5OH(體積比1∶1)混合液、5×1 mL H2O-CH3OH(體積比1∶1)混合液、5×1 mL甲醇、3×1 mL甲醇-乙酸(體積比8∶2)進(jìn)行洗滌和洗脫,分別收集各淋洗與洗脫步驟的流出液,進(jìn)行HPLC分析。

1.8 高效液相色譜分析

高效液相色譜分析在C18柱上進(jìn)行,以乙腈-水(體積比9∶1)混合溶劑為流動(dòng)相,流速為1.0 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm,進(jìn)樣體積為10 μL。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法進(jìn)行定性和定量。薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為:

Y=9 332.3c-12.24,R2=0.999 0。

式中:Y為峰面積;c為底物濃度,g ·L-1;R2為相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡聚合物的制備和表征

根據(jù)薯蕷皂苷的分子結(jié)構(gòu)(如圖1所示),葡萄糖及齊墩果酸為目標(biāo)分子中的部分結(jié)構(gòu)或具有部分相似的結(jié)構(gòu),以這兩種碎片分子作為模板,采用沉淀聚合法制備了分子印跡聚合物。4-乙烯基吡啶和N-異丙基丙烯酰胺為混合功能單體,二者均可與模板分子中的羥基形成氫鍵復(fù)合物。為了考察碎片印跡聚合物對(duì)目標(biāo)化合物薯蕷皂苷的分子識(shí)別能力,在制備時(shí),其他單體及用量與制備條件均固定不變,僅改變模板的類(lèi)型及用量。

圖1 幾種化合物的分子結(jié)構(gòu)

分別以葡萄糖或齊墩果酸為模板,考察不同模板用量下分子印跡聚合物的分布系數(shù)KD (Dioscin)。為便于比較,將非印跡聚合物的分布系數(shù)也列入其中。從表1中的結(jié)果可以看出,無(wú)論是以葡萄糖還是齊墩果酸為模板,也不管模板用量的多少,制備的分子印跡聚合物的分布系數(shù)明顯高于非印跡聚合物。這表明以葡萄糖或齊墩果酸為模板時(shí),在印跡聚合物基體中形成了可對(duì)薯蕷皂苷具備選擇作用的識(shí)別位點(diǎn)。在制備過(guò)程中,當(dāng)模板分子葡萄糖或齊墩果酸的用量增加時(shí),分子印跡材料的分布系數(shù)增加,但當(dāng)葡萄糖用量超過(guò)0.3 mmol,齊墩果酸用量超過(guò)0.4 mmol時(shí),分子印跡聚合物的分布系數(shù)變化不大。顯然,當(dāng)模板用量過(guò)低時(shí),在聚合物基體中形成的印跡位點(diǎn)過(guò)少,不利于印跡聚合物的分子吸附。但印跡聚合物的分布系數(shù)也并非完全與模板用量成正比,這可能是由于當(dāng)模板濃度較高時(shí),易形成模板分子低聚物,從而改變印跡空穴的大小和形狀,引起印跡空穴-薯蕷皂苷分子間的適應(yīng)性降低所致。由于葡萄糖分子及齊墩果酸分子均含有與目標(biāo)化合物薯蕷皂苷分子相似的分子碎片,于是,使用二者的混合物為模板制備印跡材料。采用因子設(shè)計(jì),考察在不同葡萄糖用量及齊墩果酸用量間的交互作用下,所得分子印跡材料的分布系數(shù)。結(jié)果顯示,在齊墩果酸用量固定時(shí),印跡材料的分布系數(shù)與葡萄糖用量呈現(xiàn)了一定的正相關(guān)性。當(dāng)二者用量均為0.6 mmol時(shí),所得印跡材料的分布系數(shù)并非最高,而當(dāng)葡萄糖和齊墩果酸的用量分別為0.6和0.1 mmol時(shí),分子印跡聚合物(GL-OL-MIP4)的分布系數(shù)最大,其值為368.2 mL·g-1。采用混合碎片作為模板,由于此方式增加了識(shí)別位點(diǎn)類(lèi)型,有助于提高印跡材料的吸附性能。但值得注意的是,這種交互作用也顯示了兩種碎片對(duì)印跡材料的分子識(shí)別具有不同程度的影響。

圖2 分子印跡聚合物(GL-OL-MIP4)及非印跡聚合物(NIP)的紅外光譜

圖3 分子印跡聚合物(GL-OL-MIP4)及非印跡聚合物(NIP)的掃描電鏡圖

2.2 分子印跡聚合物的吸附性能

2.2.1 等溫吸附 設(shè)定溫度為30 ℃,測(cè)試分子印跡聚合物(GL-OL-MIP4)對(duì)目標(biāo)化合物薯蕷皂苷的等溫吸附能力。如圖4所示,碎片印跡聚合物對(duì)薯蕷皂苷具有較強(qiáng)的吸附能力,其飽和吸附量約為34.67 mg·g-1,遠(yuǎn)高于非印跡材料NIP(其飽和吸附量約為14.59 mg·g-1)。當(dāng)?shù)孜餄舛认嗤瑫r(shí),印跡材料的吸附能力均強(qiáng)于非印跡聚合物,這可能源于碎片分子的印跡孔穴對(duì)目標(biāo)化合物有分子識(shí)別作用。這也顯示了目標(biāo)分子碎片在分子印跡識(shí)別應(yīng)用中的可能性。

圖4 分子印跡聚合物(GL-OL-MIP4)的吸附等溫線(xiàn)

為了探討碎片印跡材料中結(jié)合位點(diǎn)特征,對(duì)所得碎片印跡聚合物的吸附等溫值進(jìn)行Scatchard分析,以研究其結(jié)合位點(diǎn)分布。采用方程(5)對(duì)等溫吸附數(shù)據(jù)進(jìn)行線(xiàn)性擬合,得到如圖5所示的直線(xiàn)圖,其中分子印跡聚合物(GL-OL-MIP4)的Scatchard分析線(xiàn)圖表明該印跡基體中主要存在兩類(lèi)吸附位點(diǎn),根據(jù)直線(xiàn)的斜率和截距可以計(jì)算出最大表觀位點(diǎn)數(shù)目(Qmax)及平衡離解常數(shù)(Kd)。而非印跡聚合物基體中主要存在一類(lèi)吸附位點(diǎn)。表2給出了印跡及非印跡材料基體中各類(lèi)吸附位點(diǎn)的Qmax和Kd。對(duì)于GL-OL-MIP4印跡聚合物基體中的高親和位點(diǎn),Qmax和Kd分別為1.762×10-4mol·g-1和1.970×10-4mol·L-1,而低親和位點(diǎn),其值分別為9.441×10-5mol·g-1和3.782×10-5mol·L-1;對(duì)于NIP,Qmax和Kd分別為5.501×10-5mol·g-1和1.763×10-4mol·L-1。

表2 吸附等溫值的Scatchard分析

(5)

2.2.2 吸附選擇性 考察印跡材料對(duì)模板薯蕷皂苷及相關(guān)化合物薯蕷皂苷元、重樓皂苷及重樓皂苷元(分子結(jié)構(gòu)示于圖1)的靜態(tài)吸附,測(cè)試碎片印跡聚合物GL-OL-MIP4的吸附選擇性,得到表3。薯蕷皂苷提取物中常含有這些化合物,測(cè)定印跡聚合物對(duì)目標(biāo)的選擇性可為提取分離目標(biāo)化合物提供基礎(chǔ)。從表中結(jié)果可以看出,印跡材料對(duì)目標(biāo)化合物薯蕷皂苷具有一定的選擇性,最高選擇因子為1.356。選擇性不夠高的原因在于這些相關(guān)化合物的分子結(jié)構(gòu)中都含有與碎片模板的類(lèi)似結(jié)構(gòu)。但印跡材料仍對(duì)目標(biāo)化合物具有較高的吸附選擇性。

表3 分子印跡聚合物(GL-OL-MIP4)對(duì)目標(biāo)化合物薯蕷皂苷的選擇性

2.3 分子印跡固相萃取

2.3.1 模擬樣品溶液的固相萃取 以分子印跡聚合物GL-OL-MIP4為固相萃取吸附劑,考察其對(duì)含0.1 g·L-1的薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元、重樓皂苷及重樓皂苷元模擬混合溶液中目標(biāo)化合物薯蕷皂苷的提取分離效能。取一定體積(3.0 mL)的模擬樣品溶液上樣,收集流出液,測(cè)定流出液中薯蕷皂苷濃度,計(jì)算裝載量。依次用2×1 mL 乙腈、2×1 mL 乙酸乙酯、5×1 mL H2O-C2H5OH(體積比1∶1,下同)混合液、5×1 mL H2O-CH3OH(1∶1)混合液、5×1 mL甲醇、3×1 mL甲醇-乙酸(8∶2)進(jìn)行洗滌和洗脫,提取過(guò)程中,分別收集各淋洗與洗脫步驟的流出液,而后進(jìn)行HPLC分析,計(jì)算各步驟中薯蕷皂苷回收率。結(jié)果如表4所示?？梢园l(fā)現(xiàn),當(dāng)使用分子印跡聚合物萃取時(shí),用2×1 mL 乙腈和2×1 mL乙酸乙酯進(jìn)行洗滌,主要洗滌雜質(zhì)化合物,僅有少量的目標(biāo)化合物脫出。而用5×1 mL H2O-C2H5OH(1∶1)混合液和5×1 mL H2O-CH3OH(1∶1)混合液進(jìn)行洗脫時(shí),可以回收大部分目標(biāo)化合物(薯蕷皂苷回收率達(dá)86.01%),薯蕷皂苷得到了有效富集和分離。而非印跡聚合物富集和分離效能較低。另外,分子印跡固相萃取的總回收率達(dá)99.66%,顯示了較好應(yīng)用效能。

表4 分子印跡聚合物固相萃取

2.3.2 實(shí)際樣品的固相萃取 取5.0 mL的樣品溶液上樣,收集流出液,靜置3 min后,按照模擬樣品溶液的萃取方式,依次用2×1 mL 乙腈、2×1 mL 乙酸乙酯、5×1 mL H2O-C2H5OH(1∶1)混合液、5×1 mL H2O-CH3OH(1∶1)混合液、5×1 mL甲醇、3×1 mL甲醇-乙酸(8∶2)進(jìn)行洗滌和洗脫,提取過(guò)程中,分別收集用5×1 mL H2O-C2H5OH(1∶1)和5×1 mL H2O-CH3OH(1∶1)混合液洗脫時(shí)的流出液,合并流出液,減壓蒸餾除去大部分溶劑后,再用少量乙醇溶解,HPLC法測(cè)定產(chǎn)品中薯蕷皂苷含量。圖6給出了樣品溶液及分子印跡固相萃取提取液的高效液相色譜圖。保留時(shí)間為17.85 min的色譜峰為薯蕷皂苷?？梢园l(fā)現(xiàn),對(duì)于成分較為復(fù)雜的樣品溶液(顯示多色譜峰,見(jiàn)圖6a)經(jīng)分子印跡固相萃取和分離后,產(chǎn)品中雜質(zhì)峰大幅減少(圖6b)。粗提物中的薯蕷皂苷得到了較好的分離和純化,顯示了分子印跡聚合物提取樣品溶液中的薯蕷皂苷時(shí),具有較好的提取分離應(yīng)用效能。

圖6 盾葉薯蕷粗提液及分子印跡固相萃取產(chǎn)物的HPLC圖

2.4 重現(xiàn)性測(cè)試

為了測(cè)定分子印跡聚合物的重復(fù)使用性能。將1.0 g分子印跡聚合物加入到5.0 mL質(zhì)量濃度為0.6 g·L-1的薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)溶液中,吸附4 h后,過(guò)濾,計(jì)算吸附量。固體用甲醇-乙酸(9∶1)混合溶液洗凈吸附在聚合物上的目標(biāo)化合物,過(guò)濾后將固體重新加入到5 mL等濃度的模板溶液中,吸附、過(guò)濾,測(cè)定吸附量。重復(fù)操作10次。每次使用后,印跡聚合物的吸附量標(biāo)示于圖7中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)吸附量改變不大,可以重復(fù)使用。

圖7 分子印跡聚合物使用重現(xiàn)性

3 結(jié)論

以葡萄糖及齊墩果酸為模板碎片,4-乙烯基吡啶-N-異丙基丙烯酰胺為共同功能單體,制備了一種可用于選擇提取薯蕷皂苷的碎片印跡微球。當(dāng)兩種模板碎片(葡萄糖和齊墩果酸)用量分別為0.6和0.1 mmol時(shí),所得印跡聚合物GL-OL-MIP4的分布系數(shù)最大(其值為368. 2 mL·g-1)。該印跡微球平均粒徑約11.3 μm,對(duì)薯蕷皂苷具有較強(qiáng)的吸附能力,飽和吸附量約34.67 mg·g-1。Scatchard分析表明這種碎片印跡材料(GL-OL-MIP4)主要有兩類(lèi)親和位點(diǎn),其中,高親和位點(diǎn)的表觀鍵合位點(diǎn)數(shù)目Qmax和吸附離解常數(shù)Kd分別為1.762×10-4mol·g-1和1.970×10-4mol·L-1;對(duì)于低親和位點(diǎn),其值分別為9.441×10-5mol·g-1和3.782×10-5mol·L-1。印跡材料對(duì)目標(biāo)化合物薯蕷皂苷具有一定的選擇性,選擇因子為1.356。當(dāng)使用該印跡聚合物為吸附劑固相萃取分離盾葉薯蕷中的薯蕷皂苷時(shí),在洗脫步驟中用5×1 mL H2O-C2H5OH(1∶1)混合液和5×1 mL H2O-CH3OH(1∶1)混合液洗脫時(shí),可以回收86.01%的目標(biāo)化合物,薯蕷皂苷得到了有效富集和分離,總回收率達(dá)99.66%。薯蕷皂苷經(jīng)分子印跡萃取和分離后,產(chǎn)品中雜質(zhì)大幅減少,薯蕷皂苷得到了較好的分離和純化。另外,該種印跡聚合物可重復(fù)使用,吸附量改變不大。