王昌祿, 王旭鋒, 丁成芳, 丁文濤, 郭慶彬

(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457)

紅曲霉是一種絲狀真菌,將紅曲霉接種于大米發(fā)酵而成的紅曲米在中國(guó)及周邊國(guó)家擁有上千年的食用歷史。紅曲霉以其豐富的有益代謝產(chǎn)物(如紅曲色素、莫納克林K、γ-氨基丁酸、麥角甾醇和紅曲多糖等)[1],在食品、藥品及化妝品等工業(yè)領(lǐng)域有較大的應(yīng)用潛力,受到了全球的廣泛關(guān)注。

分子生物學(xué)技術(shù)和組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,為紅曲霉的研究和提高其生產(chǎn)性能提供了有效手段[2]。組學(xué)是研究生物體各種組分之間關(guān)系的學(xué)科,強(qiáng)調(diào)從整體的角度出發(fā)去研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)、基因、蛋白及其分子間相互作用,以掌握DNA、RNA、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物的基本狀態(tài),從而對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行全面解讀。組學(xué)包括基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、脂類組學(xué)、免疫組學(xué)及糖組學(xué)等。目前,已經(jīng)對(duì)十余個(gè)紅曲霉基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析和研究,有近百篇與紅曲霉生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)文獻(xiàn)作為支撐,為闡明紅曲霉的代謝機(jī)制提供了有力的數(shù)據(jù)支持。通過對(duì)紅曲霉組學(xué)技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)闡述,可以幫助人們?nèi)媪私饨M學(xué)技術(shù)在紅曲霉研究和應(yīng)用中的重要作用。因此,本研究系統(tǒng)闡述了基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等組學(xué)技術(shù)在紅曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物研究中的最新進(jìn)展,以期為進(jìn)一步開發(fā)利用紅曲霉基因資源、對(duì)紅曲霉進(jìn)行深入研究及其代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)和應(yīng)用提供參考。

1 組學(xué)技術(shù)在紅曲霉研究中應(yīng)用的熱點(diǎn)

以Web of Science(WOS)數(shù)據(jù)庫(kù)為例,分析了近20年紅曲霉組學(xué)研究的文獻(xiàn)及其關(guān)鍵詞。紅曲霉組學(xué)研究按研究方法可分為基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué),其中,轉(zhuǎn)錄組學(xué)文獻(xiàn)占比超過45%,是紅曲霉組學(xué)研究中最常用的技術(shù),表明轉(zhuǎn)錄組學(xué)在紅曲霉研究中占據(jù)十分重要地位。此外,多組學(xué)聯(lián)用是近年來紅曲霉研究的一個(gè)熱點(diǎn)趨勢(shì),尤其是各組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)用的研究,在紅曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物代謝調(diào)控機(jī)制分析及新型調(diào)控因子挖掘方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

通過關(guān)鍵詞出現(xiàn)頻率對(duì)紅曲霉研究的熱點(diǎn)主題進(jìn)行了解析,研究最多的紅曲霉種類分別為紅色紅曲霉(Monascusruber)、紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)和叢毛紅曲霉(Monascuspilosus);研究最廣泛的次級(jí)代謝產(chǎn)物依次為紅曲色素(monascus pigments,MPs)、桔霉素(citrinin,Cit)和莫納克林K(monacolin K,MK),色素和桔霉素是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問題,如何在紅曲色素等相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)中控制其安全性仍然是目前紅曲霉在食品工業(yè)等領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用的主要研究方向之一。

2 組學(xué)技術(shù)在紅曲霉研究中的應(yīng)用

2.1 基因組學(xué)

2.1.1種屬進(jìn)化分析

微生物基因組學(xué)已經(jīng)非常成熟的應(yīng)用于微生物種群分析、種屬間差異和進(jìn)化地位分析等研究中。Chen等[3]研究了食品加工與安全領(lǐng)域具有代表性的12種絲狀真菌,并對(duì)它們的tRNA基因分布、密碼子使用模式和氨基酸組成等基因組特征進(jìn)行了比較研究,發(fā)現(xiàn)紅曲霉與曲霉屬親緣性較近。Houbraken等[4]進(jìn)一步通過系統(tǒng)發(fā)育分析證實(shí)了紅曲霉基因組序列與曲霉屬關(guān)系密切。

2.1.2次級(jí)代謝基因簇預(yù)測(cè)及功能解析

通過基因敲除等分子生物學(xué)手段,已基本確定了紅曲霉3種主要次級(jí)代謝產(chǎn)物——MPs、MK及Cit的生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters,BGC)及其合成途徑[2]。然而,通過解析不同亞種的紅曲霉菌株的基因組及其代謝產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)不同菌株之間代謝產(chǎn)物差異較大,且次級(jí)代謝產(chǎn)物BGC也發(fā)生了明顯分化[5],這表明紅曲霉基因組差異是代謝產(chǎn)物多樣化的重要原因之一。研究者分別從基因組學(xué)的角度進(jìn)一步補(bǔ)充和豐富了MPs合成代謝的基因簇功能及代謝調(diào)控因子[6-7]。Dai等[8]利用基因組學(xué)解析了4株紅曲霉MK合成相關(guān)基因在BGC上的差異,發(fā)現(xiàn)M.pilosusYDJ-1菌株缺失部分基因。同時(shí),與土曲霉洛伐他汀(lovastatin,LOV)基因簇相比,紅曲霉MK的BGC規(guī)模較小。隨著更多紅曲霉基因組被測(cè)序[9-10],研究者發(fā)現(xiàn)MPs、MK和Cit的合成基因簇在種間存在普遍的基因丟失事件,其中Cit基因簇的丟失最為嚴(yán)重[10]。此外,Liu等[11]根據(jù)生物合成基因簇分布和系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果,建立了一個(gè)新的分類系統(tǒng),將26個(gè)紅曲霉菌株劃分為A、B和C三大類,其中B類是Cit缺陷菌株,遺傳上不能合成Cit。此外,研究還發(fā)現(xiàn),MK和Cit在基因表達(dá)上似乎是互斥的。而A類中一株紅曲霉(M.sanguineus)同時(shí)缺失Cit和MK合成能力,為MPs菌株的選育提供了參考。因此,紅曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物BGC的丟失在紅曲霉進(jìn)化中廣泛存在,可能是營(yíng)養(yǎng)和能量競(jìng)爭(zhēng)的適應(yīng)性選擇。

越來越多的研究者通過比較泛基因組學(xué)方法分析了不同菌株MPs的合成和代謝的差異,同時(shí),預(yù)測(cè)和解析了大量與MPs合成相關(guān)的基因[5,12-13]。此外,基因組學(xué)常用于挖掘潛在的候選功能基因,探究其對(duì)紅曲霉生長(zhǎng)發(fā)育和次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的影響[6,14]。基因組序列分析大大促進(jìn)了紅曲霉種屬進(jìn)化解析、次級(jí)代謝產(chǎn)物調(diào)控以及功能基因挖掘工作,可加深對(duì)紅曲霉遺傳和代謝的認(rèn)識(shí),有助于選育高產(chǎn)和更加安全穩(wěn)定的MPs等代謝產(chǎn)物有關(guān)的紅曲霉工業(yè)菌株。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)

2.2.1基因簇的邊界校準(zhǔn)

紅曲霉色素BGC基因圖譜已經(jīng)基本確定,但由于不同菌株之間基因簇的基因存在缺失、突變等復(fù)雜特性,導(dǎo)致單獨(dú)使用基因組學(xué)分析在BGC功能預(yù)測(cè)中通常存在偏差。Liu等[15]采用計(jì)算分析和轉(zhuǎn)錄組分析相結(jié)合的方法來預(yù)測(cè)紅曲霉M7中MPs的BGC分布,結(jié)合基因敲除驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)BGC由16個(gè)基因組成,從mrpigA延伸到mrpigP,外側(cè)較近區(qū)域的基因不屬于BGC的范圍。由此可見,單純的基因組生物信息學(xué)預(yù)測(cè)不能完整展現(xiàn)真實(shí)BGC,引入轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)校準(zhǔn)基因組預(yù)測(cè)結(jié)果可以更準(zhǔn)確地確定次級(jí)代謝產(chǎn)物BGC的真實(shí)邊界。

2.2.2微生物互作關(guān)系分析

由紅曲霉和黑曲霉等共發(fā)酵獲得紅曲米的生產(chǎn)方式已經(jīng)持續(xù)了上千年,但對(duì)紅曲米中共生微生物相互影響的作用機(jī)制尚未被有效證實(shí)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是當(dāng)前從分子水平解析微生物代謝調(diào)控機(jī)制的常用手段之一,轉(zhuǎn)錄組學(xué)的特性要求其追求樣本較高的純凈度,而從混合菌種樣品中分離出單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄本幾乎不可實(shí)現(xiàn)。Yuan等[16]巧妙設(shè)計(jì)了雙面細(xì)胞培養(yǎng)皿(double-sided petri dish,DSPD),研究了紅曲霉和黑曲霉自然共培養(yǎng)現(xiàn)象,發(fā)現(xiàn)二者是共生而非拮抗關(guān)系,且紅曲霉可促進(jìn)黑曲霉孢子的生成,黑曲霉可以影響紅曲霉胞內(nèi)、外MPs的種類。DSPD方法通過物理隔離方式克服了真菌共培養(yǎng)研究中的真菌生長(zhǎng)速度不同、樣品分離困難等問題,成功獲得了兩種曲霉的轉(zhuǎn)錄本。遺憾的是,尚未見關(guān)于該研究中由轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)二者作用機(jī)制探討的報(bào)道。DSPD方法展現(xiàn)了其在研究微生物相互作用,特別是揭示了真菌間相互作用的潛在價(jià)值。

2.2.3環(huán)境因子及其代謝調(diào)控機(jī)制分析

2.2.3.1 化學(xué)調(diào)控因子

培養(yǎng)基組分作為微生物所需的營(yíng)養(yǎng)成分,可為紅曲霉生長(zhǎng)發(fā)育、次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成提供必要的物質(zhì)和能量來源,同時(shí),在一定條件下也是一種環(huán)境刺激信號(hào),參與紅曲霉各項(xiàng)生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)。已報(bào)道的對(duì)紅曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物合成有顯著調(diào)節(jié)作用的營(yíng)養(yǎng)成分有單糖、淀粉、甘油等碳源,氨及銨鹽、硝酸鹽、蛋白胨等氮源。研究表明,糖酵解、丙酮酸代謝及三羧酸循環(huán)為MPs等次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成提供了前體物質(zhì)——乙酰輔酶A和丙酰輔酶A[7,17-18],而氮代謝過程也可直接或間接連接到三羧酸循環(huán)關(guān)鍵代謝環(huán)節(jié)[19],三羧酸循環(huán)是關(guān)聯(lián)初級(jí)代謝和次級(jí)代謝的關(guān)鍵樞紐。通過調(diào)節(jié)碳源的比例抑制中心碳代謝可以增加乙酰輔酶A庫(kù),有助于提高M(jìn)Ps的產(chǎn)量[12]。而琥珀酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物,外源添加琥珀酸可顯著下調(diào)紅曲霉脂肪酸生物合成相關(guān)基因的表達(dá),同時(shí)上調(diào)丙酮酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)。通過對(duì)乙酰輔酶A生物合成代謝途徑的競(jìng)爭(zhēng)調(diào)節(jié),進(jìn)而提高M(jìn)Ps的產(chǎn)量[20]。此外,適當(dāng)?shù)牡捶N類和水平不僅可以促進(jìn)MPs的合成,而且還可以減少Cit的含量。深層發(fā)酵中以NH4Cl或NH4NO3為唯一氮源可顯著提高M(jìn)Ps(尤其是橙色素和紅色素)的產(chǎn)量并降低Cit的含量。轉(zhuǎn)錄組學(xué)表明,無機(jī)氮源可通過促進(jìn)MPs前體的合成、降低Cit聚酮合酶的轉(zhuǎn)錄水平,降低Cit的合成[21]。而硝酸鹽通過上調(diào)mpigsA、mpigsH、mpigsK、mpigsL和mpigsP基因的表達(dá),促進(jìn)親水性黃色MPs的生物合成[22]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合蛋白組學(xué)分析表明,這可能是MPs生物合成途徑(碳分解代謝、氨基酸代謝、聚酮合成和脂肪酸代謝)和分泌相關(guān)(細(xì)胞膜麥角甾醇生物合成和轉(zhuǎn)運(yùn))通路的上調(diào)表達(dá)共同作用的結(jié)果。

2.2.3.2 物理調(diào)控因子

光是調(diào)節(jié)真菌各種生理過程的重要環(huán)境因子。研究表明,紅光、綠光和藍(lán)光均可影響紅曲霉的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝活動(dòng)。已經(jīng)在紅曲霉中發(fā)現(xiàn)了紅光和綠光的受體蛋白,但目前尚未發(fā)現(xiàn)藍(lán)光蛋白。然而,轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明,低劑量藍(lán)光通過上調(diào)芳香族氨基酸和支鏈氨基酸降解途徑、脂肪酸的β-氧化等途徑,可促進(jìn)MPs生物合成前體(乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A)及能量(ATP和NADH)的供應(yīng),進(jìn)而促進(jìn)MPs的合成。而在高劑量藍(lán)光條件下會(huì)誘導(dǎo)紅曲霉分生孢子生長(zhǎng),體現(xiàn)對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)的應(yīng)激防御[23]。這些結(jié)果表明,紅曲霉中可能存在與粗糙脈孢霉完全不同的藍(lán)光受體[24],需要進(jìn)一步的研究。

靜磁場(chǎng)(static magnetic field,SMF)可提高紅曲霉初級(jí)代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,同時(shí)影響MPs、Cit和麥角甾醇生物合成途徑中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明,這種作用與有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。SMF通過MAPK信號(hào)通路,影響信息素應(yīng)答通路、細(xì)胞壁完整性通路、高滲透壓通路和絲狀生長(zhǎng)通路中大多數(shù)基因的轉(zhuǎn)錄水平,通過MAPK級(jí)聯(lián)的順序激活來激活下游轉(zhuǎn)錄因子,將SMF刺激與廣泛的細(xì)胞反應(yīng)聯(lián)系起來[25]。已有研究表明,藍(lán)光和SMF或存在協(xié)同調(diào)控作用[26],而轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明,MAPK信號(hào)通路顯著影響了二者作為環(huán)境信號(hào)的刺激應(yīng)答[24-25],這或許有助于新型藍(lán)光受體的挖掘和驗(yàn)證。

2.2.3.3 生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控因子

真菌多糖是構(gòu)成真菌細(xì)胞壁的重要組分,在生長(zhǎng)發(fā)育、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、抵抗不良環(huán)境及控制物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等方面發(fā)揮了重要作用。幾丁質(zhì)是紅曲霉細(xì)胞壁的重要組分,研究表明,缺失幾丁質(zhì)合成酶基因VI(chs6)可導(dǎo)致紅曲霉氣生菌絲短而稀疏,進(jìn)而顯著降低活性孢子的發(fā)芽率,同時(shí)增加其對(duì)環(huán)境的敏感性[27]。比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn),與孢子發(fā)育和生長(zhǎng)相關(guān)的途徑(包括MAPK信號(hào)途徑、幾丁質(zhì)生物合成途徑以及調(diào)節(jié)因子LaeA和WetA)在發(fā)酵早期顯著下調(diào),Cit等次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成相關(guān)的基因表達(dá)也顯著下調(diào)。Xie等[28]利用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)探討了紅曲霉胞外多糖(extracellular polysaccharide,EPS)的生物合成機(jī)制,結(jié)果顯示,17種關(guān)鍵酶與EPS合成有關(guān);與發(fā)酵2 d組相比,發(fā)酵4 d組差異表達(dá)基因主要集中在12個(gè)碳水化合物代謝亞類;但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),只有9個(gè)碳水化合物代謝子類中發(fā)生了富集,表明紅曲霉EPS的生物合成主要發(fā)生在碳水化合物代謝過程中。這些研究為紅曲霉中基于多糖的細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育的研究提供了基因水平的重要參考。

2.2.4新轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的挖掘

得益于組學(xué)高通量測(cè)序和通路注釋,近年來在紅曲霉中相繼發(fā)現(xiàn)了許多新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。如酵母蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)子、ATP檸檬酸裂解酶、G蛋白亞基、MAPK、群體感應(yīng)分子、促分裂素原活化蛋白激酶等。

酵母蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)子(yeast protein transports,Ypts),也稱為Ras相關(guān)結(jié)合GTPases(Rab),是小GTPases家族中最大的一組,已在真核細(xì)胞模型中被廣泛研究,并在膜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。紅曲霉中,Ypts同源基因mrypt7的缺失會(huì)導(dǎo)致菌絲徑向生長(zhǎng)速度減慢、細(xì)胞內(nèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量顯著增加。轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)一步表明,紅曲霉中MRYPT7蛋白可與許多參與紅曲霉M7生長(zhǎng)、分生孢子發(fā)生、次生代謝生物合成和運(yùn)輸?shù)幕蛳鄥f(xié)調(diào)。結(jié)合Ypt7同源物對(duì)其他真菌的類似作用,推測(cè)Ypt7是真菌中的一個(gè)全局調(diào)控因子[29]。

ATP檸檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)在乙酰輔酶A的形成中起著關(guān)鍵作用,乙酰輔酶A是MPs生物合成的關(guān)鍵前體。Long等[30]研究了acl1和acl2基因,通過過表達(dá)acl1和acl2顯著增加ACL活性,導(dǎo)致乙酰輔酶A水平升高,并顯著提高了MPs總產(chǎn)量。轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分析表明,MPs合成過程中乙酰CoA和紅色MPs胺化過程中NH3的代謝通量密切相關(guān),即ACL通過調(diào)節(jié)碳代謝和氨基酸代謝來調(diào)節(jié)紅曲霉MPs的合成。

異源三聚體G蛋白信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)真菌的多種生物過程。Lei等[31]研究了紅曲霉M7 G蛋白3個(gè)α-亞基的功能。結(jié)合單基因和雙基因敲除及其轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù),系統(tǒng)地分析和比較了Mga1～3的作用。研究表明,所有3個(gè)G蛋白α-亞基共同調(diào)節(jié)紅曲霉M7的生物過程,其中Mga1起主要作用,而Mga2和Mga3起補(bǔ)充作用。這些研究有助于深入了解不同G蛋白α-亞基對(duì)絲狀真菌生長(zhǎng)、發(fā)育和次生代謝的影響。

MAPK是真核生物信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一,調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、對(duì)環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理和病理過程,在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在紅曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物合成調(diào)控中,已有多種代謝調(diào)控模型指向MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,例如紅曲霉響應(yīng)藍(lán)光[23]和磁場(chǎng)信號(hào)[25]刺激觸發(fā)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在較高強(qiáng)度的信號(hào)刺激時(shí),可能通過觸發(fā)MAPK信號(hào)通路,進(jìn)而提高多種次級(jí)代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,調(diào)控MPs、Cit等次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。然而,目前紅曲霉中完成觸發(fā)MAPK信號(hào)通路的感應(yīng)分子尚未被發(fā)現(xiàn),MAPK信號(hào)通路末端直接參與調(diào)控次級(jí)代謝基因簇轉(zhuǎn)錄表達(dá)的受體因子也未被證實(shí)。因此,紅曲霉中MAPK信號(hào)通路的精細(xì)調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)可調(diào)節(jié)絲狀真菌的菌絲體發(fā)育和次級(jí)代謝。在紅曲霉中,γ-丁內(nèi)酯可顯著影響生長(zhǎng)和菌絲形態(tài),促進(jìn)MPs和MK的合成[32]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明,γ-丁內(nèi)酯與細(xì)胞生長(zhǎng)、膜結(jié)構(gòu)和能量代謝等途徑密切相關(guān),表明γ-丁內(nèi)酯在紅曲霉生長(zhǎng)代謝中起QS分子的作用,并可能通過調(diào)節(jié)與細(xì)胞發(fā)育、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成和能量代謝相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),進(jìn)而影響紅曲霉的形態(tài)和次級(jí)代謝。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silence information regulator 2,Sir2)家族是一類保守的去乙?；傅鞍准易?廣泛存在于多種生物中,具有依賴NAD+的去乙酰化酶和ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性。Sir2在染色質(zhì)沉默、基因調(diào)控、代謝調(diào)節(jié)和細(xì)胞壽命調(diào)節(jié)等眾多生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。在紅曲霉中,缺失mrsir2(sir2同源基因)的菌株在生長(zhǎng)階段積累了更多組蛋白H3亞基的乙?；嚢彼釟埢?表明其主要針對(duì)生長(zhǎng)階段的H3亞基。此外,缺陷菌株菌絲過早老化,產(chǎn)生更多的孢子和次級(jí)代謝產(chǎn)物,并增強(qiáng)氧化應(yīng)激。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明,MrSir2主要調(diào)節(jié)大分子代謝(如碳水化合物、蛋白質(zhì)和核苷酸)中的基因表達(dá)以及編碼細(xì)胞壁合成和細(xì)胞膜成分的基因,表明MrSir2可能促進(jìn)從最初生長(zhǎng)階段到菌絲體衰老的代謝轉(zhuǎn)變[33]。

NADH-泛醌氧化還原酶核心亞基S8(NADH-ubiquinone oxidoreductase core subunit S8,NDUFS8)負(fù)責(zé)NADH氧化、泛醌還原和從線粒體中釋放質(zhì)子。紅曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成代謝與輔因子代謝密切相關(guān)。下調(diào)ndufs8表達(dá),影響菌體形態(tài)及次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成,還顯著地抑制呼吸復(fù)合物I、III及超氧化物歧化酶的酶活性,導(dǎo)致活性氧(ROS)水平升高和ATP濃度降低。轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)一步證實(shí)其參與呼吸鏈、三羧酸循環(huán)和脂肪酸降解等過程,同時(shí),MPs和Cit基因表達(dá)水平顯著提高。因此,證實(shí)呼吸復(fù)合物I通過改變細(xì)胞內(nèi)ROS和ATP水平,參與紅曲霉的細(xì)胞生長(zhǎng)和次級(jí)代謝等重要生命活動(dòng)[34]。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是紅曲霉代謝調(diào)控研究中使用最廣泛、最成功的組學(xué)技術(shù),在基因及基因簇校準(zhǔn)、代謝調(diào)控機(jī)制解析、調(diào)控因子的挖掘等方面發(fā)揮重要作用。此外,轉(zhuǎn)錄組學(xué)與其他組學(xué)的聯(lián)合使用,可以彌補(bǔ)單一組學(xué)的不足,并通過交互作用實(shí)現(xiàn)更精確地預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄表達(dá)結(jié)果,從而全面地解釋生物學(xué)問題。

2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)

2.3.1關(guān)鍵酶等蛋白功能分析

蛋白質(zhì)是體現(xiàn)生物學(xué)功能的最終載體,并且,作為調(diào)節(jié)因子的蛋白質(zhì)在微生物生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)控等過程中發(fā)揮著重要作用。蛋白質(zhì)組學(xué)的運(yùn)用為解析蛋白質(zhì)間的互作關(guān)系、揭示代謝調(diào)控機(jī)制提供了有效方法。近年來,隨著雙向凝膠電泳、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MS)、串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析、數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用及分子生物學(xué)技術(shù)等的發(fā)展,為紅曲霉代謝調(diào)控中的蛋白質(zhì)分析和鑒定提供了有效手段,如MrflbA和Erg4蛋白功能的解析。mrflbA是一種G蛋白α-亞基的調(diào)節(jié)因子,其敲除后導(dǎo)致菌絲體自溶,MPs沉著減少,真菌毒素產(chǎn)量降低,抗氧化酶和幾丁質(zhì)酶活性升高。此外,mrflbA的缺失導(dǎo)致次級(jí)代謝產(chǎn)物(MPs和真菌毒素)的轉(zhuǎn)錄減少[35]。麥角甾醇合成酶(ERG4)基因Erg4的缺失降低了麥角甾醇濃度,并顯著提高了胞外MPs的產(chǎn)量。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明,ERG4缺陷菌株促進(jìn)了MPs的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),即細(xì)胞膜組分的轉(zhuǎn)變是促進(jìn)MPs跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的重要原因之一[36]。

2.3.2代謝途徑及代謝機(jī)制分析

為解析碳源調(diào)控紅曲霉代謝的作用機(jī)制,許多學(xué)者利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了深入研究,提出了一系列調(diào)控理論,豐富和完善了紅曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物的調(diào)控機(jī)制。大米粉是紅曲霉發(fā)酵常用的碳源,與乳糖相比,紅曲霉細(xì)胞生長(zhǎng)、紅色MPs的合成對(duì)大米粉缺乏的限制較為敏感。比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明,二者共有12種差異蛋白質(zhì),參與糖酵解、三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)、能量產(chǎn)生、蛋白質(zhì)折疊和肽生物合成等過程[37]。因此,推測(cè)來源于淀粉代謝的能量供應(yīng)或許是限制紅曲紅胺合成的原因。然而,目前由橙色MPs到紅色MPs的合成一般認(rèn)為是一個(gè)化學(xué)過程,環(huán)境中存在氨或者含氨基化合物可與MPs前體自主完成結(jié)合。因此,紅色MPs合成的減少,可能更多受制于前體物質(zhì)的合成。以可溶性淀粉和甘油分別作為碳源,其MPs產(chǎn)量差異顯著,比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明,差異蛋白包括核糖體蛋白、熱休克蛋白等9個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)[17]。乙醇對(duì)紅曲霉生長(zhǎng)和代謝調(diào)控的影響與支鏈氨基酸降解和乙醛脫氫酶表達(dá)水平有關(guān),同時(shí),熱休克反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)也被誘導(dǎo)。此外,乙醇處理可抑制聚酮合成代謝相關(guān)蛋白、脂肪酸合成酶、環(huán)氧化物水解酶和莽草酸代謝途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)[38]。這些結(jié)果表明,不同碳源對(duì)紅曲霉生長(zhǎng)和次級(jí)代謝的調(diào)控非常復(fù)雜,此外,MPs的合成調(diào)控與初級(jí)代謝中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平密切相關(guān)。

氮源方面,無機(jī)氮源硝酸鹽可促進(jìn)親水性黃色MPs合成,主要是影響非核糖體肽合成酶、氧化還原酶、葡糖淀粉酶、內(nèi)-1,4-β-羥化酶、O-乙?；呓z氨酸和異檸檬酸裂解酶等蛋白質(zhì)的表達(dá)[22]。同時(shí),細(xì)胞膜麥角甾醇生物合成和轉(zhuǎn)運(yùn)分泌相關(guān)途徑也被顯著調(diào)節(jié),以促進(jìn)MPs的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。氮源缺乏對(duì)紅色MPs合成的影響更大,氮源受限時(shí),紅色MPs合成被顯著抑制,參與代謝調(diào)控的蛋白涉及氨基酸生物合成、蛋白質(zhì)翻譯、抗氧化相關(guān)酶、糖酵解和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程。這表明,氮源受到限制將誘導(dǎo)代謝流從糖酵解轉(zhuǎn)換為TCA循環(huán),以維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài),并抑制用于紅色MPs生產(chǎn)的聚酮生物合成途徑[39]。當(dāng)細(xì)胞受到高濃度氮源脅迫時(shí),幾丁質(zhì)和糖蛋白的合成將受到限制,導(dǎo)致細(xì)胞壁完整性降低,從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。此時(shí),紅曲霉細(xì)胞開啟細(xì)胞保護(hù)機(jī)制,通過促進(jìn)海藻糖合成、谷胱甘肽/谷胱甘肽氧還蛋白系統(tǒng),維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài),減少細(xì)胞的損傷。同時(shí),與NADH脫氫酶相關(guān)的呼吸途徑被激活,以平衡物質(zhì)和能量代謝[40]。

相似的結(jié)論也出現(xiàn)在磷酸鹽缺乏的例子中,研究顯示,磷酸鹽的缺乏會(huì)抑制紅曲霉紅色MPs的產(chǎn)生,通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析、數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)以及相關(guān)蛋白質(zhì)鑒定等手段,發(fā)現(xiàn)磷酸鹽缺乏的限制涉及的蛋白主要在糖酵解、能量代謝以及其他初級(jí)代謝等過程中。在發(fā)酵過程中,磷缺乏可誘導(dǎo)醛脫氫酶和糖酵解相關(guān)酶的上調(diào)表達(dá),而葡萄糖胺:果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶和ADP-核糖基化因子1等代謝酶的表達(dá)則被抑制[41]。因此,在相對(duì)穩(wěn)定環(huán)境中,碳、氮、磷等營(yíng)養(yǎng)素可在一定程度上影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量,但在惡劣環(huán)境中,生存策略促使細(xì)胞重新進(jìn)行物質(zhì)和能量平衡,抑制代謝過程及生長(zhǎng)發(fā)育以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。

紅曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物的代謝調(diào)控機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜,蛋白質(zhì)組學(xué)的運(yùn)用促進(jìn)了越來越多的功能蛋白的挖掘和鑒定。同時(shí),蛋白質(zhì)組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等組學(xué)的聯(lián)合使用是當(dāng)前組學(xué)研究的有效手段,可以彌補(bǔ)單一蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不足。

2.4 代謝組學(xué)

2.4.1紅曲霉代謝產(chǎn)物解析

代謝組學(xué)的研究主要基于代謝產(chǎn)物譜的分析和差異代謝產(chǎn)物向代謝途徑的映射,即對(duì)影響代謝產(chǎn)物合成的代謝途徑進(jìn)行解析。通過色譜和質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)合使用,大量紅曲霉合成的代謝產(chǎn)物被檢測(cè)和驗(yàn)證。已知的紅曲霉代謝產(chǎn)物超過800種,含氨基酸和胺、有機(jī)酸、糖和糖醇[42]、酯類、烷類和聚酮化合物[43]、乙醇、綠原酸鹽、甘膽酸鹽[44]、維生素和輔酶及核苷酸[45]等。紅曲霉代謝產(chǎn)生的3類主要次級(jí)代謝產(chǎn)物MPs、MK和Cit都屬于聚酮類化合物,具有相同的合成前體(乙酰輔酶A和丙酰輔酶A)及類似的合成途徑。其中,MPs具有種類多樣的結(jié)構(gòu)類似物和衍生物,目前已知的MPs種類超過50種。此外,紅曲霉還可以代謝產(chǎn)生多糖[46]、γ-氨基丁酸、二甲苯酸、類黃酮、植物甾醇及不飽和脂肪酸等生物活性化合物[2]。

2.4.2紅曲霉代謝途徑解析

MPs的生產(chǎn)中往往伴隨著Cit的產(chǎn)生,為MPs在食品工業(yè)中的應(yīng)用帶來了風(fēng)險(xiǎn)。敲除Cit的BGC中基因pksCT[42]或添加外源誘導(dǎo)物(如染料木素)可以降低Cit的合成[44,47]。代謝組學(xué)分析表明,與Cit降低相關(guān)的差異代謝產(chǎn)物主要分布在氨基酸代謝途徑、糖酵解、丙酮酸合成及三羧酸循環(huán)等途徑。這些研究為MPs生產(chǎn)中Cit的代謝調(diào)控提供了重要依據(jù),但這些代謝途徑廣泛參與紅曲霉的生長(zhǎng)、發(fā)育等重要生命活動(dòng),使得平衡生長(zhǎng)和次級(jí)代謝控制變得復(fù)雜。在MPs生產(chǎn)中,直接敲除Cit的BGC似乎是更方便、經(jīng)濟(jì)的方式。

Zhang等[43]探究了谷氨酸對(duì)MK合成的影響,結(jié)合代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),差異代謝產(chǎn)物與TCA循環(huán)關(guān)系密切。進(jìn)一步通過外源添加檸檬酸(TCA循環(huán)中間產(chǎn)物)研究了其對(duì)MK合成的影響。這為MK生產(chǎn)中培養(yǎng)基優(yōu)化及MK高產(chǎn)菌株的代謝工程改造提供了參考。

Li等[48]探究了普洱茶提取物對(duì)MPs合成的影響,并對(duì)調(diào)控MPs合成機(jī)制進(jìn)行了解析。茶提取物可促進(jìn)MPs的合成,代謝組學(xué)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明,茶提取物對(duì)MPs的合成調(diào)控主要通過影響初級(jí)代謝途徑而實(shí)現(xiàn),并為次級(jí)代謝提供充足的能量和更多的生物合成前體。MPs是由紅色MPs、黃色MPs和橙色MPs組成的混合色素,如何提高單一MPs的產(chǎn)率也是業(yè)界關(guān)注的重要問題之一。Liu等[49]利用比較代謝組學(xué)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),黃色MPs生產(chǎn)中(氯化銨和蛋白胨作為氮源)的差異代謝產(chǎn)物與葡萄糖、乳酸及磷酸戊糖途徑密切相關(guān)。進(jìn)一步通過發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)證了這些標(biāo)記物和代謝途徑的作用,發(fā)現(xiàn)磷酸戊糖途徑作為“開關(guān)”在黃色MPs合成中發(fā)揮重要作用。然而,MPs合成調(diào)控是復(fù)雜多樣的。Huang等[45]在探究不同氮源與MPs合成類型的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn),在代謝水平上,紅色MPs合成與胞內(nèi)氨基酸含量密切相關(guān),而橙色和黃色MPs與核苷酸相關(guān)。此外,轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明,多個(gè)初級(jí)代謝途徑與紅色MPs的合成密切相關(guān),而橙色MPs與次級(jí)代謝途徑有關(guān),黃色MPs與其他代謝途徑的調(diào)節(jié)有關(guān)。這表明MPs的多樣性在代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平上受到聯(lián)合調(diào)節(jié),這使得單一MPs生產(chǎn)中的代謝調(diào)控變得困難。因此,在單一MPs生產(chǎn)中,得到MPs最大化產(chǎn)率/比例的目標(biāo)代謝產(chǎn)物是最理想的選擇。

3 總結(jié)與展望

微生物組學(xué)技術(shù)大大推動(dòng)了對(duì)紅曲霉研究的進(jìn)程,極大地拓展了人們對(duì)紅曲霉生長(zhǎng)發(fā)育、代謝產(chǎn)物合成及代謝調(diào)控的認(rèn)知。在紅曲霉中,基因組學(xué)主要用于探討紅曲霉的進(jìn)化地位分析、基因簇的預(yù)測(cè)和挖掘、同源基因的比對(duì)分析及代謝途徑分析等研究;利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究紅曲霉生長(zhǎng)和代謝過程中基因或基因簇的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析、環(huán)境適應(yīng)代謝機(jī)制以及新轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的預(yù)測(cè)和挖掘;蛋白質(zhì)組學(xué)主要涉及代謝過程中重要酶類的功能解析和總體的代謝調(diào)控機(jī)制的解析;而代謝組學(xué)則用于在代謝產(chǎn)物水平上闡述整體的代謝過程。

通過多年研究,已經(jīng)掌握了紅曲霉三類主要代謝產(chǎn)物MPs、MK和Cit的合成途徑,但紅曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物的代謝調(diào)控變化多樣,容易受環(huán)境因子的影響,因此,還需要深入研究各種環(huán)境因子(如碳氮源、光照、磁場(chǎng)等)對(duì)紅曲霉生長(zhǎng)發(fā)育和代謝產(chǎn)物合成的作用機(jī)制。MPs是組學(xué)研究中最熱門的主題之一,采用高通量測(cè)序等菌種選育技巧、培養(yǎng)基組分優(yōu)化、化學(xué)和物理調(diào)節(jié)及菌株的代謝改造等手段,圍繞高產(chǎn)MPs的調(diào)控、特定MPs組分的精細(xì)調(diào)節(jié)、胞外MPs的分泌調(diào)控及降低Cit的調(diào)控等方面,不斷發(fā)揮組學(xué)技術(shù)的作用,為MPs的高效、精準(zhǔn)、安全生產(chǎn)做出貢獻(xiàn)。

目前,在紅曲色素的研究中被廣泛采納的觀點(diǎn)是,MPs的合成與碳代謝和氨基酸代謝等代謝途徑密切相關(guān),因?yàn)镸Ps的從頭合成依賴于這些過程中提供的前體(乙酰-CoA和丙酰-CoA)和能量供應(yīng)。然而,由于不同MPs共享相同的從頭合成過程,豐富的前體和充足的能量并不能將不同MPs進(jìn)行精準(zhǔn)控制。以黃色MPs為例,盡管可以通過篩選黃色MPs突變株或細(xì)胞壁表面修飾促進(jìn)胞外黃色MPs的高效積累[50-51],但橙色MPs和黃色MPs分別由mppG和mppE兩個(gè)基因單獨(dú)調(diào)控合成[52],調(diào)節(jié)二者表達(dá)的分子開關(guān)尚未被證實(shí)。此外,胞外MPs的合成一定程度上受制于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁轉(zhuǎn)運(yùn)的限制,這些細(xì)胞屏障的解除可促進(jìn)MPs等代謝產(chǎn)物的分泌,提高胞外MPs的產(chǎn)量。但由于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜是細(xì)胞最外層的保護(hù)性結(jié)構(gòu),其對(duì)環(huán)境的刺激信號(hào)相對(duì)敏感。MAPK信號(hào)通路廣泛存在于真核生物中,作為對(duì)外界信號(hào)的適應(yīng)性反應(yīng),廣泛參與生物的代謝調(diào)控過程[53]。作為對(duì)不良環(huán)境的響應(yīng),紅曲霉也通過可觸發(fā)MAPK信號(hào)的傳導(dǎo)過程調(diào)控MPs的合成[23,25]。因此,MPs的合成可認(rèn)為是紅曲霉對(duì)環(huán)境適應(yīng)的一種自我保護(hù)措施。盡管已有研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析出紅曲霉存在MAPK信號(hào)調(diào)控過程,但其關(guān)鍵信號(hào)蛋白及受體調(diào)節(jié)因子還有待通過分子生物學(xué)手段進(jìn)一步鑒定,其參與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的精細(xì)調(diào)控過程還有待通過組學(xué)技術(shù)進(jìn)行解析和完善。

近年來,通過多組學(xué)的聯(lián)合使用來揭示紅曲霉代謝調(diào)控機(jī)制的研究趨勢(shì)更加明顯,也使得分析結(jié)果更加精準(zhǔn)可靠?？梢灶A(yù)期,微生物組學(xué)技術(shù)將在紅曲霉未來研究和代謝產(chǎn)物工業(yè)化生產(chǎn)中繼續(xù)發(fā)揮重要作用,推動(dòng)紅曲霉相關(guān)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。