李媛，李雪，陳真

(1.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211198；2.南京圣和藥業(yè)股份有限公司，江蘇 南京 210038)

細(xì)胞進(jìn)行各項生命活動依賴于復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，信號蛋白的磷酸化和去磷酸化是常見的翻譯后活性調(diào)節(jié)方式，分別由蛋白激酶和蛋白磷酸酶調(diào)控。真核生物中磷酸化位點常發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸上，其中蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)和蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase,PTP)共同調(diào)節(jié)胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸化水平，調(diào)控蛋白功能發(fā)生轉(zhuǎn)變，使信號向下傳遞[1]。

根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的全球癌癥2020年統(tǒng)計報告(GLOBOCAN 2020)推算可知[2]，新發(fā)癌癥約為1 930萬例，癌癥死亡人數(shù)近1 000萬例。傳統(tǒng)癌癥治療手段不僅給患者帶來極大的痛苦和不良反應(yīng)，而且無法達(dá)到比較滿意的治療效果。隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，科學(xué)家們認(rèn)識到可用藥物靶向腫瘤細(xì)胞上基因異?；蜻^表達(dá)的致癌分子，在不影響正常組織細(xì)胞的生命活動情況下，可實現(xiàn)優(yōu)于細(xì)胞毒性藥物的抗腫瘤效果，且不良反應(yīng)更小。目前已有多種激酶抑制劑被用于癌癥治療，例如第三代EGFR抑制劑奧希替尼、CDK4/6抑制劑帕博西尼、mTOR抑制劑依維莫司、BCR-ABL抑制劑伊馬替尼、ALK抑制劑艾樂替尼等。而靶向致癌蛋白磷酸酶則提供了另一種治療思路。含Src同源2結(jié)構(gòu)域蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)是PTP家族中第一個[3]報道的致癌蛋白，參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程，經(jīng)過20年的開發(fā)，目前已由催化位點抑制劑轉(zhuǎn)向變構(gòu)位點抑制劑，發(fā)揮“分子膠水”的作用，穩(wěn)定SHP2的閉合構(gòu)象。

1 SHP2蛋白結(jié)構(gòu)與功能

SHP2是一種由PTPN11基因編碼的胞內(nèi)非受體蛋白酪氨酸磷酸酶，其結(jié)構(gòu)包含兩個N端SH2結(jié)構(gòu)域(N-SH2和C-SH2)，以及C端具有催化功能的PTP結(jié)構(gòu)域和一個富含脯氨酸基序并帶有酪氨酸磷酸化位點(Tyr542和Tyr580)的C端尾巴[4]。X射線晶體衍射結(jié)果表明[5]，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，SHP2通過N-SH2與PTP結(jié)構(gòu)域相互作用阻礙其催化活性，使該磷酸酶處于自抑制構(gòu)象；當(dāng)存在細(xì)胞因子、生長因子等刺激時，酪氨酸磷酸化蛋白與SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，暴露PTP結(jié)構(gòu)域的催化活性位點，解除磷酸酶的自抑制狀態(tài)，激活SHP2。

SHP2介導(dǎo)多條信號通路，包括RTK/MAPK、PI3K/AKT、JAK/STAT、PD-L1/PD-1等[4,6-7]，參與機(jī)體正常發(fā)育[8]、心血管生成[9]和免疫應(yīng)答[10]，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、增殖、存活和凋亡等生理活動。SHP2還可通過調(diào)節(jié)谷氨酸受體的表達(dá)或功能參與突觸可塑性、學(xué)習(xí)和記憶過程，其功能喪失型突變(loss of function,LOF)會導(dǎo)致豹綜合征(LEOPARD syndrome,LS)，而獲得型突變(gain of function,GOF)會引發(fā)努南綜合征(Noonan syndrome,NS)，兩綜合征具有發(fā)育遲緩和學(xué)習(xí)困難的重疊癥狀[11-12]。除此之外，SHP2的異常還與腫瘤密切相關(guān)，其突變在腫瘤中發(fā)生頻率較低，但常常因基因過度表達(dá)[13-15]或被異常激活使信號通路增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16]。

2 SHP2在腫瘤靶向治療中的價值

2.1 SHP2在多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用 已有研究證實[17]，PTPN11是白血病、肺癌和乳腺癌的癌基因，為了研究該基因在黑色素瘤中的作用，Hill等[17]利用PTEN和CDKN2A缺失驅(qū)動的小鼠黑色素瘤模型發(fā)現(xiàn)PTPN11在黑色素瘤中被激活，并通過促進(jìn)非錨定集落形成和腫瘤生長產(chǎn)生促癌作用。另有研究顯示[18]SHP2在宮頸癌中表達(dá)上調(diào)，一方面，在Hela和SiHa細(xì)胞中敲除SHP2，細(xì)胞生長和遷移受到抑制，對順鉑的敏感性增加；另一方面，SHP2過表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高HPV DNA有關(guān)，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。Yang等[19]在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中導(dǎo)入突變體SHP2 E76K，該激活突變體在體外增強(qiáng)了細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，在異種移植模型上產(chǎn)生促癌作用。上述研究均可證明SHP2自身的過度激活(如表達(dá)上調(diào)或功能獲得型突變)可促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展。

受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)過度激活將直接導(dǎo)致下游多條信號通路過強(qiáng)，驅(qū)動癌癥發(fā)生發(fā)展，而 SHP2是連接RTK和下游多條信號通路的關(guān)鍵節(jié)點，是致癌途徑的必經(jīng)之處，抑制SHP2可產(chǎn)生明顯的抗腫瘤效果[20-22]。PDGFRα信號激活的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤由于化療耐藥和血腦屏障，治療極具挑戰(zhàn)性，SHP2變構(gòu)抑制劑SHP099能抑制PDGFR下游效應(yīng)因子JUN，減弱細(xì)胞周期進(jìn)程，與神經(jīng)祖細(xì)胞相比，SHP099在體外優(yōu)先抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的存活和自我更新，在體內(nèi)展示了顯著的生存獲益[20]。Zhao等[21]對ErbB2轉(zhuǎn)基因小鼠條件性敲除SHP2，并抑制HER2擴(kuò)增乳腺癌細(xì)胞株的SHP2，在兩種乳腺癌模型上的研究結(jié)果均表明，SHP2是ErbB2誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生、腫瘤組織發(fā)育所必需的，條件性敲除SHP2可阻斷ErbB2過表達(dá)、誘導(dǎo)正常細(xì)胞表型、抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。表達(dá)受體酪氨酸激酶FLT3-ITD突變并且?guī)в蠨NA甲基化調(diào)節(jié)因子TET2或DNMT3A功能缺失突變的急性髓細(xì)胞白血病小鼠模型概括了人類白血病的基本特征，SHP099可抑制白血病細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其分化，下調(diào)癌基因Myc信號，使白血病細(xì)胞中與細(xì)胞增殖和自我更新相關(guān)的基因表達(dá)程序正?；痆22]。

2.2 SHP2參與腫瘤耐藥 骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的保護(hù)作用使B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)對化療耐藥，研究發(fā)現(xiàn)，PTPN11在初診和復(fù)發(fā)的B-ALL的BMSCs中高表達(dá)，使用質(zhì)粒誘導(dǎo)BMSCs中SHP2激活，顯著增加了其介導(dǎo)的CCRF-SB細(xì)胞對長春新堿的耐藥，實驗結(jié)果顯示SHP2通過PI3K/AKT通路上調(diào)血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)，其與黏附分子VLA-4的相互作用誘導(dǎo)黏附效應(yīng)，進(jìn)而造成化療耐藥[23]。

大多數(shù)接受TKI治療的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者常發(fā)生耐藥，最終經(jīng)歷疾病進(jìn)展，獲得型耐藥是臨床主要挑戰(zhàn)，其機(jī)制依賴于EGFR突變或是不依賴EGFR的旁路激活，而無論哪一耐藥機(jī)制最后仍需通過中介信號分子SHP2向下傳遞至RAS/MAPK通路。最近報道的SHP2抑制劑IACS-13909(13)已證實其在奧希替尼耐藥模型的治療價值，包括通過CRISPR-cas9技術(shù)引入EGFR C797S突變的EGFR L858R/T790M/C797S NCI-H1975細(xì)胞，該模型對奧希替尼敏感度下降，以及含EGFR ex19del 的HCC4006-奧希替尼耐藥細(xì)胞模型，該模型經(jīng)驗證未產(chǎn)生耐藥突變，研究顯示聯(lián)用可以延緩耐藥的發(fā)生，增加對奧希替尼的敏感度[24]。

在RAS/MAPK信號通路依賴腫瘤中，用RAF和MEK抑制劑阻斷該信號往往引起RTK的重新激活和ERK信號的反彈，引起腫瘤對藥物的適應(yīng)性抵抗，而SHP2介導(dǎo)了這一負(fù)反饋[25-26]。RAF常發(fā)生V600E突變，突變后激酶活性增加500倍，導(dǎo)致下游MEK-ERK 信號通路持續(xù)激活。單獨使用其特異性抑制劑維羅非尼往往出現(xiàn)耐藥性，Putlyaeva等[25]以高表達(dá)BRAF V600E的甲狀腺濾泡上皮為模型，研究維羅非尼治療后應(yīng)用siRNA介導(dǎo)PTPN11表達(dá)下調(diào)，結(jié)果顯示，一方面參與腫瘤耐藥性形成的CCNA1和NOTCH4基因表達(dá)下調(diào)，另一方面，參與細(xì)胞周期調(diào)控的基因如p21、p15、p16、rb1和IGFBP7的轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)。MEK位于ERK上游，其抑制劑曲美替尼因可負(fù)反饋上調(diào)p-SHP2，導(dǎo)致快速產(chǎn)生耐藥性因而作為單藥的應(yīng)用受到限制，而SHP2抑制劑SHP099阻止耐藥產(chǎn)生的作用在多種癌癥包括KRAS突變和野生型RAS的腫瘤中得到證實，因此與MEK抑制劑聯(lián)用可成為防止對激酶抑制劑耐藥的廣泛的治療策略[26]。

2.3 SHP2參與免疫抑制信號 SHP2在多種免疫細(xì)胞中均有表達(dá)，主要參與抑制性受體(inhibitory receptors,IRs)下游信號通路，介導(dǎo)免疫抑制[27]。在T細(xì)胞中[28]，SHP2通過SH2結(jié)構(gòu)域與程序性細(xì)胞死亡-1(PD-1)二聚體上的兩個pITSM-Y248殘基相互作用，誘導(dǎo)酶的激活，進(jìn)而促進(jìn)T細(xì)胞受體(TCR)信號復(fù)合物中ZAP70激酶在PD-1胞漿尾SHP2募集后的去磷酸化作用，同時介導(dǎo)CD28信號失活，從而使T細(xì)胞增殖、分化受到抑制，干擾素(IFN)產(chǎn)生減少，抗腫瘤免疫功能下降。在巨噬細(xì)胞中[27]，SHP2在巨噬細(xì)胞集落刺激因子-1(CSF-1)刺激下與其誘導(dǎo)的信號蛋白復(fù)合物Grb2/Gab1結(jié)合，激活RAS-ERK通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖和M2型極化。當(dāng)巨噬細(xì)胞表面的銜接蛋白SIRPα與其配體CD47結(jié)合后，為SHP2的去磷酸化招募特異性底物，以抑制細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和減少巨噬細(xì)胞的吞噬作用，幫助腫瘤逃避宿主免疫監(jiān)視。NK細(xì)胞[27]表面的IRs也可以通過ITIM基序招募和激活SHP2，產(chǎn)生免疫抑制作用。

為驗證抑制SHP2在體內(nèi)能產(chǎn)生抗腫瘤免疫作用，研究人員用對SHP099不敏感的CT-26結(jié)腸癌細(xì)胞分別在裸鼠和免疫系統(tǒng)完整的小鼠體內(nèi)建立異種移植模型，實驗結(jié)果顯示SHP099對裸鼠的腫瘤生長影響最小，而在免疫完整小鼠體內(nèi)CD8+IFN-γ+T細(xì)胞增加，顆粒酶B和穿孔素等細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，降低腫瘤負(fù)荷，且在SHP2條件性敲除T細(xì)胞的小鼠體內(nèi)腫瘤生長明顯減慢，證實了SHP099與PD-1阻斷可發(fā)揮相輔相成的作用[29]。80%的晚期NSCLC患者常因內(nèi)在或獲得性抵抗對單獨給予免疫檢查點抑制劑不響應(yīng)，然而，在SHP2抑制劑和PD-L1抗體聯(lián)合XRT放射線治療抗PD-1耐藥的344SQ NSCLC的129Sv/Ev小鼠研究中，顯示出良好的系統(tǒng)性抗腫瘤效應(yīng)，增強(qiáng)局部和遠(yuǎn)處反應(yīng)，減少肺轉(zhuǎn)移，提高小鼠生存率，這是因為XRT增加了遠(yuǎn)處腫瘤SHP2+M1 TAMs，SHP099的使用與高M(jìn)1/M2比例、CD8+T細(xì)胞增加、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞降低有關(guān)[30]。此外，目前利用巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境免疫主要存在兩大困難，一是癌細(xì)胞分泌的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MCSF)與巨噬細(xì)胞上的受體CSF-1R結(jié)合，可誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)向免疫抑制的M2表型分化；二是癌細(xì)胞過表達(dá)的跨膜蛋白CD47與髓系細(xì)胞上的信號調(diào)節(jié)蛋白SIRPα連接后，激活胞內(nèi)SHP1和SHP2，進(jìn)而激活“eat-me-not”信號通路，吞噬功能受到抑制。Ramesh等[31]設(shè)計并合成了一種裝載CSF-1R和SHP2抑制劑的納米粒靶向M2型巨噬細(xì)胞，體外結(jié)果顯示M1復(fù)極化和吞噬功能增強(qiáng)，在體內(nèi)高侵襲性4T1乳腺癌模型和B16F10黑色素瘤模型上，與單藥相比次優(yōu)劑量給藥效果更佳且沒有毒性，提示SHP2抑制劑與靶向免疫系統(tǒng)藥物聯(lián)用是一種有前景的治療策略。

總的來說，SHP2的異常活化在大多數(shù)腫瘤中具有促癌作用，作為RTK的下游信號分子傳導(dǎo)多條致癌通路，參與耐藥和免疫逃逸的發(fā)生，是治療惡性腫瘤有前景的靶點，并且也是當(dāng)前的研發(fā)熱點。十余年的研究旨在發(fā)現(xiàn)可成藥的SHP2抑制劑，抑制腫瘤進(jìn)展、延緩耐藥出現(xiàn)、增強(qiáng)腫瘤免疫應(yīng)答。

3 SHP2變構(gòu)抑制劑的開發(fā)進(jìn)展

近20年的研究確定了SHP2在胚胎發(fā)育和致癌中的作用，但沒有同時具有有效性、成藥性、特異性的SHP2抑制劑走上臨床。2016年之前的第一代抑制劑占據(jù)PTP催化口袋，阻止底物去磷酸化，盡管活性最優(yōu)可低至0.2 μmol·L-1，但由于催化位點帶正電荷的極性環(huán)境，抑制劑帶負(fù)電荷才能有足夠的親和力結(jié)合并抑制其活性，這勢必導(dǎo)致化合物細(xì)胞透膜性差、口服生物利用度低[32]。且PTP之間催化域的高度同源性，特別是與SHP1，這導(dǎo)致第一代抑制劑選擇性差，無法特異性靶向SHP2[33]。隨著2016年諾華發(fā)現(xiàn)SHP2的“隧道狀”變構(gòu)位點，抑制變構(gòu)磷酸酶SHP2轉(zhuǎn)向了一個全新的方向，且獲得審批進(jìn)入臨床試驗階段的SHP2變構(gòu)抑制劑越來越多。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3個變構(gòu)位點可穩(wěn)定SHP2的閉合構(gòu)象，隧道樣位點位于C-SH2、N-SH2和PTP結(jié)構(gòu)域的表面，門閂樣和溝槽樣位點分別位于N-SH2和PTP結(jié)構(gòu)域表面的兩側(cè)[34]。本文重點介紹了近5年文獻(xiàn)中報道的SHP2變構(gòu)抑制劑。

3.1 諾華SHP2變構(gòu)抑制劑及其衍生物 2016年諾華[33]首次報道了通過高通量篩選和X射線晶體學(xué)識別到的突破性化合物——作用于SHP2變構(gòu)結(jié)合口袋的SHP836，經(jīng)結(jié)構(gòu)優(yōu)化后確定SHP099(1)是一種可同時滿足有效性、特異性、生物利用度良好的SHP2抑制劑(酶抑制活性IC50=0.07 μmol·L-1)，其與隧道樣變構(gòu)位點結(jié)合，穩(wěn)定SHP2自抑制構(gòu)象進(jìn)而使催化位點處于持續(xù)封閉狀態(tài)。該化合物的細(xì)胞增殖抑制活性、溶解度、選擇性、藥代動力學(xué)性質(zhì)及體內(nèi)藥效等性質(zhì)良好，使其成為一個較優(yōu)的工具化合物來研究SHP2在生理病理中的作用，亦可進(jìn)一步優(yōu)化產(chǎn)生更優(yōu)化合物。2018年該研究團(tuán)隊[35]利用可干擾SHP099結(jié)合的工程雙突變SHP2 T253M/Q257L細(xì)胞株進(jìn)行了新的篩選，發(fā)現(xiàn)了第二種變構(gòu)抑制劑SHP244(2)，該變構(gòu)結(jié)合位點不同于SHP099的隧道狀位點，而是位于N-SH2和PTP表面的裂隙。SHP244(2)是SHP2弱抑制劑，酶抑制活性IC50=60 μmol·L-1，水溶性差(在pH 6.8緩沖液中為0.047 mmol·L-1)，親脂性高(clog P=3.9)。基于結(jié)構(gòu)設(shè)計優(yōu)化后，酶抑制活性、水溶性及熱穩(wěn)定性等均有提高，但其活性仍低于SHP099。X射線晶體結(jié)構(gòu)驗證了該變構(gòu)位點抑制劑并未干擾SHP099的結(jié)合，因此聯(lián)合應(yīng)用兩個變構(gòu)位點抑制劑能夠增強(qiáng)細(xì)胞的通路抑制，證明雙變構(gòu)抑制是可能的。

2019年[35]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了多個5,6融合雙環(huán)支架，占據(jù)同樣的隧道樣變構(gòu)位點，經(jīng)過結(jié)構(gòu)變形和優(yōu)化后識別到吡唑嘧啶類代表化合物SHP389(3)及14(4)衍生物。其抑制活性均在亞微摩爾級別，同時對30個GPCRs、離子通道、核受體、轉(zhuǎn)運體、酶和激酶的IC50>30 μmol·L-1。SHP389(3)對hERG有微弱的抑制作用，詳細(xì)的Q-Patch表明其不參與功能性hERG相互作用。但由于滲透性和暴露量差，不能進(jìn)一步評價其體內(nèi)藥效。14(4)雖具有明顯的心臟毒性(IC50=0.29 μmol·L-1)，但表現(xiàn)出良好的PKPD相關(guān)性。緊接著，該研究團(tuán)隊[36]發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)更多樣的SHP2變構(gòu)抑制劑，將上述融合雙環(huán)變形為新穎的單環(huán)嘧啶酮支架，發(fā)現(xiàn)6-氨基3-甲基嘧啶類化合物SHP394(5)為強(qiáng)效、選擇性和口服有效的SHP2抑制劑，具有良好的物理化學(xué)和ADME特性。但滲透性差，Caco-2細(xì)胞通透性[Papp(A-B)1.02×10-6cm·s-1]較低，明顯外排(B-A/A-B=15)，這可能解釋了其藥代動力學(xué)研究中中度口服暴露量和較低生物利用度(F=29%)，因此需進(jìn)一步優(yōu)化提高其藥代動力學(xué)性質(zhì)。

TNO155(6)是諾華[37]也是世界上第一個走上臨床的SHP2變構(gòu)抑制劑，目前與EGFR-TKI藥物、CDK4/6抑制劑、KRAS G12C抑制劑、免疫療法聯(lián)合使用評估其臨床效果。TNO155(6)抑制酶(IC50=0.011 μmol·L-1)、p-ERK細(xì)胞信號通路(IC50=0.011 μmol·L-1)及細(xì)胞增殖(IC50=0.1 μmol·L-1)的活性達(dá)到有史以來最低，BCS I類性質(zhì)使其生物利用度達(dá)到100%，小鼠異種移植瘤模型中10 mg·kg-1即具有明顯抑瘤效果。在評估的4個臨床前物種中，均能觀察到中低清除率、較早到達(dá)Tmax(0.8～2 h)、中度血漿蛋白結(jié)合率(61%～81%)，與體外微粒體和肝細(xì)胞觀察到的低清除率及物理化學(xué)性質(zhì)相符。低濃度時TN0155(6)不抑制CYP3A4、2D6或2C9，因此聯(lián)合使用其他藥物時發(fā)生藥物-藥物相互作用的風(fēng)險最小。

在諾華報道的有效化合物基礎(chǔ)上，研究人員展開了更進(jìn)一步的研究?；赟HP836發(fā)現(xiàn)的compound 1(7)[38]抑制SHP2活性的IC50值為9.97 μmol·L-1，對BaF3細(xì)胞的IC50值為10.73 μmol·L-1。熒光滴定實驗證實其與SHP2直接結(jié)合，分子動力學(xué)模擬研究顯示其對SHP2的親和力明顯高于SHP1，與SHP836相比，不僅具有相似的抑制作用，而且與SHP2結(jié)合后能形成更加穩(wěn)定的構(gòu)象。癌癥相關(guān)的SHP2突變大多位于N-SH2：PTP結(jié)構(gòu)域界面[39]，E76、A72、D61/G60和E69是N-SH2結(jié)構(gòu)域中突變最頻繁的氨基酸殘基。為探究SHP099 是否抑制SHP2突變體，研究人員在用TF-1人白血病細(xì)胞構(gòu)建的4種常見突變(p.D61Y、p.E69K、p.A72V和p.E76K)細(xì)胞中，SHP099能有效抑制TF-1 SHP2 E69K細(xì)胞的生長，IC50為(1.46±0.46)μmol·L-1，降低了p-ERK1/2和抗凋亡蛋白BCL-XL，并誘導(dǎo)DNA修復(fù)酶PARP裂解。在SHP099(1)的基礎(chǔ)上[40]，采用支架跳變的方法設(shè)計新型SHP2抑制劑，11a(8)是吡啶類系列衍生物中最有效、最具選擇性的SHP2抑制劑，其直接與SHP2蛋白結(jié)合，體外酶活I(lǐng)C50為1.36 μmol·L-1，對SHP1的活性超過100 μmol·L-1，抑制Ba/F3細(xì)胞IC50為2.35 μmol·L-1。ADMET預(yù)測分析證實其具有良好的類藥性質(zhì)。具體見圖1。

圖1 諾華SHP2變構(gòu)抑制劑及其衍生物

3.2 其他SHP2變構(gòu)抑制劑 SHP2 E76位于N-SH2:PTP橋接處，突變之后自抑制構(gòu)象不穩(wěn)定，用GOF SHP2 E76A建立的新的篩選策略鑒定了含2-氨基噻唑支架的化合物23(9)，與隧道樣變構(gòu)位點結(jié)合，對SHP2 E76A的IC50為0.7 μmol·L-1，對其他PTP具有至少30倍選擇性優(yōu)勢，而(1)對SHP2 E76A的IC50更低(0.12 μmol·L-1)。23(9)不僅抑制GOF SHP2 N58S NCI-H661細(xì)胞、EGFR T790M H1975細(xì)胞、FLT3-ITD突變的白血病細(xì)胞系如MV4;11和MOLM-13增殖，還能拮抗YAP轉(zhuǎn)錄活性，提示YAP活性受SHP2 PTP催化功能調(diào)節(jié)。23(9)在小鼠上具有可接受的藥代動力學(xué)特性和體內(nèi)藥效[41]。

研究人員利用高通量篩選(HTS)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了苯并噻唑嘧啶支架，可同時結(jié)合C-SH2和PTP結(jié)構(gòu)域來變構(gòu)抑制致癌磷酸酶。優(yōu)化后得到的類似物2(10)是一種具有選擇性的競爭性變構(gòu)抑制劑，該化合物既不干擾SHP2 PTP結(jié)構(gòu)域活性，也不干擾SHP2的F285S、T253M、Q257L突變，該變異體包含兩個在變構(gòu)位點上的突變，使得在空間上阻止化合物進(jìn)入SHP2。但是對急性髓系白血病細(xì)胞MOLM-14的活性很差(IC50=85±8 μmol·L-1)[42]。多肽化合物具有易于修飾和快速合成，無毒性，且比重組抗體免疫原性低的特點。盡管存在溶解性差、膜通透性差等缺點，但仍有明顯的優(yōu)勢，如作用效高、靶選擇性好、在組織中的積累少等。例如二肽化合物Phe-Asp(11)可在微摩級別(IC50=5.2±0.4 μmol·L-1)抑制SHP2，對PTP1B有10倍的選擇性，5 μmol·L-1顯著降低MCF7細(xì)胞活力[43]。

位于SHP2 C-SH2和PTP表面的位點與同源SHP1相比表現(xiàn)出特定的特征，假設(shè)與該位點結(jié)合的化合物可能會加強(qiáng)C-SH2和PTP結(jié)構(gòu)域的連接，穩(wěn)定SHP2封閉的自抑制構(gòu)象，以此通過計算機(jī)輔助藥物設(shè)計(CADD)篩選虛擬化合物數(shù)據(jù)庫，在10個候選化合物中LY6(12)活性最優(yōu)，SHP2活性抑制IC50為9.8 μmol·L-1，而對SHP1的IC50為72 μmol·L-1。LY6(12)對PTPN11條件敲除(PTPN11fl/fl/Ade-Cre+)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)不敏感，證實了SHP2是該化合物的主要靶標(biāo)。攜帶SHP2激活突變的腫瘤細(xì)胞比WT細(xì)胞對LY6(12)更敏感(例如SHP2 E76K突變體IC50值為7.67 μmol·L-1)。SHP2激活突變相關(guān)的青少年粒單細(xì)胞白血病(JMML)對粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-3表現(xiàn)出超敏反應(yīng)，Ba/F3細(xì)胞被IL-3刺激后，ERK、AKT、JAK2和STAT5的活化被LY6(12)抑制[44]。

IACS-13909(13)是SHP2直接的變構(gòu)抑制劑，酶活性抑制IC50=15.7 nmol·L-1，具有高度選擇性，對PTP結(jié)構(gòu)域IC50大于50 μmol·L-1。X射線晶體結(jié)構(gòu)顯示SHP2變構(gòu)結(jié)合袋的Pro491與IACS-13909(13)的吡唑吡嗪環(huán)相連，該位點突變會阻止化合物結(jié)合，SHP2 P491Q過表達(dá)則顯著降低了IACS-13909(13)的敏感性。IACS-13909(13)能有效抑制RTK基因改變及對TKI或RTK sh RNA敏感的細(xì)胞株，但對BRAF V600突變細(xì)胞系及大多數(shù)KRAS突變細(xì)胞系不敏感，不能抑制其p-ERK或p-MEK。目前IACS-13909(13)的衍生物IACS-15509正在臨床上進(jìn)行評估[24]。

PCC0208023(14)可以非競爭性地抑制全長SHP2酶的活性(IC50=2.10 nmol·L-1)，其活性優(yōu)于RMC-4550兩倍，但對SHP2的自由催化結(jié)構(gòu)域缺乏活性，這與變構(gòu)模式的抑制一致。在4種KRAS驅(qū)動的結(jié)直腸癌細(xì)胞(LS180、HCT116、SW1463、SW837)中，PCC0208023(14)的抑制作用同樣優(yōu)于RMC-4550。其在LS180腫瘤給藥24 h后仍保持高水平，組織上主要分布于腸道和肺部，且與RMC-4550暴露量相似，在HCT116模型30 mg·kg-1劑量下，二者均能顯著抑制腫瘤重量、推遲腫瘤生長，免疫組化顯示Ki67和p-ERK水平降低，腫瘤中cleaved caspase-3表達(dá)增加，凋亡增加，但是都產(chǎn)生了明顯的體重下降[45]。

為了鑒定新的具有潛在抗癌活性的SHP2抑制劑，研究人員以DiFMUP為底物篩選了658種天然產(chǎn)物，重樓皂苷D(15)是從傳統(tǒng)藥用植物重樓中分離，可選擇性地變構(gòu)抑制SHP2，酶抑制活性為15.3 μmol·L-1。據(jù)報道，重樓皂苷D(15)可誘導(dǎo)線粒體跨膜電位去極化，導(dǎo)致H2O2生成、細(xì)胞色素C釋放和凋亡誘導(dǎo)因子的產(chǎn)生。與外周血單個核細(xì)胞(PBMC)相比，SHP2在人白血病中過表達(dá)，特別在Jurkat細(xì)胞中表達(dá)水平最高，細(xì)胞抑制活性為2.8 μmol·L-1，降低胞內(nèi)p-ERK水平，增加裂解PARP水平，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡死亡[46]。具體見圖2。

圖2 其他SHP2變構(gòu)抑制劑

諾華的TNO-155，加科思的JAB-3068、JAB-3312，Revolution Medicines的RMC-4630以及Hoffmann-La Roche的RLY-1971屬于早期走進(jìn)臨床試驗的SHP2變構(gòu)抑制劑[47]，目前均處于1/2期招募狀態(tài)，以單獨用藥或聯(lián)合EGFR突變抑制劑奧希替尼、納扎替尼，MEK1抑制劑考比替尼，KRAS G12C抑制劑JDQ443、阿達(dá)格拉西布，PD-1抗體Spartalizumab，CDK4/6抑制劑瑞博西尼，及ERK1/2抑制劑LY3214996，在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等復(fù)發(fā)、難治、轉(zhuǎn)移性實體瘤中評價安全性。近兩年，Navire Pharma的BBP-398(IACS-15509)、Erasca的ERAS-601、南京圣和藥業(yè)的SH3809、奕拓醫(yī)藥的ET0038及輝瑞的PF-07284892也相繼被開發(fā)進(jìn)入臨床試驗。同時多個候選化合物目前處于臨床前研究階段，包括BT-102、SNG-201、ICP-189、HBI-2376。

4 總結(jié)與展望

盡管SHP2變構(gòu)抑制劑的發(fā)現(xiàn)克服了催化位點抑制劑的缺點，但變構(gòu)位點上的突變(例如D61、E76、A72)卻產(chǎn)生了類似耐藥的結(jié)果[48]。近年來發(fā)展起來的特異性敲除相關(guān)蛋白的化學(xué)工具—蛋白水解靶向嵌合體(proteolysis-targeting chimeras,PROTACs)可能是應(yīng)對SHP2變構(gòu)位點突變體的一種可選擇方式。一般來說，PROTACs是雙功能分子，包括與靶蛋白結(jié)合的配體和與E3泛素連接酶結(jié)合的配體，這兩個配體通過一個連接子共價連接，從而召集E3連接酶誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白的泛素化和隨后的降解[49]。基于此原理設(shè)計的化合物SP4在納摩爾級別有效抑制Hela細(xì)胞生長，其活性是SHP099的100倍，降解胞內(nèi)SHP2蛋白水平，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，展示了誘導(dǎo)SHP2蛋白降解的優(yōu)勢[49]。另外，針對SHP2的廣泛分布和底物的多樣性，考察SHP2抑制劑的副作用和毒性尤為重要，利用靶向藥物遞送制劑例如納米制劑來規(guī)避其對正常組織的影響，可能是一種行之有效的方式。

本文概述了近些年SHP2在腫瘤中的研究進(jìn)展，總結(jié)了其抑制劑特別是變構(gòu)抑制劑的發(fā)展概況，本文將有助于藥物開發(fā)學(xué)者認(rèn)識該靶點現(xiàn)況及技術(shù)攻關(guān)難題，研發(fā)具有市場前景的藥物，未來理想的靶向腫瘤細(xì)胞、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞及腫瘤血管[50]的SHP2變構(gòu)抑制劑將會聯(lián)合多種科學(xué)技術(shù)實現(xiàn)精準(zhǔn)治療。